Manual de Practicas de bioinformatica para biologia molecular MILENA GUERRERO FLOREZ OSCAR BURBANO FIGUEROA UNIVERSIDAD DE NARINO. FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES. | DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA, 2014 Ie EN <2) Escaneado con Ca - Universidad de Naxito. 2014 Manual de Practicas de Bioinformética para Biologia Molecular GUIA 1, EJERCICIO BIOINFORMATICO PARA REFORZAR LOS CONCEPTOS DLE UUme nm anna ata mCa Oh ENTRE SECUENCIA GENICA Y PROTEICA En este efercicio de aprendizaje por computador, el estudiante emplearé el paquete de software bioinformatico BioEdit para manipular y analizar secuencias de genes y aminodcidos obtenidas de la base de datos GenBank. Adicionalmente tendré la oportunidad de experimentar como fluye la informacién a través del Dogma Central y observara por sf mismo el efecto drastico que una mutacién en un determinado gen, tiene sobre el producto proteinico codificado. Manipulard los genes unc-22 y Tc5 provenientes del nematodo de vida libre en el suelo Caenorhabditis elegans, un organismo modelo empleado frecuentemente en los andlisis genéticos moleculares en un amplio rango de problemas en biologia. El gene unc-22 en su versién genémica sin procesar contiene 47,081 nuclestidos, un gen que por su tamajio no serfamos capaces de procesar a mano. La protefna que codifica es un componente del misculo de la pared corporal del gusano y esta implicada en el proceso de alcanzar una suave relajacién después de la contraccién, Este producto génico se denomina “Twitchin” dado que cuando esté mutada, la relajacién de los misculos de la pared corporal no es regulada apropiadamente, resultando en temblor total del cuerpo. El fenotipo “twitcher” puede ser facilmente visto al observar mutantes unc-22 j6venes de C. elegans bajo un microscopio de disecci6n. Se familiarizard ademas con los transposones, secuencias méviles de DNA, los cuales saltan a través del genoma y causan varias mutaciones como resultado de su insercién y/o escisi6n. Frecuentemente, el ORF de un gene es alterado cuando un transposon encuentra en su camino DNA exénico, Esta mutacién a menudo tiene efectos posteriores sobre la expresién génica y la funcién de las protefnas, Este ejercicio ilustrara como el transposon Tc5 de C. elegans se introduce en el tercer ex6n de unc-22, ocasionando deriva en el marco de lectura y la introduccién de un codén de paro prematuro. La proteina mutante Twitchin tiene menos del 9% de los aminodcidos de la proteina silvestre. Guerrero Flérez GM, Burbano Figueroa OA a Lovaiicauy vvil CUniversidad de Naxitio. 2014 Manual de Précticas de Bioinformatica para Biologia Molecular Pc Computador con el sistema operativo Windows Xp, Vista, W7, W8, drive puerto USB, RAM de 1Gb. Conexién a internet banda ancha obligatorio. Base de datos Las secuencias unc-22 y Tc5 pueden ser obtenidas de la base de datos GenBank, del Nacional Center _~—for_—Biotechnology ‘Information —_(NCBI; , que forma parte de la Biblioteca Nacional de Medicina (Nacional Library of Medicine, NLM) del Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos (Nacional Institutes of Health, NIH). GenBank contiene todas las secuencias de DNA disponibles al ptiblico, tanto las enviadas por los laboratorios individuales como las obtenidas a través del intercambio con bases de datos de secuencias nucleotidicas internacionales. GenBank es un miembro de la “International Nucleotide Sequence Database Collaboration. Entrez (http:/www.ncbi.nlm.nig gov/Entrez/) es un motor de biisqueda que permite el acceso a datos de biologia molecular y referencias bibliogrficas a partir de las bases de datos integradas del NCBI. Software Es necesario un Web browser (Google Chrome, Internet Explorer, Mozilla) para acceder al website del NCBI y buscar las secuencias pn el GenBank. Un editor de texto (bloc de notas) es usado para almacenar las secuencias de nucleétidos y proteinas obtenidas del GenBank y antes de ser importadas al software bioinformitico. El software de biocomputacién BioEdit es suministrado sin costo por Ibis Therapeutics (Carlsbad, California, www.mbio,ncsu.cdu/Biocdit/bioedit. html). El software, instalado desde un archivo Winzip, viene acompajiado por una detallada guia del usuario, que es comprensible para el principiante. Almacenamiento del ejercicio Cada estudiante o grupo de estudiantes deberd guardar su trabajo en una memoria USB. Antes de iniciar el ejercicio cada equipo deberd crear y nombrar las siguientes tres carpetas: “Secuencias”, “Edicién de secuencias” y “Alineamiento de protefnas”. Las carpetas son una forma de organizar los datos que seran almacenados perlédicamente y le (s) permitiré una facil y répida recuperacién. Guerrero Flérez GM, Burbano Figueroa OA Lovaricauy vvil C—— Universidad de Narito. 2014 Manual de Précticas de Bioinformética para Biologia Molecular RECOMENDACIONES Los estudiantes pueden trabajar individualmente, en parejas o en grupos mas grandes. Para maximizar el aprendizaje se recomienda que los estudiantes trabajen en grupos de al menos dos o tres personas para que puedan capitalizar las fortalezas de unos y otros. El ejercicio puede ser terminado en una hora y media. Como introduccién previa al laboratorio el estudiante debera entender que levard a cabo un ejercicio dinamico que abordaré los aspectos claves del Dogma Central que no pueden ser cubiertos adecuadamente mediante diapositivas o esquemas simplemente. Utilizard herramientas de bioinformatica para simular el procesamiento de secuencias silvestres y mutantes del gene unc-22 de C. elegans. La manipulacién de las secuencias de los genes le permitiran vislumbrar y clarificar la naturaleza de los procesos de expresi6n génica involucrados en el Dogma Central de la biologia molecular, las relaciones entre las secuencias de nucledtidos y aminodcidos, entre las secuencias de aminodcidos y la funcién de la protefna, y en iiltimo término las consecuencias de las alteraciones en las secuencias de nucleétidos y aminoacidos sobre la funcién de las proteinas. Acontinuacién encontraré una descripcién de los pasos a seguir: CONSECUCION Y ALMACENAMIENTO DE LAS SECUENCIAS DEL DNA Entrez, el motor de busqueda del NCBI, serd utilizado para buscar en la base de datos GenBank, las secuencias completas de nucleétidos y aminodcidos del gene silvestre unc-22 (No acceso: X15423.1) y de la protefna resultante “Twitchin”. También se obtendran las posiciones de los exones y los intrones del unc-22 y la secuencia nucleotidica de TeS (No Acceso: U12433.1). Las secuencias se deben deberin ser grabadas en archivos separados de procesamiento de texto (bloc de notas) para su subsecuente recuperacién y manipulacién. Guerrero Flérez GM, Burbano Figueroa OA. a Lovaricauy vvil CcUniversidad de Naxiio. 2014 Manual de Pricticas de Bioinformatica para Biologia Molecular © Sadist nani repenSamra ors Wena Sty Sey tote sete Faw eat: 7 2 ame Figura 1. Secuencias del gen une-22 (Accession X15423.1) y transpos6n TCS (Accession U12433.1. Fuente: http://www.ncbi.nim.nih.gov/ CONSTRUCCION DEL cDNA DE UNC-22 SILVESTRE Y DETERMINACION DE SU ORF. La secuencia del gene unc-22 serd manipulada imitando el procesamiento post- transcripcional que sufre el mRNA del gen unc-22. Las posiciones de los exones y los. intrones que se encuentran en la secuencia del gen unc-22 seran utilizadas para remover intrones y ligar exones, simulando el proceso de maduracién del gen o splicing. El producto de la manipulacién sera una secuencia de DNA complementaria al mRNA procesado del gene unc-22. Se utilizaré la funcién Sequence /Nucleic acid/Find next ORF de Bioedit® para localizar el ORF dentro de esta secuencia de cDNA, la cual, luego de la edicién estard constituida solamente por secuencias exénicas. CONSTRUCCION DEL cDNA DE UNC-22 MUTADO POR TCS Y DETERMINACION DE SU CORRESPONDIENTE ORF. El transposon TcS sera insertado en el tercer exon del gene unc-22 entre los nucleétidos 16,114 y 16,115. Esto significa que el ORF sera alterado por el elemento Tc5 dentro del mRNA. Este punto lo desarrollaré, al introducir la secuencia del Tc5 en lasecuencia del cDNA unc-22y encontrar el ORF. Puede emplear la funcién Buscar (Ctrl +6) para encontrar un fragmento de secuencia determinado. TRADUCCION DEL mRNA DE UNC-22. Guerrero Flérez GM, Burbano Figueroa OA o Lovaricauy vvil Cca ttivessidad de Navin. 2014 Manual de Pricticas de Bioinformatica para Biologia Molecular Una obtenidas las secuencias, “Twichin" silvestre y mutante Tc5, deberd emplear la funcién Sequence/Nucleic acid/Translate/Selection para traducir cada uno de los ORF identificados previamente. NOTA: La secuencia que fue manipulada representa la secuencia de cDNA porque contiene timina y es complementaria al mRNA procesado por el gene unc-22. BioEdit traduce la secuencia asumiendo que el uracilo reemplaza a latimina. ALINEAMIENTO Y COMPARACION DE LAS SECUENCIAS “Twitchin” Una extensién del Dogma Central de la Biologfa molecular es que la secuencia primaria de los aminodcidos de una proteina determina el plegamiento conformacional, lo que a su vez determina la funcién en la célula, En consecuencia, si dos proteinas tienen secuencias de aminodcidos similares es probable -aunque no garantizable-, que sus conformaciones y en consecuencia sus funciones sean similares. La secuencia de “Twitchin” obtenida de la base de datos GenBank junto con las secuencias “Twitchin" silvestre y mutante T’c5 antes construidas deben ser comparadas por homologia a través de un alineamiento miltiple usando la funcién Accessory application /Clustal W Multiple alignment. Tat EWS e aU Las siguientes preguntas le ayudaran en el procesamiento y anilisis del ejercicio: 1. Cémo determinar la referencia apropiada de las secuencias entre las muchas obtenidas de tu busqueda usando Entrez? Delimita a través de palabras claves. 2, Cudl es la utilidad de cada una de las herramientas del software empleadas durante el desarrollo de este ejercicio? 3. Cuantos aminodcidos son codificados por el ORF del gene unc-22 silvestre? 4, Encual codén del ORF de unc-22, es insertado Tc5? Qué efectos tiene la insercion del Tc5 sobre ese codén? Cuantos aminodcidos son codificados por el ORF del gene unc-22 mutante Tc5? 5. Como difiere la proteina producto “Twitchin” obtenida del gene unc-22 mutante TcS de la silvestre de C. elegans? 6. Plante una explicacién del porque la insercién del Tc5 en el gene unc-22 resulta enel fenotipo mutante twitcher? 7. Elunc-22 silvestre que procesé, es idéntico a la secuencia de aminodcidos que obtuvo del GenBank? Si no es asf, puede elaborar una hipétesis para explicar posibles errores? Guerrero Flérez GM, Burbano Figueroa OA a Lovaricauy vvil CcUniversidad de Navision. 2014 Manual de Practicas de Bioinformatica para Biologia Molecular 8. En un diagrama detallado ilustre cada uno de los procesos abajo descritos y donde ocurrirfan en una célula eucariota? a. Insercién del transposon al interior del gen b. Transcripcién del gen mutado por el transposon Procesamiento postranscripcional del mRNA y Traduccién del mRNA ACV nN Almeida, Craig A., Tardiff, Daniel F., DeLuca, Jane P., and Hall Marilena F. Using Bioinformatic Software to Understand the Central Dogma of Biology. Bioscene, Journal of College Biology Teaching, 29(2): 15-25, 2003. Almeida, Craig A., Tardiff, Daniel F., and De Luca, Jane P. An Introductory Bioinformatics Exercise to Reinforce Gene Structure and Expression and Analyze the Relationship Between Gene and Protein Sequences. Biochemisty and Molecular Biology Education. 32(4):239-245, 2004. Guerrero Flérez GM, Burbano Figueroa OA | Lovaricauy vvil Cc_ Universidad de Nasi 2014 Manual de Pricticas de Bioinformatica para Biologia Molecular GUIA COMPLEMENTARIA Procedimiento Paso a Paso para el ejercicio de laboratorio descrito Antes de empezar Cada grupo de estudiantes debe crear las siguientes tres carpetas en el escritorio: “Secuencias”, “Edicién de Secuencias” y “Alineamiento de protefnas”. Las carpetas son una forma de organizacién de los datos que seran almacenados periédicamente y permitird su ficil y rapida recuperacién. Descarga y almacenamiento de las secuenclas de DNA y proteinas 1. Ingrese al motor de biisqueda Entrez en la direcci6n: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 2. Seleccione “Nucleotide” dentro de la ventana desplegable “Search” 3. Dé clic en la ventana de dialogo hasta que aparezca el cursor, ingrese “unc-22”, y entonces presione la tecla “return” o dé clic en “Go” 4. Revise las entradas y determine cual de ellas contiene la siguiente informacién: a) secuencia del gene unc-22, b) localizaciones de los intrones y exones dentro de unc22, y c) la secuencia de aminodcidos de una sola letra de la protefna Twitchin codificada por unc22. 5. Haga clic en el cédigo de su escogencia 6. Vaya hasta el final del documento y revise la informacién provista. Verifique que contiene toda la informacién antes mencionada 7. Confirme su escogencia con el profesor. 8. Seleccione y copie la secuencia de aminodcidos de la protefna Twitchin codificada por unc-22. 9. Pegue la secuencia de aminodcidos en un documento de WordPad o en un bloc de notas, y guardelo en la carpeta "Secuencias” con el nombre “Twitchin genbank” 10. Cierre la ventana de WordPad o del bloc de notas. 11. Haga doble clic en el icono “BioEdit” en programas 0 en el escritorio 12. Haga clic en “File”, y una vez aparezca la ventana desplegable debera escoger “Open”. 13, Seleccione el archivo que grabé y que contiene la secuencia Twitchin. Aparecerd una ventana diciendo que el formato del archivo no es reconocido por BioEdit. Dé clicen “Yes” y la secuencia sera cargada y convertida al formato de BioEdit. 14, lame a este documento “Twitchin genbank” y guardelo en la carpeta “Ed Secuencias” 15, Cierre esta ventana. 16.Vuelve a Internet, seleccione y copie la informacién de los pares de bases que Guerrero Flérez GM, Burbano Figueroa OA Lovaricauy vuil CcUniversidad de Narite. 2014 ‘Manual de Practicas de Bioinformatica para Biologia Molecular conforman los intrones y los exones, incluyendo el sitio poli A para el gene unc-22. 17. Pegue las posiciones de exones e intrones en un documento de Word, guardelo en la carpeta “Secuencias” con el nombre “Exén/Intrén unc-22” 18. Clerre la ventana de Word 19. Vuelva a Internet, seleccione y copie la secuencia nucleotidica del gene unc-22. 20. Péguela en un nuevo documento de WordPad y guardela en la carpeta “Secuencias” como “une-22 genémico”, 21. Cierre la ventana de WordPad 22. Vuelva a BioEdit 23. Dé un clic en “File”, y una vez aparezca la ventana desplegable deberé escoger “Open”. 24, Seleccione el archivo que grabé y que contiene la secuencia genémica de unc-22. 25. Guardelo en la carpeta “Edicién de Secuencias” como “unc-22 gendmico”, 26. Cierre la ventana de edicién 27. Vuelva a Internet, dé clic en el bot6n de retorno en la esquina superior derecha de la ventana del Web browser. 28. En la ventana de dialogo al inicio de la pagina, ingrese la palabra “Tc5" y dé clic en “Go o presione la tecla “Return”. 29. Dé clic en el enlace que haya escogido. 30. Vaya hasta el final del documento y revise la informacién provista. Verifique el contenido de la secuencia génica y de aminodcidos completa, y la informacién de las posiciones de los intrones y los exones del transposén TcS 31. Confirme su escogencia con el Profesor 32. Seleccione y copie la secuencia de nuclestidos 33, Péguela en un nuevo documento WordPad, y guardela en la carpeta “Secuencias” como “TcS”. 34, Cierre la ventana de WordPad 35. Vuelva a BioEdit 36.Dé un clic en “File”, y una vez aparezca la ventana desplegable deberd escoger “Open”. 37. Seleccione el archivo que grabé y que contiene la secuencia genomica de TcS. 38. Guérdelo en la carpeta “Edicin de Secuencias” como “TcS”. 39. Cierre la ventana de edicién. Construcci6n del cDNA silvestre de unc-22 y determinacién de su ORF El gene unc-22 codifica para una protefna que funciona en la regulacién de la contraccién muscular. La protefna se denomina Twitchin porque, cuando muta, la contraccién muscular no es apropiadamente regulada y el gusano tiene un tick corporal Guerrero Flérez GM, Burbano Figueroa OA oi Lovaricauy vvil CcManual de Précticas de Bioinformatica para Biologia Molecular distintivo. Los siguientes pasos imitardn el procesamiento post-transcripcional que le ocurre al mRNA del unc-22 al remover Ios intrones y ligar los exones. El producto de la manipulaci6n es una secuencia de DNA que es complementaria al mRNA procesado del gene unc-22. Esta secuencia de DNA complementaria es conocida como cDNA. 1. Abra el archivo “Ex6n/Intrén unc-22” y registre las posiciones de cada uno de ellos en su libreta de apuntes 2. Cierre la ventana de Word 3, Examine sus datos y observe que los ntimeros asignados a cada Intr6n representan el primer y el tiltimo nuclestido de ese Intr6n. Para procesar la secuencia de unc-22, cada una de las secuencias intrénicas deben ser removidas, por selecci6n y suprimir. Nota: Los intrones deben ser removidos en orden reverso (es decir, el treceavo Intrén es removido de primero y el primer Intr6n es eliminado al final). Una vez eliminado el primer intrén, se debe eliminar ademas la secuencia antes del primer ex6n, correspondiente a las posiciones 1 a 14069. 4. Vuelva a BioEdit. 5, Abra el archivo “unc-22 genémico” en la carpeta “Edicién de Secuencias” 6. Remueva el Intrén 13. Para ello primero selecciénelo (“Sequence /Select positions”) y eliminelo (Tecla “Supr’). 7, Repita el anterior paso para cada uno de los intrones. 8. Guarde la secuencia final en la carpeta “Edicién de secuencias” como “unc-22 cDNA” o “unc-22 mRNA”. 9, Un marco de lectura abierto u ORF (Open Reading Frame) es la secuencia entre los codones de inicio y de paro. Para determinar el ORF dentro del cDNA 0 del mRNA, coloque el cursor a la derecha del nuclestido 14070 (es decir del primer nuclestido en el codén de inicio) de la secuencia, y dé clic en “Sequence /Nucleic acid/Find next ORF” 10. opie Ia secuencia seleccionada y péguela en una nueva ventana (“File/New alignment”). 11. Guarde esta secuencia en la carpeta “Edicién de secuencias” como “unc-22 ORF”. 12. Cierre esta ventana de BioEdit Construccién del cDNA unc-22 mutado por Tc5 y determinacién de su ORF Eltransposén Tc5 serd insertado en el tercer ex6n del gene unc-22 entre los nucledtidos 16,114 y 16,115. Esto significa que el ORF serd alterado por el elemento Tc5 dentro del mRNA. Este punto puede ser ilustrado copiando la secuencia de Tc5 e introduciéndola en la secuencia del cDNA unc-22 o en la secuencia del mRNA unc-22. 1, Abra el archivo “TeS” Guerrero Flérez GM, Burbano Figueroa OA H Lovaricauy vuil CcUniversidad de Narito. 2014 _ Manual de Pricticas de Bioinformatica para Biologia Molecular 2. Seleccione toda la secuencia y cépiela 3. Abra una ventana de alineamiento en BioEdit 4. Abra el archivo “unc-22 ORF” 5. Encuentre el sitio de insercién del Tc5, al interior del marco de lectura abierto del unc-22, con la funcién “Buscar” (Ctrl + f). Para ello digite en la ventana de didlogo la siguiente secuencia que precede al sitio de insercién del TcS en unc-22: “TAAAGTTGGAGAGAC” o en su defecto seleccione los nuclestidos del unc-22 desde la posicién 16,110 hasta la 16,120. a Coloque el cursor al final de la C marcada (o entre la Cy la T en la segunda opcién) y pegue Ia secuencia del Tc5, que previamente copié, en esta posici6n. x Posicione el cursor a la izquierda del primer nucledtido de la secuencla, y dé clic en “Sequence/Nucleic acid/Find next ORF” 2 Copie la secuencia seleccionada y péguela en una nueva ventana (“File/New alignment”). 9. Guarde esta secuencia en la carpeta “Edicién de secuencias” como “unc-22/TcS ORF”. 10. Cierre cada una de las ventanas en las que edit6 las secuencias. ‘Traduccién del mRNA del unc-22 Ahora que todaslas secuencias intronicas han sido removidas, la secuencia nucleotidica restante debe ser traducida. Debe incluirse un comentario. La secuencia que fue manipulada representa el cDNA, porque contiene timina y es complementario al mRNA totalmente procesado codificado por el gene unc-22. El programa BioEdit seré usado para traducir la secuencia de mRNA maduro que fue previamente construido considerando que el uracilo reemplaza a Ja timina. 1. Abra el archivo “unc-22 ORF” 2. Seleccione en la ventana desplegable Mode “Edit” y dé clic en la secuencia 3. Haga clic en “Sequence”, y una vez aparezca la ventana desplegable escoge “Translate iit select frame (permanent)", 4. La nueva ventana contiene la secuencia de aminodcidos en el c6digo de una sola letra para la protefna Twitchin, Un asterisco al final de la secuencia indica la presencia de un codén de paro. 5, Guarde esta secuencia en la carpeta “Edicion de secuencias” como “protefna Silvestre Twitchin”. . 6. Abra el archivo “unc-22/TcS ORF”. 7. Seleccione en la ventana desplegable Mode “Edit” y dé clic en la secuencia Guerrero Flérez GM, Burbano Figueroa OA Lovaricauy vuil CcUniversidad de Nariio. 2014 _ Manual de Pricticas de Bioinformatica para Biologia Molecular 8. Dé clic en “Sequence”, y una vez aparezca la ventana desplegable escoge “Translate in select frame (permanent)”. 9, La nueva ventana contiene la secuencia de aminodcidos en el cédigo de una sola letra especificado por el mRNA del unc-22 que posee la secuencia del Tc5. 10. Guarde esta secuencia en la carpeta “Edicién de secuencias” como “proteina Mutante Tc5”. 11. Cierre todas las ventanas de edicién de BioEdit. Alineamiento y comparacién de las secuencias Twitchin Una extensién del Dogma Central de la Biologia es que la secuencia primaria de los aminodcidos de una protefna influye en como se plegard en una conformacién que determina su funcién al interior de la célula. En consecuencia, si dos protefnas tienen secuencias de aminodcidos similares es probable, aunque no garantizado de ninguna manera, que su conformacién y en consecuencia sus funciones serdn similares. Una de las primeras cosas que hizo en este ejercicio fue la descarga de la secuencia de la protefna Twitchin a partir de la base de datos GenBank. Los siguientes pasos le permitirén comparar la homologia entre esa secuencia y las secuencias de la proteina Twitchin silvestre y mutada por Tc5 que ha construido, 1. Abra una nueva ventana de edicién y guardela como “Alineamiento de proteinas” 2. Abra cada una de los archivos que contiene las secuencias protefnicas: “protefna Silvestre Twitchin”, “protefna Mutante TcS” y “Twitchin”, que estan en la carpeta “Edici6n de Secuencias”. 3. Copie cada una de estas secuencias y péguelas en la ventana denominada “Alineamiento de protefnas”, Para copiar ejecute la funcién “Ctrl + F8” y para pegar Ja funcién “Ctrl + F9”. 4. Para efectuar la comparacién por homologfa es necesario crear una secuencia consenso, una secuencia que le muestra que aminodcidos son comunes a las tres protefnas, Para ello Dé clic en “Alignment/Create Consensus sequence”. 5, Haga clic en el {cono de la barra de herramientas que presenta bases nitrogenadas agrupadas en columnas denominado “Shade identities and similarities in alignment window”, Ahora observaré cada una de las posiciones en las secuencias proteinicas comparadas a un porcentaje que usted puede determinar en una ventana desplegable denominada “shade threshold”, Seleccione comparacién al 100%. Guerrero Florez GM, Burbano Figueroa OA Lovaricauy vuil CcUnivewidad de Navitio. 2014 Manual de Practicas de Bioinformética para Biologia Molecular 6. Guarde esta comparacién como “Alineamiento de protefnas Twitchin” en la carpeta “Alincamiento de proteinas”, Guerrero Flérez GM, Burbano Figueroa OA 5 | Lovanicauy vu Cc