ei ie REVISTA COLOMBIANA DE QUIMICA, VOLUMEN 38, No. 1 DE 2009 Rex. Colom. Quin, 2009, 38(1):25-42 INDUCCION DE ACTIVIDAD PEROXIDASA Y DE FENOLES TOTALES COMO RESPUESTA DEL FRUTO DE LULO (Solanum quitoense 1.) AL PATOGENO CAUSAL DE LA ANTRACNOSIS INDUCTION OF ROXIDASE AND TOTAL PHENOLS AS A RESPONSE OF LULO (Solanum quitoense L FRUIT TO PATHOGEN CAUSING ANTHRACNOSE INDUGAO DA ACTIVIDADE PERONIDASA E FENOI TOTAIS COMO RESPOSTA DO FRUTO DE LULO (Solanum quitoense L.) AO PATOGENO QUE CAUSA ANTRACNOSE Obradith Caicedo, Blanca L. Higuera’, Sixta Martinez Recibido: 14/10/08 - Aceptado: 04/03/09 RESUMEN Se evalué la induccién de peroxidasa en fratos de lulo con el fin de determinar su participacién en las respuestas bioguimi- ‘cas hacia el patégeno Colletotrichum acu- tatum, causante de la antracnosis. Se esta- blecieron como mejores condiciones para su extraccién y para determinacién de la actividad: buffer fosfatos 100 mM pH 7, 1% SDS y 1% PVPP; sustrato guayacol 15 mM, perdxido de hidrégeno 10 mM, pH 6,5, 55 °C y 30 uL de extracto. Se realiz6 un ensayo in vivo usando frutos verdes, pintones y maduros, inoculados con el hongo 0 con agua estéril. Se deter- miné la actividad peroxidasa a diferentes horas a partir de la inoculacién, encon- trdndose una respuesta diferencial con el tiempo por efecto de la presencia del pa- t6geno, y segiin el estado de madurez de los frutos. En tulos verdes inoculados con el hongo se observé aumento en Ia activi- dad al cabo de 6 y 144 horas, En hulos pi tones no se observ6 efecto notable, mien- tras que en maduros el aumento en actividad fue practicamente a todos los tiempos. Los resultados del contenido de fenoles totales mostraron que hubo acu- mulacién a 96 y 144 horas por efecto del patégeno, para lulos en estado verde y maduro, mientras que para pintones, en los que se presentaron més répido y con mayor severidad los sintomas de la an- tracnosis, no se observé aumento aningu- no de los tiempos. En los frutos mas en- fermos, el cambio en actividad peroxi dasa y en contenido total de fenoles fue ‘menos evidente, por lo que se sugiere una relacién inversa de estos con el desarrollo de la antracnosis. TT Departamento de Quimica, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogut, Bogots, Colombia, Dlgueradgrunal edu.co 25 Organica y BioquimicaPalabras clavé julo, Colletotrichum acutatum, peroxidasa, fenoles, defensa vegetal, Solanum quitoense. ABSTRACT ‘The induction of peroxidase in lulo fruits was evaluated in order to determine its participation in the biochemical respon- ses towards the pathogen Colletotrichum acuratum, which causes the antrachnosis disease. For extraction and activity deter- mination, these conditions were establis- hed as the best: buffer phosphates 100 mM pH 7, 1% SDSy 1% PVPP; substra- te guaiacol 15 mM, hydrogen peroxide 10 mM, pH_6,5, 55 °C and 30 iL of the ex- tract. An in vivo test was developed using unripe, semi-ripe and ripe fruits, inocula- ted with the fungus or sterile water. The peroxidase activity was measured at dif ferent hours starting from the inocu tion, finding a time differential response caused by the pathogen presence and ac- cording to the maturity state of fruits; in unripe lulo fruits inoculated with the fun- gus, an increase of the activity was obser- ved after 6 and 144 hours. In semi-ripe fruits no considerable effect was seen, while in ripe fruits the increase of the acti- vity was found practically at all times. ‘The results of the measured total phenol content, showed accumulation at 96 and 144 hours as a result of the pathogen pre- sence in unripe and ripe fruits, while for semi-ripe fruits, in which the antrachno- sis symptoms were noticed faster and more severely, no phenol increase was found at any time. The less evident chan- ges seen in peroxidase and phenol con- tent, using severely affected fruits by the disease, suggest an inverse relationship 26 between these parameters and the deve- opment of the antrachnosis. Key words: lulo, Colletotrichum acu- tatum, peroxidase, phenolics, Solanum quitoense, plant defence. RESUMO ‘A indugdo da peroxidasa foi avaliada na casca de frutos de lulo coma finalidade de determinar a sua possivel participa reacgdes de defesa contra o patégeno Co- Hetotrichum acutatum, causador da doen- a antracnose. Foram estabelecidas as melhores condigdes para a sua extracy © para medir a actividade da enzima ex- trafda, encontrando-se que com tampao fosfato 100 mM pH 7, 1% SDS y 1% PVPP, substrato guaicol 15 mM, perdxi- do de hidrogeno 10 mM, pH.6,5, 55 °Cy 30. dL de extracto enzimitico se conse- guiram as actividades enziméticas mais elevadas. Foi realizado um ensaio in vivo usando frutos verdes, em processo de ma- duracdo e maduros, inoculados com 0 fungo ou com égua estéril. A actividade peroxidasa foi determinada a diferentes horas a partir da inoculacao encontran- do-se uma resposta diferencial com 0 tempo pelo efeito da presenca ao patége- no e de acordo ao estado de madurez dos frutos. Em tulos verdes observou-se um aumento da actividade nos frutos inocula- dos com 0 fungo 20 fim de 6 € 144 horas. Em lulos em processo de maduracdo, 0 pat6geno nao teve maior efeito, enquanto que em lulos maduros 9 aumento na acti- vidade da enzima, como resposta & pre- senca do patégeno, foi praticamente a to- dos os tempos avaliados. Os resultados do contetido de fendis totais mostraram que ouve uma acumulacao significativa a 96 € 144 horas por efeito da inoculacao com 0REVISTA COLOMBIANA DE QUIMICA, VOLUMEN 28, 1 DE 2009 patégeno para Iulos em estado verde e maduro, enquanto que para os lulos em proceso de maduragio, nos quais se apresentaram mais répido e com maior severidade os sintomas de antracnose, no se observou aumento em nenhum dos tempo avaliados. Nos frutos mais afecta dos pelos sintomas, a mudanca na activi- dade POD e no contedido total de fendis foi menos evidente, motivo pelo qual se sugere uma relacdo inversa de estes com © desenvolvimento de antracnose. Palavras-chave: lulo, Colletotrichum cacutatum, peroxidasa, fenois, defesa ve getal, Solanum quitoense. INTRODUCCION Colletotrichum es wn género de hongos responsable de la enfermedad conocida ‘como antracnosis, la cual constituye tno de los problemas més significativos para Jos agricultores y consumidores. Las an- tracnosis causadas por Colletotrichum son devastadoras y destruyen los alimentos muy répidamente, antes de que los consu- midores puedan usarlos. Unas pocas espe- ccies de Colletotrichum atacan buena parte de los cultivos tropicates y subtropicales, y causa grandes pérdidas por dafio princi- palmente en los frutos. La enfermedad se presenta tanto sobre tejidos y érganos de las plantas en desarrollo, como en las eta- pas de precosecha y poscosecha. En estu- dios realizados por el SENA y la Universi- dad Nacional de Colombia (1), se postula que la antracnosis es la enfermedad mis li- mitante durante la etapa de poscosecha en fnutos. El lulo (Solanum quitoense Lam.), cconsiderado uno de los frutos promisorios para el mercado internacional, es uno de Jos productos atacados por esta enferme- dad, la cual se manifiesta con una mancha circular, de apariencia hiimeda y color ne- gro, que aumenta hasta cubrir gran cantidad del fruto, formando depresiones que posterior- mente se cubren de una ‘masa de conidias color salmén (2). En in. vestigaciones recientes (3) se logré esta blecer que en el fruto de lulo la especie causal de la enfermedad antracnosis es Co- Hetorrichum acutaturn. Para defenderse de los patégenos, las. plantas estan equipadas con una serie de mecanismos de resistencia, entre los cua- les estén diversos arreglos metabélicos que se desencadenan una vez el patégeno entra en contacto con la planta. En alg nos modelos de interaccién hospede- ro-patégeno se ha demostrado el papel de enzimas como peroxidasas, polifenoloxi- dasas y ghicanasas. Las peroxidasas (E.C. 1.11.1.7) no presentan por lo gene- ral actividad anti-fiimgica por sf mismas, pero estén involucradas en respuesta a en- fermedades porque catalizan, entre otras, la oxidacién de fenlicos para la forma- cién de lignina. Estas enzimas se involu cran ademés en reacciones oxidativas de la superficie celular como generadoras de radicales libres y perxido de hidrdgeno, Jos cuales son téxicos para muchos orga- nismos, y por ende, desempenan una fun- én importante en defensa vegetal. Algunos modelos de interaccién hos- pedero-patégeno han aportado evidencias del papel de la enzima peroxidasa como parte de los mecanismos de defensa. En estudios realizados en manzanas se en- contré que el aumento en su actividad es un factor especialmente importante a tra- vés de la lignificacién, la cual esté rela- cionada con la resistencia del fruto frente la infeccién con Penicillium expansum (4). Asi mismo, se ha encontrado que al- a7 Organica y BioquimicaREVISTA COLOMBIANA DE QUIWICA, VOLUMEN 36, No. 1 DE 2008 gunas isoenzimas de peroxidasa estén in: yolucradas en defensa en el modelo papa-Pectobacterium chrysanthemi (5). ‘Aunque hay diversos reportes de inte- racciones hospedero-patdgeno en los que enzimas del tipo peroxidasa han estado involucradas como posible mecanismo de defensa, hasta la fecha no existen reportes conocidos de estudios en el modelo lulo (Solanum quitoense Lam)- Colletotri- chum acuratum, que permitan aportar al conocimiento de esta interaccién particu- lar. Elueidar los mecanismos bioquimi cos en Ia interaccién hospedero-patégeno contribuye al entendimiento de eémo la planta responde a la presencia del hongo, informacién basica para egar a manejar Ja enfermedad antracnosis, limitante en este y otros cultivos. MATERIALES Y METODOS Inéculo y material vegetal Se utilizé un aislamiento del hongo Colle- totrichum acuratum (C. acutarum) propor- cionado por el Departamento de Biologia de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogoté, el cual fue sembrado en me- dio PDA (papa, dextrosa, agar). El inécu- lo se preparé a partir de dicho aislamiento, transfiriendo parte del micelio a medio If- quido papa-dextrosa y manteniéndolo por 7 dias a 17 °C con agitacién (80 pm) en la oscuridad. Posteriormente se filtr6 el mi- celio a través de gasa estéril y se preparé una suspensién de aproximadamente 1x10° conidiasimL. El material vegetal consistié en frutos de lulo (Solanum qui- toense) variedad quitoense, recolectados en tres estados de madurez (verde, pintén ¥y maduro, clasificados segtin su indice de madurez), provenientes todos de una finca 28 semi-tecnificada ubieada en el municipio de Junin (Cundinamarca), situado a 2.300 ‘msn y con temperatura promedio de 17 °C. Una muestra del material vegetal usa- do fue remitida al Instituto de Ciencias Na- turales para su clasificacién, y reposa bajo el No. COL 513823. Seleccién de las condiciones adecuadas para la extraccién de la enzima peroxidasa (E. C. 1.11.1.7) Se planted un disefio experimental cuadra- do latino con el fin de seleccionar wn siste- ma de buffer adecuado para la extraceién de peroxidasa a partir de corteza de frutos de lulo (6). Tomando como base prelimi- nar lo reportado por Cortés (7), se evalua- ron nueve sistemas buffer, los cuales pre- sentaron la composicién que se muestra en laTabla 1. La muestra consisti6 en 500 mg de corteza de lulo, la cual se maceré en presencia de nitrégeno liquido, seguido de tres lavados, cada uno con 3 mL, de aceto- na frfa (4 °C). Las muestras fueron cada vez centrifugadas por 10 min (10000 x g). Sobre el pellet obtenido se evaluaron las diferentes soluciones de extracci6n. A los extractos crudos obtenidos se les midié la actividad peroxidasa con el fin de estable- cer el buffer con el cual se logra la mayor actividad enzimética Seleccién de los pardmetros adecuados para la medida de actividad enzimética peroxidasa Como pardmetros para la medida de actividad se evaluaron: pH (6,0, 6,5, 7,0, 7,5 y 8,0); temperatura (25, 35, 45, 55, 65 y 70 °C); concentracién de guayacol 3,5, 10, 15, 25 y 40 mM); concentracién de perdxido de hidrogeno (8, 9, 10 y 12 mM) y volumen de extracto enzimaticoelo ole REVISTA COLOMBIANA DE QUIMICA, VOLUMEN 38, No. 1 DE 2009 ‘Tabla 1. Caracteristicas de los nueve sistemas evaluados para establecer las condiciones de extrac- ibn de peroxidasa a partir de corteza de lulo, Buffer base: fosfatos de sodio 100 mM pH 7 Buffer* ——— % SDS ‘% PVPP 1 0 02 1 : » 02 s ‘ » 1 1 3 0 1 3 Hi @ 2 1 3 » 2 3 ° Para cada sistema evaluado se cont6 con mueve determinaciones. crudo (10, 15, 20 y 30 uL), teniendo en cuenta lo reportado por Cortés (7). La mezcla de reaccién estuvo constituida por buffer fosfatos 100 mM, guayacol, HO. y extracto enzimético, segtin valores por evaluar. La actividad enzimética se midié realizando un seguimiento espectrofoto- métrico (Genesys UV 10%) a 470 nm du- rante 2 min y se expres como actividad specifica (AAgnm/min*mg de protei- na). Los pardmetros se evaluaron siguien- do un disefio experimental escalonado, es decir, que al evaluar una de las variables, las demas permanecieron constantes. Una vez se establecié cada variable, este valor se utiliz6 para estudiar el siguiente pardmetro. Para cada condicién experi- mental se cont6 con mueve determina cio- nes. CUANTIFICACION DE PROTEINA La cuantificacién de proteina en los ex- tractos enzimaticos crudos se realiz6 por el método de Lowry (8). Se utilizé albi- mina bovina sérica (BSA) como patrén, y cada determinacién se realiz6 por tri- Plicado, Anilisis estadistico Los andlisis realizados a lo largo de la in- vestigacién contaron con nueve determi- naciones para cada muestra. Los resulta- dos obtenidos se analizaron usando anilisis de varianza (ANDEVA) y prueba de rango miltiple (@ = 0,05), usando el programa StatGraphics plus 5.1°. ‘Ensayo in vivo para establecer el comportamiento de la enzima peroxidasa por efecto de la inoculacién con el patégeno C. acutatum Los lulos utilizados para el ensayo in vivo fueron clasificados teniendo en cu como criterio de madurez la relacion °Brix/acidez titulable (indice de madu- 29 imica Organica y Bioqu os p | @rez, IM). Los valores IM para clasificar- Jos como verde, pintén y maduro en esta investigaci6n fueron 1,44, 2,83 y 3,02, respectivamente, Una vez clasificados, se lavaron y desinfectaron con una solucién de hipoctorito de sodio (1%) y se enjuaga ron con agua estéril, Posteriormente se separaron al azar en tres grupos o trata- mientos. El primer grupo, denominado control, se almacené sin ningin otro tra tamiento. El segundo grupo, denominado testigo, consisti6 en lulos a los que se les realiz6 una pequefta incisién (1 em) con bisturi en forma de cruz en dos lados ‘opuestos y se inocularon con 15 aL de agua estéril, y el tercer grupo fue denomi- nado frutos inoculados, a los cuales se les realiz6 herida igual a los testigos pero se inocularon con 15 j«L de la suspensién del hongo. Una vez inoculados, se almacena- ronen frascos de vidrio provistos con una servilleta humedecida con agua (todo el sistema previamente esterilizado) con el fin de mantener una adecuada humedad relativa. Se taparon con vinilpel® y se al macenaron en las mismas condiciones de temperatura (ambiente) y luz (dfa/noche). Se realizaron muestreos de todos los tra- tamientos al inicio y a las 6, 12, 24, 30, 36, 48, 72, 96 y 144 horas, tomando al azar tres frutos por cada tratamiento y por cada estado de madurez, a los que se reti- 16 la corteza en el area de inoculacién (cuadrado de 1 cm de lado). Sobre estas muestras se realiz6 la extraceién y deter minacién de actividad peroxidasa, tenien- do en cuenta los pardmetros establecidos previamente, y se cuantificé protefna. Durante todo el tiempo de muestreo tos frutos fueron observados diariamente para detectar la presencia de algan sinto- ma visible de la enfermedad antracnosis, yy se registré su estado de sanidad general. 30 Evaluacién por electroforesis en geles de poliacrilamida y tincién especifica peroxidasa Los extractos enziméticos obtenidos du rante el ensayo in vivo fueron dializados contra tres cambios de agua desionizada, usando membranas de celulosa (12 kDa), Una vez dializados, se les determind ef contenido de proteina (8). Los extractos seleccionados para los andlisis por elec- troforesis consistieron en muestras en las que se obtuvo induccién de actividad en timitica peroxidasa como consecuencia de la inoculacién con C. acuratum, asi como sus respectivos controles y testigos Se realizé electroforesis en condicio- nes nativas con dichos extract pleando un equipo Mini Vertical Gel System EC 120®. Se usaron geles del 12,5% a 150 V. Se aplicaron voliimenes de las muestras tal que correspondieran todos a 25 ug de proteina. Una vez se so- brepasé el gel de concentracién, se aplicé 100 V durante el gel de separacién. Los geles fueron luego sometidos a tincién es- pecifica para peroxidasa, Para ello se su- ‘mergieron en una soluci6n de o-dianisidi- na 1,8 mM y perdxido de hidrégeno al 1,2% preparada en buffer fosfatos 100 mM pH 6,5 hasta que aparecieron las bandas (9). Posteriormente se sumergie- ron los geles en una solucién de écido acético al 10% em- Determinacién del contenido de fenoles totales Para determinar el contenido de com- puestos fendlicos totales, se tomaron 500 mg de las muestras de corteza y se mace- raron en presencia de nitrégeno liquid. Luego se realizé la extraccién por agita- cién durante 30s con 3 mL de acetona a4REVISTA COLOMBIANA DE QUIMICA, VOLUMEN 38, No. 1 DE 2009 °C. Se centrifugé por 10 min (10000 x g) Yy se retir6 el sobrenadante. Este procedi- iento se realiz6 tres veces consecutivas Los sobrenadantes se reunieron y se al- macenaron en frascos mbar bajo reftige- raci6n (4 °C) para su posterior andlisis. La cuantificacién se realiz6 usando el reactivo de Folin-Ciocalteu’s (10). Cada extracto se llev6 a 10 mL con agua. A par tirde esta soluci6n se tom6un volumen de 300 uL., se le adicion6 200 sl de carbo: nato de sodio (22%), 900 wL de agua y 100 ul. de reactivo, de tal forma que fa concentracién final fue 0,125N. La mez- cla anterior se homogeneiz6 y se ley6 a 500 nm después de 30 min de reaccién, usando un equipo Genesys UV-10°. Se realizaron curvas de calibracién usando Acido gélico como patron en un intervalo de concentracién entre 0 y 25 mg/L. El contenido de fenoles totales se expresé como mg/L de écido gélico por mg de ma- terial vegetal RESULTADOS Y DISCUSION Seleccién del buffer adecuado para la extraccién de peroxidasa Los resultados de actividad enzimética especifica peroxidasa, obtenidos al eva- luar los nueve sistemas de buffer de ex- traccién, se muestran en la Figura 1 ELANDEVA de los resultados indies queel sistema No. 4, compuesto por buf- fer fosfatos 100 mM, pH 7,0, 1% SDS (dodecil sulfato de sodio), 1% PVPP (polivinilpolipirrolidona) y agitacién du- rante 30 min, permiti6 obtener la mayor actividad. Se pudo establecer que existen diferencias estadisticamente significati- vas, al nivel de confianza del 95%, entre el buffer No. 4 y los dems sistemas es- tudiados. Por tanto, se selecciond este como el més adecuado para la extraccién de peroxidasa a partir de corteza del fru- to de lulo. a) $160 * — 140 | € 120 b | s be . g 0 L w& OT me «CO 2 80 I T I S wle t ae 3 h i 3 40 2 2 5 2 = @ 1 30 4 5 6 7 8 9 Buffer de extraccién No. Figura 1 Actividad de peroxidasa en extractos de corteza de llo obtenides empleando diferentes sistemas de ‘extraccin, descritossegtin a Tabla L. Letras dstineasindican diferencias sigaificativas aun nivel deconfianza ‘de 95%, Cada valor es el promedio de nueve determinaciones, 31 Organica y BioquimicaREVISTA COLOMBIANA DE QUIWICA, VOLUMEN 36, No. 1 DE 2008 Seleccién de los parémetros adecuados para la medida de actividad enzimética peroxidasa A partir de las medidas de actividad, ob- tenidas usando las diferentes condiciones experimentales evaluadas, se realizaron graficas de tiempo de reaccién contra ab- sorbancia y se tomé la pendiente de la curva. Con el dato del contenido de pro- 100 et 807 4 0 a so} > ab 40 = Activided AA470mnin*mg protina 60 65 70 78 80 pl 10 ‘0 Actividad AASTO mm/min protean 2 eH ali 33 ws sw ‘Concentracin mM guayacol teina, determinado para cada extracto, se expresé la actividad como actividad especifica. En las gréficas de la Figura 2 se presentan los resultados obtenidos para cada pardmetro experimental evaluado. Con base en los resultados obtenidos, y usando ANDEVA para cada grupo de datos, se logré establecer que los pardme- tros adecuados para la medida de la acti- “Actividad AASTOa/nin ung proto 8 8 On UU UE 3 4 5S SO reevnain, Jw i Fo do i =. « 2 s I 3» { x of Concentracin HLO, mM Figura 2. Actividad peroxidasa obtenida de corteza de lulo utlizando diferentes valores de pH, temperatura, ‘concentracion de perxido de hidrégeno y guayacol. Letras distinas indican diferencias estadisticamente sig. nificativas con un nivel de confianza de 95%, Cada resultado es el promedio de nveve determinaciones, 32REVISTA COLOMBIANA DE QUIMICA, VOLUMEN 28, vidad de la enzima peroxidasa, extraida a partir de corteza de lulo, son: pH 6,5, sustrato guayacol 15 mM, HO, 10mM, yy temperatura 55 °C usando 30 L de ex- tracto crudo, con los cuales se obtuvieron los mayores valores de actividad especitfi- ca. Los parimetros obtenidos fueron, en general, similares a los encontrados en studios previos para lulo en los que el pH fue 6,3 y la temperatura 63 °C (7). Para epinillo se reports pH 7 (11) y para pepi no pH, entre 5,5 y 7,5 (12). La tempera- tura 6ptima tanto en pepino como en pepi nillo se determin6 en el intervalo de 25 °C 45°C. Estudio in vivo: evaluacién de sintomas de antracnosis A Ios lulos inoculados con el hongo, ast ‘como a los hulos testigo y controles, se les realiz6 un seguimiento diario conel fin de cevaluar su estado y la aparicién de los sin- tomas visibles de Ia enfermedad antracno- sis. Los resultados permitieronestablecer que los sintomas caracteristicos, tales como mancha necrética y aparicién del micelio algodonoso sobre la zona de ino- culacién, se presentaron en promedio a las 72 h después de inoculacién, Se pudo determinar también que los lulos en esta- do pint6n fueron los més afectados, se- guidos por los verdes, mientras que los maduros fueron los menos afectados. Los resultados en cuanto a sfntomas de la en- fermedad coinciden con lo reportado por Cerén (3), quien encontré que en los pin- tones la incidencia del hongo C. acutatum fue mayor. Ni los frutos control ni tos tes- tigos presentaron evidencia alguna de sin- tomas de la enfermedad durante el tiempo de la evaluaci6n de estos. 1 DE 2009 Estudio del comportamiento de la ‘enzima peroxidasa en frutos de lulo (Solanum quitoense Lam) por efecto de C. acutatum durante la interaccién fruto-patégeno Enla Figura 3a se observa la variacién de actividad de la enzima peroxidasa en ex- tractos crudos obtenidos de lulos en es do verde, como respuesta a la inoculacién con C. acwatum y su comparacién res- pectiva con los controles. Los resultados mostraron un aumento muy notable a 144 horas, correspondiente a cuatro veces el valor obtenido para el control, induceién que se puede atribuir a la presencia del patigeno, dado que en los inoculados con agua el valor fue considerablemente més bajo, hecho que permite descartar que tal aumento se trate de una respuesta al estrés causado por la herida. Este tipo de com- portamiento ha sido demostrado en algu- nos modelos de interacciones, en los que se ha encontrado aumento significative de actividad peroxidasa como respuesta del hospedero frente al ataque de un patgeno (4). Dicho aumento se ha correlacionado con frecuencia con el incremento en el contenido de compuestos fendlicos y de lignina, la cual forma parte de la defensa pasiva del hospedero, ya que es un m nismo mediante el cual se refuerza la pa- red celular para impedir la invasién del patégeno y que conlleva la intervencién de diversas peroxidasas. ‘También fue obtenido un aumento sig~ nificativo de actividad por efecto de la presencia del pat6geno al tiempo inicial y 6h, lo que se constituye en una indue- cin temprana de la actividad peroxidase aunque la magnitud de este aumento no fue tan alta como la obtenida a 144 h en frutos inoculados. Por otro lado, a 36h y 33 Organica y BioquimicaSTA COLOMBIANA DE QUIWICA, VOLUMEN 38, No. 1 DE 2008 a bo] by we 280 i di i i Sika (Ma i a ik i a iconic MTesigo Milnelads cone ago «Lalo maura dituaa ddd ‘Tempo Giconrot —MTesigo —— Mitoceuado cont bongo ‘Figura 3. Variacion de ia actividad peroxidass en corteza de lulos a. verdes, b. pintones y e. maduros durante al ayo in vivo, Letras distintas indican diferencias estadisicamente significaivas para ead tiempo 0,05). Cada dato es el promedio de nueve medidas, 34REVISTA COLOMBIANA DE QUIMICA, VOLUMEN 28, 1 DE 2009 48 h también se present6 ineremento de la actividad en los frutos inoculados con el hongo. Sin embargo, este aumento es es tadisticamente significativo tinicamente frente al testigo (inoculado con agua), ya que con respecto al control no existe dife- rencia alguna. Por ello, el aumento a es tos tiempos no se puede correlacionar de manera clara con respuesta al hongo. Las evidencias indican que el fruto verde ma- nifest6 un comportamiento diferente ante los distintos tratamientos 2 los que fue so- metido, y es probable que el aumento de actividad observado con el tiempo en los frutos control pueda ser producto del pro: ceso metabélico que continta desarro- Iéndose, por ejemplo de maduracién, tal ‘como se ha reportado en la literatura (7) En la Figura 3b se observa el compor- tamiento de la actividad peroxidasa en I- Jos pintones durante el ensayo in vivo. En los lulos testigo e inoculados con el hon- g0, se evidencié un incremento de la acti- vidad en el tiempo inicial y a 6 h, el cual se puede asociar con una respuesta al es- trés producido por la herida. Este com- portamiento ha sido ampliamente docu- mentado en la literatura (13). Se conoce que, como respuesta de las plantas a dife- rentes tipos de estrés, ya sea bidtico o abidtico, se genera acumulacién de H:0:, el cual inicia un proceso de seftalizacién que involuera activacién de enzimas, ex- presién de genes, muerte celular progra- mada y dafio celular. Para este estado de madurez no se encontraron cambios en la actividad comparables con los que se pre- sentaron para hulos en estado verde a 144 h. En promedio, la inoculacién con el pa- tégeno no tuvo mayor efecto en la activi- dad peroxidada, y se observé més bien una disminucién en las magnitudes de la actividad enzimética con el tiempo, para Jos tres tratamientos. El comportamiento de la actividad de Ja enzima peroxidasa durante el ensayo in vivo en lulos maduros se muestra en la ‘igura 3c. Los resultados indicaron que, en general, hay una induccién significati- va de la enzima atribuible a la inoculacién con el patégeno, dada la diferencia con el testigo. El aumento fue significative al tiempo inicial, 6, 24, 30, 48, 72 y 144 h. La mayor induccién se observé a 48 h, con un aumento de casi cuatro veces con respecto al testigo. En promedio, la acti- vidad fue mayor a los mayores tiempos de muestreo, a diferencia de lo observado con los frutos pintones, en los que dismi- muy6, en general, con el tiempo. Este comportamiento podria estar relacionado con el proceso mismo de maduracién, ya que, como se ha reportado en estudios previos (7), la actividad peroxidasa en corteza de lulo a temperatura ambiente aumenta, especialmente hacia el maximo climatérico, es decir cuando el fruto al- canza su estado 6ptimo de madurez. En el modelo objeto de nuestro estu- dio, hulo- C. acutatum se puede postular, con base en los resultados obtenidos, que hay respuestas diferenciales a la infeceién con el hongo en términos de induceién de Ja enzima peroxidasa, Una vez que se es- tablecen diferencias en la actividad de una enzima por efecto de un patégeno, como es este caso, resulta interesante determi- nar si esta se relaciona con la inhibicién del desarrollo de la enfermedad, es decir, con reacciones de defensa del fruto, Para ello es necesario avanzar en la investiga- cién del modelo, estableciendo si el no desarrollo de sfntomas se debe, por ejem- plo, a la formacién de estructuras de de- 35 Organica y Bioquimica