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APLICACIÓN DE LA POTENCIOMETRÍA Y LA VOLTAMPEROMETRÍA

PARA DETERMINAR LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE MOLÉCULAS


MODELO.

1. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN

1.1 Radicales libres

Los radicales libres (RL) son átomos o moléculas altamente


reactivas, debido a que en el orbital más externo de su estructura, tienen
uno o más electrones sin aparear. La razón por el interés científico en los
RL es que como especies que contienen electrones desapareados tienden
a estabilizarse. Para lograr esto, ellos reaccionan rápidamente con
moléculas orgánicas que se encuentran en su proximidad. Las reacciones
vía radicales libres son generalmente reacciones en cadena. Los radicales
se generan en una o varias etapas llamadas iniciación y participan en una
secuencia de reacciones de propagación, en la que el número de radicales
se conserva; finalmente los radicales se destruyen por uno o varios
procesos de terminación. Aunque algunas moléculas requieren
condiciones extremas para formar especies radicales, muchas otras lo
hacen bajo condiciones suaves, incluyendo diferentes moléculas que se
encuentran en los organismos vivos. (1-3)

Las células vivas, del hombre, de animales y de vegetales, se exponen


continuamente a una variedad de desafíos que ejerce un estrés oxidativo.
Los radicales libres pueden provenir de fuentes endógenas, de procesos
fisiológicos normales, tal como la respiración mitocondrial; y también,
pueden resultar de fuentes exógenas, tal como la exposición a agentes
contaminantes (ozono y óxidos de nitrógeno) y a una radiación ionizante
(luz ultravioleta). (2)

En particular se hace énfasis la generación de especies reactivas del


oxigeno (ROS), que generan radicales libres, los cuales por su alta
reactividad debida a los electrones desapareados que poseen en su última
capa de valencia, reaccionan con una serie de moléculas importantes para
el organismo como lo son las proteínas, los lípidos, los ácidos nucleicos y
los hidratos de carbono, alterando su estructura y por ende sus funciones
normales dentro de la célula. Las especies en referencia son radicales
derivados del oxigeno; como el anión superóxido (O2 ●-), peróxido de
hidrógeno (H2O2) y el radical hidroxilo (OH●), los cuales son generados de
manera natural durante procesos metabólicos en todos los seres
consumidores de oxígeno.(3,4)
La producción de RL aunado a la formación de ROS son parte inherente al
metabolismo, procesos además necesarios para el mantenimiento de
funciones vitales. Sin embargo el desequilibrio entre la producción de ROS
y el estado antioxidante de una célula intacta provoca estrés oxidativo
(EO). Los RL se forman como parte del metabolismo normal y se
incrementan en estados de inflamación y durante la exposición de
contaminantes, exposición a radicación (UV), humo de tabaco y el
consumo de ciertos fármacos; los RL producidos en estos eventos
provocan oxidación de lípidos y proteínas, lo cual altera la transducción
celular incrementando el riesgo de desarrollar algún tipo de patología.(1,2)

1.2 Antioxidantes

Las células poseen diversos sistemas de defensa contra los RL y actúan


por diferentes mecanismos. Estos mecanismos son vía actividades
enzimáticas y por acción de los antioxidantes de bajo peso molecular
(LMWA).(4,9) La familia de LMWA consta de diversos compuestos, cada uno
de los cuales actúa directamente como limpiador químico o como captor
de ROS o actúa indirectamente por complejación de los metales de
transición. Los LMWAs son moléculas pequeñas que penetran en la célula
y se acumulan (en altas concentraciones) en compartimientos específicos
asociados al daño oxidativo, y después se regeneran por la misma célula.
En los tejidos humanos, las células obtienen los LMWA de varias fuentes.
El glutatión reducido (GSH), el dinucleótido nicotinamida adenina (forma
reducida), y la carnosina son sintetizados por las células; el ácido úrico
(AU) y la bilirrubina, son residuos del metabolismo celular; el ácido
ascórbico (AA), los tocoferoles y los polifenoles son antioxidantes
obtenidos de la dieta alimenticia.(4,9,10,11)

El plasma sanguíneo se utiliza a menudo como muestra para la evaluación


del daño inducido por radicales libres, ya que contiene moléculas que son
altamente afectadas por el daño oxidativo, entre ellas las lipoproteínas y
el GSH, asimismo por su contenido de antioxidantes importantes como el
AA y el UA. Las características del plasma son un reflejo del estado
antioxidante integral, asociado al proceso del estrés oxidativo. Por lo
tanto, para obtener un panorama representativo de todo el organismo, se
debe caracterizar el estado antioxidante del plasma y evaluar la
interrelación que existe entre la enfermedad, la dieta, los radicales libres y
el suplemento de vitaminas o de fármacos.(10,12)

Los antioxidantes, están presentes en la dieta ingerida por los seres vivos,
sobre todo en las frutas y verduras. Según el Instituto Nacional de Cáncer
y la Academia Nacional de Ciencias de EE.UU., se sugiere que dos frutas y
tres verduras por día una ingesta adecuada. (13)

He aquí algunos ejemplos de alimentos ricos en antioxidantes:

- Alimentos ricos en vitamina E: maní, germen de trigo, aceites vegetales,


aceituna, margarinas y espárragos.

- Alimentos ricos en vitamina C, que también contienen acaroteno:


pimientos rojos y verdes, fresas, naranjas, brécol, kiwi, zumo de tomate,
naranja y uva, sandia, patata cocida y coles de brucelas.
- Alimentos ricos, en b-caroteno, que contienen vitamina C: papa dulce
cocida, papaya. zanahorias, espinaca, tomates, albaricoque, manteca de
maní y calabaza en lata.

Las frutas y verduras, además de proporcionar estos antioxidantes,


poseen también micronutrientes, que pueden prevenir mutaciones.(14,15)

Por lo anterior es de gran interés la obtención y caracterización de nuevos


compuestos con actividad antioxidante, además de validar el efecto
farmacológico de especies comúnmente utilizadas en la medicina
tradicional mexicana, para garantizar un uso racional de la fitoterapia.

1.3 Mecanismos de reacción de los antioxidantes

Los antioxidantes pueden desactivar especies radicales por dos


mecanismos, por la transferencia de un átomo de hidrógeno (HAT) o por la
transferencia simple de un electrón (SET). El resultado final es el mismo,
no importa el mecanismo, pero la cinética y la presencia de reacciones
secundarias es diferente.(2,16,17) Los métodos basados en HAT miden la
capacidad típica de un antioxidante para bloquear radicales libres por la
donación de un hidrógeno. Las reacciones HAT son independientes del
disolvente y del pH y son generalmente rápidas, terminado en segundos o
minutos.

1.4 Evaluación de la capacidad antioxidante

Para medir la “capacidad antioxidante total” (TAC) de fármacos,


alimentos, bebidas, extractos vegetales y fluidos biológicos existen varios
métodos.(10,16,18,19) Estos se pueden llevar a cabo in vitro o in vivo, los
métodos se clasifican basándose en la propiedad medida a la muestra o
sistema, en métodos espectroscópicos y métodos electroquímicos.

Para separar y determinar de manera independiente los LMWA, se utiliza


la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), la cual requiere un
detector electroquímico con electrodos de alto costo o un detector
espectrofotométrico con arreglo de diodos, lo que constituye una
desventaja económica.(18,20,21)
La investigación y desarrollo de métodos que evalúen la capacidad
antioxidante constituye una búsqueda constante. Se buscan métodos
fácilmente adaptables, económicos y que permitan comparar la capacidad
antioxidante total de diferentes muestras. En esta búsqueda se pretende
disminuir el elevado costo de los reactivos y aumentar la estabilidad
química del radicales cromogénicos como el ácido 2, 2'-azino-bis-[3-
etilbenzotiazol-6-sulfónico] (ABTS) y El 1,1-difenil-2-picrilhidracilo (DPPH),
entre otros. Se busca establecer un método que evalúe la capacidad
antioxidante y especifique el tipo de oxidante que se puede neutralizar. Un
método estandardizado para determinar la TAC debe cubrir los requisitos
"ideales" siguientes: (i) aplicable a una amplia gama de muestras reales;
(ii) que utilice una fuente radical con relevancia biológica; (iii) sencillo; (iv)
con un punto final bien definido y con un mecanismo químico conocido; (v)
de instrumentación accesible; (vi) adaptable para evaluar antioxidantes
hidrofílicos y lipofílicos y que puedan utilizar diferentes fuentes radicales;
(vii) adaptable a un análisis del alto-rendimiento aplicado al análisis
rutinario del control de calidad. Las características funcionales que se
deben considerar en la estandardización de estos métodos de análisis
incluyen (a) límite de detección e intervalo de cuantificación, (b)
sensibilidad, (c) recuperación, (d) repetibilidad, (e) reproducibilidad, y (f)
evaluación de sustancias interferentes.

1.4.1 Métodos Espectroscópicos.(10-12,16,22-24)

En los métodos espectroscópicos se mide la absorbancia o la


fluorescencia, esta medida responde a la variación en la concentración de
la especie radical de interés y/o de la captura de ROS; se basa en la
capacidad de la muestra para limpiar o captar una ROS específico. Los
métodos espectroscópicos proporcionan una información útil, pero que no
es suficiente para la evaluación del perfil antioxidante de un fluido
biológico, de un homogenizado celular, o de un extracto vegetal. Esto se
debe, a que no puede diferenciar a cada uno de los componentes de la
muestra que presenta actividad antioxidante. El valor asignado a la
capacidad total de atrapar radicales peroxilo (TRAP, por sus siglas en
inglés) fue el primer método desarrollado para utilizar pequeños
volúmenes de muestra (microlitros), y en el se cuantifica la capacidad de
absorber el radical peroxilo, por antioxidantes presentes en los líquidos
biológicos.(24) Este método es específico para radicales peróxido; sin
embargo, en el organismo humano existe otro tipo de radicales derivados
del oxígeno.

1.4.2 Métodos Electroquímicos.(25,26)

Los antioxidantes actúan como agentes reductores (mecanismos SET), por


lo que pueden reducir al oxígeno y a los radicales derivados del mismo y
de otras moléculas, originando especies mucho menos tóxicas. Los
métodos electroquímicos miden la capacidad reductora u oxidante de las
especies involucradas en este tipo de procesos. Por ejemplo, se ha
propuesto el empleo de la voltamperometría cíclica (VC), como
herramienta instrumental para la evaluación de la capacidad antioxidante
total de los LMWAs en plasma y otros fluidos biológicos, (10) así como en
homogeneizados de tejidos. Asimismo, se ha utilizado, la VC para la
evaluación de la capacidad antioxidante total de plantas comestibles. (25,27).
La mayoría de LMWA bloquean las ROS por una donación de electrones.
Por lo tanto, la evaluación de la capacidad reductora total de una muestra
biológica por medio de un VC, es un reflejo de la actividad antioxidante.

La adaptación de la voltamperometría cíclica (VC) a la cuantificación de


substancias reductoras, contenidas en los sistemas biológicos, fue iniciada
por Kohen y Chevion, quienes aplicaron exitosamente el método, en frutas
y en vegetales.(28) La VC ha servido para caracterizar los compuestos
obtenidos en un extracto hexánico de la Iryanthera juruensis
(Myristicaceae). Del extracto se obtuvieron moléculas con características
antioxidantes similares al - caroteno, se identificaron como 3-metill-
sargacromenol y sargacromenol. En la voltamperometría cíclica, ambos
tocotrienoles presentan una oxidación asociada al grupo fenólico y
correlacionan muy bien con el mecanismo de oxidación de la molécula de
referencia -tocoferol (vitamina E). La comparación del comportamiento
voltamperométrico entre la vitamina E y los tocotrienoles, extraídos de las
frutas de I. juruensis, demuestran una buena correlación entre la actividad
antioxidante y su potencial de oxidación. La caracterización
electroquímica (por VC) de compuestos fenólicos presentes en el aceite de
oliva virgen correlaciona con la alta resistencia a la deterioración
oxidativa, como consecuencia de la baja concentración de ácidos grasos
poliinsaturados y por la presencia de antioxidantes fenólicos,
principalmente polifenoles y tocoferoles.(29)

Por otra parte, los métodos electroquímicos para la determinación del


GSH, han recibido gran atención en los años recientes. (12,26) Aunque el
grupo hidrosulfuro de GSH es muy reactivo y se oxida fácilmente por el
oxígeno y por los peróxidos, su oxidación electroquímica sobre un
electrodo tradicional, sin modificar, es generalmente un proceso muy
lento, exceptuando cuando se utiliza el electrodo de mercurio, que no es
el ideal para su empleo como sensor debido a su toxicidad. Además, el
grupo tiol del GSH se adsorbe fuertemente en la superficie de los
electrodos de metales nobles, como platino, oro y plata, dando por
resultado el bloqueo y la contaminación de los electrodos. Para solucionar
el problema de la adsorción del GSH, así como la de los polifenoles, se han
manejado electrodos modificados. Para la modificación del electrodo se
utilizan enzimas completas, tal como GSH-oxidasa, GSH-peroxidasa y
tirosinasa; compuestos organometálicos incluyendo las ftalocianinas de
cobalto, el hexacianoferrato de indio, el hexacianoferrato de cobalto y TTF-
TCNQ. Para facilitar la oxidación electroquímica, también se han propuesto
electrodos de materiales novedosos, como el diamante dopado con boro,
la pasta de nanotubos de carbono y el nanocomposite formado por un sol-
gel de cerámica y nanotubos de carbono. Sin embargo, no existe
información referente a la eliminación de las interferencias causadas por
el ácido ascórbico o el ácido úrico.(26) Por lo que se continúa buscando una
técnica que permita la transferencia de electrones entre el GSH y el
electrodo, y además eliminar simultáneamente la interferencia causada
por especies electro-activas coexistentes. Una alternativa es el
microelectrodo del polvo de carbono (MEP), el cual facilita la
electrooxidación del GSH y su determinación electroquímica, además de
que permite eliminar las interferencias causadas por especies electro-
activas como el AA y el AU, sin embargo, ha mostrado escasa
reproducibilidad entre las determinaciones.(26)

1.4.3 La voltamperometría cíclica

La VC tiene ciertas ventajas respecto a los otros métodos; es rápida (una


medición puede durar algunos segundos), relativamente barata después
de la compra inicial del equipo, y es muy sensible en la determinación de
concentraciones fisiológicas de antioxidantes.(28) En la VC la capacidad
antioxidante total de una muestra es función de dos parámetros, el
primero es el potencial biológico de la oxidación (Eox) y el segundo es la
intensidad de la corriente anódica (Ia). El Eox se asocia normalmente con
el potencial de media onda (E1/2) y reflejan la capacidad reductora
específica de un componente (o de componentes con potencial similar). La
intensidad de la corriente (Ia) se asocia con la concentración de los
componentes reductores. La integración de estos dos parámetros origina
un valor equivalente a la capacidad antioxidante total de la muestra,
siendo no necesaria la determinación de la actividad antioxidante de cada
uno de los componentes, por separado. La propuesta de utilizar la carga
eléctrica total (Q) en lugar de la corriente, proporciona una ventaja
marcada en algunos casos, particularmente cuando en un
voltamperograma específico, la onda está asociada a más de un
componente. El cambio en la composición se refleja en la carga eléctrica
mejor que en el cambio correspondiente a la corriente Ia.(21)

Una VC del plasma sanguíneo puede proporcionar información sobre la


exposición al estrés oxidativo (anterior a la colección de la sangre) y sobre
la respuesta o capacidad antioxidante del individuo, en base a la AOC. La
VC también puede ser utilizada para evaluar la capacidad antioxidante
total de plantas comestibles, extractos vegetales, vinos, fármacos,
medicamentos y cosméticos, como una prueba de control de calidad. Sin
embargo, la voltamperometría cíclica de los antioxidantes tiene como
desventaja que los productos de oxidación tienden a adsorberse sobre el
electrodo, por lo que el área superficial y sus propiedades se ven
modificadas. Una alternativa es el uso de electrodos modificados, que
tienen un mayor costo y funcionan sólo para ciertos compuestos, y otra es
la polarización del electrodo, alternando potenciales oxidantes y
reductores, con lo que disminuye el efecto de la adsorción de los
productos de oxidación. (26)
1.4.3 Titulaciones redox

Las reacciones de reducción-oxidación (reacción redox) son las reacciones


de transferencia de electrones. Esta transferencia se produce entre un
conjunto de especies químicas, uno oxidante y uno reductor. Para que
exista una reacción redox, en el sistema debe haber una especie que ceda
electrones y otra especie que las acepte:
Las volumetrías redox o de oxidación - reducción, se relacionan con la
titulación de un agente oxidante con una solución estándar de un agente
reductor, o la titulación de un agente reductor con una solución estándar
de un agente oxidante. El punto final de una titulación redox puede
determinarse mediante el cambio de color de un indicador o utilizando un
potenciómetro y electrodos adecuados.
El potencial de un electrodo indicador adecuado puede utilizarse en forma
muy conveniente para establecer el punto de equivalencia en una
titulación, lo que se denomina una titulación potenciométrica y que aporta
una información diferente a la de una medida potenciométrica directa. El
punto final potenciométrico puede utilizarse en muchas circunstancias y
proporciona datos intrínsecamente más precisos que los que se
obtendrían con la misma técnica empleando indicadores.
Lamentablemente, este procedimiento toma más tiempo que una
titulación con indicador.
Titulaciones redox con corriente impuesta. Usando está característica, el
punto final en titulaciones redox experimenta un aumento considerable en
la velocidad de las reacciones redox. La velocidad es incrementada
significativamente cuando el electrodo doble de Pt (platino) usado para la
titulación es polarizado con una pequeña corriente impuesta (obtenemos
un salto paso a paso, perfectamente adaptado para las titulaciones de
punto final).

1.5 Justificación

Investigaciones recientes han demostrado que la producción de RL aunado


a la formación de ROS, son parte inherente al metabolismo, procesos
además necesarios para el mantenimiento de funciones vitales. Sin
embargo, las condiciones en las que vive actualmente el hombre, tales
como la excesiva contaminación ambiental y la exposición prolongada a
radiaciones UV, han causado en el organismo un desequilibrio entre la
producción de ROS y el estado oxidante de una célula, causando un
cuadro de estrés oxidativo, lo que conlleva no solo a al aceleración del
proceso de envejecimiento sino también al padecimiento de
enfermedades degenerativas. Lo que ha obligado al desarrollo de
productos nutraceuticos y firoterapéuticos, formulados a partir de
extractos de plantas con un alto contenido de antioxidantes, así mismo de
productos cosmeceuticos como los son: cremas, geles y lociones que
contienen moléculas reductoras. Por tal motivo, la importancia de esta
investigación radica en el desarrollar y validar un método electroquímico
que permita determinar la actividad antioxidante de los productos ya
citados, así como clasificar el contenido de antioxidantes con base en su
potencial reductor. Con lo que se asegura la calidad de estos productos.

2. OBJETIVOS Y METAS

2.1 Objetivo General.

Desarrollar y validar una metodología electroquímica que permita


establecer la capacidad antioxidante de moléculas modelo (glutatión,
catecol, trolox y quercitina), para su aplicación a productos nutracéuticos,
cosmecéuticos y fitoterapéuticos.

2.2 Objetivos Particulares.


• Realizar titulaciones redox directas y por retroceso seguidas
potenciométricamente, para determinar la capacidad
antioxidante de disoluciones que contengan un solo LMWA y
disoluciones de una mezcla compleja; utilizar como agentes
oxidantes comunes como el peróxido de hidrógeno, triyoduro de
potasio, ferricianuro de potasio y sulfato cérico. Seleccionar la
mejor manera de determinar el punto de equivalencia y la
estequiometría de las reacciones.

• Evaluar a la voltamperometría cíclica, como una técnica analítica
útil para establecer la capacidad antioxidante de moléculas
modelo como: glutatión, catecol, trolox, quercetina,
hidroquinonas y catequina, en base a medidas de corriente,
carga y potencial eléctricos.

• Utilizar la voltamperometría diferencial de pulsos para determinar


la capacidad antioxidante de cada una de las especies
antioxidantes, en forma individual y contenida en una mezcla de
otros compuestos no mencionados, considerando los parámetros
de potencial, corriente y carga.
3. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.

- Establecer las condiciones de pH y concentración de electrolito a las que se favorece el


estudio, considerando las referencias bibliográficas.
- Realizar el estudio voltamperométrico de cada una de las moléculas modelo (glutatión,
catecol, trolox y catequina), a tres condiciones de pH y a diferente velocidad de barrido de
potencial, utilizando un electrodo de carbón vítreo. Evaluar los potenciales de oxidación (EOX)
y corrientes de pico (Ia) en función de la concentración de las especies. Caracterizar los casos
en que se da la adsorción sobre el electrodo de los reactivos o productos de oxidación
- Trazar una familia de cronoamperometrías de doble pulso (a diferente E), a fin de eliminar
la posible adsorción y poder construir las voltamperometrías de corriente muestreada (a
diferente tiempo), para determinar capacidad antioxidante de cada una de las moléculas de
interés en función del E1/2, de la corriente límite y de la carga (Q). Construir curvas de
calibración.
- Realizar titulaciones bipotenciométricas, utilizando electrodos de platino y electrodos de
carbón vítreo a una corriente impuesta de 10 micro amperes, para determinar la capacidad
antioxidante de cada una de las moléculas modelo, ante la presencia oxidantes específicos,
como peróxido de hidrógeno, triyoduro, Cu(II)-Neocupreina, Cu(II)-I-; seleccionando la
mejor manera de determinar el punto de equivalencia.
- Seleccionar la técnica electroquímica que permita analizar mezclas de antioxidantes,
similares a las combinaciones contenidas en muestras reales (extractos vegetales), a partir de
datos de potencial corriente y carga.
- Determinar la capacidad antioxidante total en muestras de extractos vegetales (en
equivalentes de un antioxidante de referencia). Se aplicarán curvas de calibración y de
adiciones patrón.
- Comparación de la capacidad oxidante obtenida por la técnica electroquímica desarrollada
en este proyecto, con técnicas comunes como la espectrofotométrica, con el fin de evaluar los
alcances de la técnica electroquímica.
4. CRONOGRAMA

Actividades a realizar entre 2007 y 2008.


Actividad OCT- DIC- FEB- ABR- JUN- AGO-
NOV ENE MAR MAY JUL SEP
Selección de las condiciones de pH y
concentración de electrolito, probar diferentes X X
disolventes
Estudio voltamperométrico para cada molécula
modelo, variando pH, disolvente y concentración X X
Construcción de curvas voltamperométricas a
partir de cronoamperometrías de doble pulso X X
Realizar titulaciones bipotenciométricas,
utilizando agentes oxidantes como el H2O2 y los X X
iones triyoduro (I3-)y cúprico(Cu(II))
Realizar un análisis comparativo para determinar
las ventajas y desventajas de las tres técnicas X X
electroquímicas utilizadas para determinar la
capacidad antioxidante
Aplicar la mejor técnica electroquímica para
determinar la capacidad antioxidante en muestras X X
reales, utilizando curvas de calibración y curvas
de titulación.
Comparación de resultados electroquímicos y
espectrofotométricos X X
Realización del Informe de Actividades del
servicio social X X X
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5. Vo. Bo. De del contenido académico.

____________________________
Dr. Martín Gómez Hernández
Profesor Titular C, UAM-Xochimilco
No. Económico 30641
____________________________
Dra. Adriana Miriam Domínguez R
Profesor Titular C, UAM-Xochimilco

15-oct-2007 al 15-sep-2008

Área de farmacocinética y
farmacodinamia, Lab. G-203.
Departamento de sistemas biológicos
División CBS
UAM-Xochimilco