Evaluación de Ácidos nucleicos

Alumna: Melisa Carllinni Colombo L.U.: 363/18

En las últimas décadas, cambios en las conductas de alimentación a escala global han llevado a una alteración en
las proporciones de macronutrientes ingeridas por poblaciones humanas de entornos socioculturales muy variados. Una
de las caracterı́sticas de este proceso es la masificación de alimentos ricos en grasas y carbohidratos, combinados con
saborizantes y aditivos que los hacen más atractivos al gusto. Además, han aumentado significativamente las tasas de
obesidad y de obesidad infantil [7] en todo el mundo. Varios estudios correlacionan ambos fenómenos, y se investiga
activamente en los efectos de este nuevo tipo de malnutrición (por exceso más que por defecto) en la salud humana, ya
que hay evidencia creciente de que constituye una amenaza.
El efecto de una dieta desbalanceada, con alta proporción de carbohidratos y grasas respecto de proteı́nas, ha sido
estudiado como factor relevante entre las causas de la obesidad tanto en ratas ([4]) como en humanos ([5]). Se sabe que el
sistema dopaminérgico, vinculado a la satisfacción por la ingesta (entre otros fenómenos), se ve afectado a consecuencia
de este tipo de dietas. Se han registrado incrementos en la biosı́ntesis de dopamina (2-(3,4-dihidroxifenil)-etilamina) en
determinadas áreas del cerebro: en el hipotálamo, asociado al control homeostático de la ingesta y en el circuito central
de recompensa (formado por el área ventral tegmental, el núcleo accumbens y el córtex prefrontal), a la vez que mayor
insensibilidad a este neurotransmisor. Esas observaciones indican que a raı́z de una ingesta excesiva de carbohidratos y
grasas, el organismo disminuye su capacidad de registrar la saciedad y por lo tanto tiende a aumentar la cantidad y el
tamaño de sus comidas, lo cual puede derivar en obesidad. Se sabe también que hay mecanismos epigenéticos asociados
a esta regulación, en base a estudios sobre la cromatina y la expresión génica de los individuos con dietas desbalanceadas.
Resulta de interés determinar si estas marcas epigenéticas son heredables. Es decir, si la descendencia de madres que
tengan una dieta con alta proporción de carbohidratos y grasas manifestará los efectos observados en la generación previa.
Si existiera este “condicionamiento” se espera que esos hijos tenga baja capacidad de regular su ingesta de nutrientes por
una percepción atenuada de la saciedad, y por lo tanto sea mayor su tendencia a desarrollar obesidad, aún sin ser expuestos
a la dieta desbalanceada.
Se estudia el fenómeno en ratas, ya que varios trabajos previos en ratas y en humanos han llegado a resultados
coherentes respecto de mecanismos fisiológicos similares. Se trabaja en primer lugar con la primera generación (G1).
Esta incluye un grupo de ratas hembras que recibirán una dieta con alta proporción de carbohidratos y grasas (G1E) y un
grupo de ratas hembra de edades y caracterı́sticas fisiológicas iniciales equivalentes que recibirán una dieta balanceada
de acuerdo a sus requerimientos de energı́a y nutrientes, funcionando como control (G1C). Se estudiará el efecto de
esta alimentación diferencial cada 3 semanas, registrando los parámetros fisiológicos de las ratas que se toman como
indicadores de obesidad: ı́ndice de masa corporal y circunferencia abdominal. También se registra la conducta alimentaria
cuantificando la cantidad de alimento ingerido (normalizado por peso), siendo que las ratas de ambos grupos tienen acceso
irrestricto a su respectivo alimento. Por último, se mide la concentración de dopamina in vivo en las regiones del cerebro
estudiadas, según descripto ([1]).
Pasados 12 meses, se procede al análisis del sistema dopaminérgico, para buscar correlaciones entre su funciona-
miento y el grado de obesidad en cada individuo que confirmen los hallazgos de otros estudios relacionados. Se sabe que
esta relación está mediada por las modificaciones epigenéticas de ciertos genes involucrados en la vı́a de acción de la
dopamina, tanto en regiones codificantes como en regiones promotoras de la secuencia, como se ve en la tabla 1:

Gen afectado Función que regula Efecto medido asociado a obesidad

Enzima que cataliza la biosı́ntesis de dopamina a partir
DDC Disminución de la metilación
de su precursor L-DOPA (L-3,4 dihidroxifenilalanina)
SLC18A1 Transportador de dopamina fuera de las neuronas Disminución de la metilación
Receptor de dopamina sobre la superficie de neuronas
DRD5 Aumento de la metilación
que activa el sistema de respuesta
Transportador de dopamina hacia dentro de las neuronas
SLC6A3 Aumento de la metilación
(reuptake vinculado a la regulación de la vı́a)

Cuadro 1: Genes vinculados a la vı́a de la dopamina que presentan modificaciones epigenéticas vinculadas a la obesidad.

Se toman muestras de ADN y de ARN del hipotálamo de las ratas, según los procedimientos reportados. Por un lado,
se determina el grado de metilación de los genes mencionados en la tabla 1. Para ello, se emplea la técnica del mapeo por
bisulfito, según reportado por [3]. El procedimiento es el siguiente:

1
 Se trata ADN del tejido estudiado con bisulfito.
Se diseñan primers para los genes de interés (suponiendo que todas las citosinas fueron remplazadas por timinas en
el tratamiento con bisulfito pues a priori no se sabe dónde hay metilación).
Se amplifican por PCR los genes de interés tratados con bisulfito, verificando el éxito si aparece una única banda
por cada gen amplificado al hacer electroforesis del producto de PCR en geles de agarosa.
Se secuencian los genes amplificados. Se comparan las secuencias de ambos grupos (G1E y G1C) y ambas con la
secuencia reportada de cada uno de esos genes ([6]). Todas las citosinas del gen original deberı́an haberse convertido
a timinas; las que no se convirtieron son las metiladas.

Por otro lado, se determina el grado de expresión de los genes en estudio, para verificar si el nivel de metilación
influye en la actividad del mecanismo de transcripción. Esto se hace mediante PCR de transcripción reversa de los ARN
mensajeros correspondientes a las proteı́nas sintetizadas por cada uno de los genes. El procedimiento se realiza según
reportado ([2]).
Los resultados esperados, en concordancia con estudios previos, son los siguientes: se prevee que las ratas del grupo
G1C tengan una ingesta diaria menor que las del grupo G1E, e ı́ndice de masa corporal y circunferencia abdominal
acordes a los estándar, y que las del grupo G1E tengan esos parámentros fisiológicos mayores, consistentes con obesidad.
Por otro lado, se espera encontrar mayores niveles de dopamina a nivel del hipotálamo y del circuito central de respuesta
en las ratas del grupo G1E que en las del grupo G1C. Finalmente, se espera encontrar las variaciones en el grado de
metilación del ADN indicadas en la tabla 1 en las ratas del grupo G1E pero no en las del grupo G1C, asociadas con
variaciones en la expresión de esos genes: una mayor metilación resultarı́a en el reclutamiento de las enzimas HDAC que
desacetilan las histonas, lo cual implica una represión de los genes correspondientes por condensación de la cromatina.
De modo inverso, una metilación menor a la estándar implicarı́a menor reclutamiento de proteı́nas borradoras, histonas
más acetiladas, cromatina más laxa y una mayor expresión de los genes correspondientes.
La relación entre el funcionamiento de la vı́a dopaminérgica y las modificaciones fisiológicas y de comportamiento
en las ratas se puede verificar inhibiendo farmacológicamente los receptores de dopamina y los transportadores viculados
al reuptake y/o estimulando la biosı́ntesis y los transportadores de dopamina hacia fuera de las neuronas. Se simula de esa
manera el efecto asociado a las caracterı́sticas epigenómicas detalladas en la tabla 1 en un grupo de ratas cuyo genoma no
tenga esas marcas (por ej. ratas del grupo G1C, si los resultados son los esperados). Se espera que tras ese tratamiento las
ratas intervenidas presenten ı́ndice de masa corporal, circunferencia abdominal, niveles de ingesta y niveles de dopamina
en las regiones del cerebro afectadas coincidentes con los medidos en ratas del grupo G1E.
Una vez que se reproducen en el modelo en estudio los resultados reportados en trabajos previos, se procede a estudiar
la segunda generación (G2), es decir, la crı́a de las ratas de los grupos G1. Ambos grupos de madres, G1C y G1E, recibirán
una dieta balanceada durante la gestación, puesto que se quiere estudiar la heredabilidad de las marcas epigenéticas
preexistentes y no las modificaciones epigenéticas sobre la crı́a vinculadas a la nutrición prenatal. Se considera que el
plazo de la gestación es demasiado corto como para que el cambio de dieta influya significativamente en el epigenoma
de las madres G1E. Aún ası́, se podrı́a verificar esto repitiendo los estudios de metilación en las madres luego del parto.
Además, ambos grupos de crı́as (G2E, hijos de las madres G1E, y G2C, hijos de las madres G1C) recibirán los mismos
cuidados postnatales. Serán criados por madres adoptivas con caracterı́sticas del G1C, para que en ningún caso influya el
amamantamiento de parte de madres mal nutridas y para que todas las crı́as sufran el proceso de adopción.
A las crı́as de ambos grupos se les realizarán controles equivalentes a los hechos para el G1: monitoreo de indicadores
fisiológicos de obesidad cada tres semanas, monitoreo de cantidad de alimento ingerido (normalizado por peso de cada
individuo), cuantificación de dopamina en el hipotálamo y en el circuito central de respuesta y después de 6 meses
extracción de ADN y ARN para estudiar el grado de metilación en los genes de interés y la expresión de esos genes como
se explicó más arriba. Se espera que las crı́as G2E presenten indicadores fisiológicos consistentes con obesidad, mayor
ingesta que las G2C, alta dopamina en las áreas estudiadas y los patrones de metilación de ADN detallados en la tabla 1
asociados al nivel de expresión esperado de esos genes, y que las crı́as del G2C no compartan esas caracterı́sticas. Eso
indicarı́a que las modificaciones epigenéticas de la primera generación resultaron heredadas a la segunda generación.
Un experimento complementario consiste en proveer la dieta desbalanceada a algunas madres del grupo G1C (subgru-
po G1CE) y la dieta balanceada a otras (subgrupo G1CC) solo durante la gestación, para estudiar si la nutrición prenatal
puede generar las modificaciones epigenéticas y las caracterı́sticas fisiológicas reportadas en la crı́a. Se esperan para las
crı́as de las madres G1CE resultados similares a los de las crı́as G2E, y para las de madres G1CC resultados similares a los
de las crı́as G2C. Esto serı́a consistente con el hecho de que la nutrición postnatal afecta al epigenoma y a los parámetros
fisiológicos vinculados a la obesidad, como se vio al estudiar la primera generación (G1).

2
Referencias
[1] Jr J.B. Justice. “Quantitative microdialysis of neurotransmitters”. En: Journal of Neuroscience Methods 48 (1993),
págs. 263-276. DOI: 10.1016/0165-0270(93)90097-b.
[2] P. O. McGowan y col. “Epigenetic regulation of the glucocorticoid receptor in human brain associates with childhood
abuse”. En: Nature Neuroscience 12.3 (2009), págs. 342-348. DOI: 10.1038/nn.2270.
[3] Y. Li 1 y T. O. Tollefsbol. “DNA methylation detection: Bisulfite genomic sequencing analysis”. En: Methods Mol
Biol 791 (2011), págs. 11-21. DOI: 10.1007/978-1-61779-316-5_2..
[4] Z. Vucetic y col. “Epigenetic regulation of the dopamine system in diet-induced obesity”. En: Journal of Neuroche-
mistry 120 (2012), págs. 891-898. DOI: 10.1111/j.1471-4159.2012.07649.x.
[5] O. Ramos-Lopez y col. “Dopamine gene methylation patterns are associated with obesity markers and carbohydrate
intake”. En: Wiley Brain and Behavior (2018), págs. 1-12. DOI: 10.1002/brb3.1017.
[6] KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. URL: https://www.genome.jp/kegg/.
[7] Obesity and overweight. URL: https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/obesity-and-
overweight. (1 April 2020).