TEMA-22.

ASPECTOS CLÍNICOS DE LA ENZIMOLOGÍA

1. Determinación de actividades enzimáticas para el diagnostico clínico
Mejor conocimiento molecular metabolismo Desarrollo de métodos de análisis enzimáticas

2. Herramientas analíticas
Purificación de enzimas

3. Terapia enzimática
Industria Biotecnológica

8. Inhibidores enzimáticos (Fármacos)
Conocimiento estructural y funcional

1. Determinación de actividades enzimáticas para el diagnostico clínico a) La enzima debe estar presente en fluido biológico b) La enzima debe ser fácil de ensayar y automatizar la medida c) Los valores de actividad entre individuos sanos y enfermos deben ser significativos y debe haber buena correlación con los valores patológicos. d) La enzima debe ser estable

Tipos de fluidos:

Suero (Más común) y Orina

LCF, Pleura, Sinovial, etc

lipasas. Proliferación Celular (Neoplasia) Aclaramiento renal deficiente . etc. Amilasas. metabolismo de lipoproteínas.000 veces daño en el musculo.SUERO 1. etc 2. Enzimas intracelulares. fosfatasas. Ej. Enzimas no específicas Enzimas que son secretadas por los tejidos. Enzimas específicas Enzimas su función radica en el plasma Ej Enzimas de la coagulación. activación del complemento. Daño Tisular Creatin quinasa 50.

. aminopeptidasa.Isoenzimas (LDH.Patrón de enzimas característico . Acetilcolinesterasa (eritrocitos) . Creatin quinasa. fosfatasa ácida. Adenosina deaminasa.. adenilato ciclasa.DIAGNOSTICO Enzima específica de tejidos (Raro) -Abundancia relativa Fosfatasa ácida (prostata). Ciencia forense:. etc.

ENZIMOLOGIA CLÍNICA DEL INFARTO DE MIOCARDIO Pruebas enzimáticas : Evidencia de la producción de un infarto Seguimiento del progreso y la recuperación tras cirugía Creatina Quinasa Aspartato aminotransferasa Lactato deshidrogenasa Valor en plasma Concentración en tejido Velocidad del vertido Grado de degradación Vida media 10 –130 horas Creatina Quinasa mas específica Test depende del tiempo del infarto LDH se puede diferenciar por electroforesis .

Creatina quinasa Músculo esquelético Músculo cardiaco (Mayor concentración) Cerebro No en el hígado Proteína dimérica: Hay dos tipos de monómeros M y B Músculo M-M (99%) y M-B (1%) Corazón MM (80-70%) y M-B (20-30%) Cerebro B-B (100%) M-B (Actividad Total apenas cambia) Inmunoblotting (B) Pequeño Infarto .

85 Normal >1 Enfermo Transaminasas (ALT y AST) Se utilizan poco actualmente Hígado AST/ALT (3-5) Corazón AST/ALT (20-25) .Lactato deshidrogenasa Hígado. Corazón Inmunoblotting LDH-1 Uso de sustratos específicos LDH1/LDH2 = 0.

glutation transferasa.ENZIMOLOGIA CLÍNICA DE ENFERMEDADES HEPÁTICAS Aspartato aminotransferasa (AST ó GOT) Alanina aminotransferasa (AST ó GPT) Fosfatasa alcalina γ-Glutamil transferasa Otras: Lactato deshidrogenasa. etc Transaminasas Fosfatasa alcalina 4-nitrofenil fosfato Visible γ-Glutamil transferasa Enfermedades hepáticas Crónicas Agúdas Intermitentes Hepatitis Cirrosis Tumores Obstrucción del conducto biliar .

USO DE LAS PRUEBAS ENZIMOLÓGICAS -Diagnóstico de enfermedades -Seguimiento de tratamientos con fármacos (Higado metaboliza drogas) -Seguimiento de operaciones hepáticas TRANSAMINASAS No específicas del plasma Células parenquimales Hepatitis.2-0. Osteoblastos ISOENZIMAS Daños en las células del conducto biliar Ratio Fosf. cirrosis Necroticas (Hepatitis.Alc/Transaminasas Hepatitis 0. cirrosis) Progreso de la enfermedad Vertido al plasma FOSFATASA ALCALINA No específicas del plasma Superficie sinusoidal del células hepáticas y del conducto biliar.6 Obstrucción del 10-20 conducto biliar .

γ-GLUTAMIL TRANSFERASA Alcoholismo crónico Cirrosis Incremento síntesis y en la secreción GLUTATION TRANSFERASA Cataliza reacciones de destoxificación utilizando glutation Carcinogénicos Agentes de quimioterapia Paracetamol Xenobióticos Contenido alto 5% Vida media corta 90 min Marcador muy rápido y sensible de daño hepático Tiempo de la Protrombina Función hepática Tiempo requerido para la activación de la protrombina en Trombina Indica grado de funcionamiento hepático Factores de la coagulación están producidos en el hígado y secretados a la sangre Trombina Cataliza el proceso de coagulación .

cardiaco. ejercicio intenso. daño cerebral. infarto de miocardio.OTRAS ENZIMAS DE INTERES CLÍNICO α-AMILASA Páncreas Glándulas salivares Suero normal Baja actividad Suero enfermo Pancreatitis aguda Gran Aumento (20-30) Diagnóstico es complicado sin la medida de la amilasa Suero enfermo Pancreatitis aguda Gran Aumento (20-30) Amilasa detección en orina debido a bajo Peso Molecular CREATINA QUINASA y FRUCTOSA BIFOSFATO ALDOLASA Indicadores de desordenes en la musculatura esquelética Creatina quinasa Músculo esquelético. Cerebro Distrofia muscular. Daños en el músculo. etc ISOENZIMAS Fructosa bifosfato aldolasa Músculo esquelético (otros tejidos) Significado clínico menor Precaución (contaminación Glb rojos) .

eritrocitos. etc Diagnostico de carcinoma de Próstata Precaución en el muestreo . Hígado.Contaminación con FA de eritrocitos Diferenciación isoformas . Pirofosfatos inorgánico (substrato) No estrictamente Isoenzimas Placenta Modificaciones Postraduccionales Diferenciación Electroforesis muy complicado Uso de inhibidores.Uso de inhibidores específicos: Formaldehido . Calor FOSFATASA ACIDA Localización Hígado.Lábil .Sensibilidad sustratos .FOSFATASA ALCALINA Diagnóstico de obstrucción del conducto biliar Enfermedades de huesos Incremento actividad en células formadoras de huesos (Osteoblastos) Osteomalacia Raquitismo Hiperparatiroidismo Enfermedad denominada hipofosfatasia Actividad Crecimiento cristales de hidroxiapatito Osteoblastos. PROSTATA. Intestino.

Tripsina. etc .2. Hexoquinasa Inmoviliza en las paredes del tubo Análisis en continuo Inactivación de las enzimas. Presencia de inhibidores. HERRAMIENTAS ANALÍTICAS: USO DE ENZIMAS PARA ESTIMAR LA CONCENTRACIÓN DE METABOLITOS Uso de la enzima para transformar un metabolito en un producto el cual se pude determinar analíticamente Ventajas La enzima es muy específica Metabolito determinado en presencia de otras sustancias Evita la purificación necesaria en un análisis químico Sustancias lábiles Inconvenientes El costo de la enzimas Inmovilización Ureasa.

Puntos importantes para utilizar una enzima La posición del equilibrio de la reacción. Glutamato deshidrogenasa 2. Ej. Pureza enzimática (reacciones colaterales) . La especificidad de la enzima debe ser conocida 4. Deber ser unidirecional y rápido Equilibrio no favorable a) Acoplando la reacción a otra reacción enzimática b) Trampas químicas. 3. Utilizar gran cantidad de enzima Depende de la Vmax y de la Km.1.

Hexoquinasa acoplada con Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa NADPH Cambio 340 nm Especificidad segundo paso Visible (Más utilizado) Más interferencias productos sangre 2. Glucosa oxidasa acoplada con Peroxidasa 3. Glucosa deshidrogenasa Determinación de ácido úrico Diagnóstico de la gota Método químico y enzimático Actualmente sólo se utiliza el enzimático Absorbancia (293 nm) Alantoina.Determinación de glucosa Test tolerancia a la glucosa Metabolismo de la glucosa Métodos enzimáticos 1. Consumo de O2 Acoplado a peroxidasa (H2O2) Falta especificidad .

obstrucción biliar. etc . contaminante Esteresa Colesterol oxidasa Peroxidasa Absorción a 500 nm Trigliceridos Seguimiento: Diabetes Mellitus. Nefrosis. NH4 Acoplado con glutamato DH Evaluar el riesgo de arterioesclerosis y de infarto de miocardio Método químico (colorimétrico) No específico.Determinación de urea Test de la función renal: Suero y orina UREA Capacidad de filtración glomerular NADH Ureasa Colesterol Determinación de colesterol y trigliceridos Carbonato amónico.

Otros metabolitos Creatina Creatina quinasa. Piruvato quinasa y Lactato deshidrogenasa Amonio Glutamato deshidrogenasa Tiamina difosfato en eritrocitos Ensayo enzimático usado para detectar una deficiencia en vitaminas Ensayo diagnostica deficiencia en vitaminas Malnutrición Encefalopatía de Wernicke´s Transquetolasa Sujetos normales: Actividad no cambia al añadir Tiamina Enfermos : Actividad al añadir Tiamina .

Fácilmente cuantificables Peroxidasas Fosfatasas. drogas. etc Virus. anfígenos frente a microorganismos patógenos. anfetaminas opiáceos.proteínas. etc Anticuerpos son unidos a una enzima: Identifican con un anticuerpo. . etc.ENZIMA INMUNOENSAYO Método indirecto para determinación de metabolitos. enzimas usadas para amplificar la señal Hormonas. cocaína.

Terapia enzimática Principales áreas de trabajo . Tratamiento de insuficiencia pancreática (Fibrosis cística) utilizando proteasas inmovilizadas Forma de administración Eliminación de metabolitos (sangre) Endógena: Estreptoquinasa Exógena: Ureasa Bilirrubina oxidasa Posibilidad de usar enzimas inmovilizadas . Hialuronidasa). Eliminación de coágulos usando Estreptoquinasa. Bromelaina.Cáncer Degradación de tejidos necróticos usando enzimas proteolíticas (Tripsina.Eliminación de sustancias tóxicas de la sangre . etc. quimiotripsina.Enfermedades genéticas . Uroquinasa.3.

Tratamiento enzima de placentas humanas Alto coste Enzimas recombinantes Pancreatitis Extros pancreáticos (lipasas. Mucosidad espesa . óseas. amilasas. etc Conducto pancreáticos bloqueado Igual que pancreatitis Tubos bronquiales Desosiribonucleasa (Mucosidad ADN y mucopolisacaridos). etc) Microencapsulados pH 6 liberan Fibrosis cística Defecto genético proteína transmembrana (1/2000). Xeroderma pigmentoso Defecto genético Individuos muy sensibles a la radiación UV Defecto mecanismo reparador del ADN Tratamiento enzimas reparadoras del ADN Aplicación tópica con liposomas . pulmones. Deficiencias enzimáticas Enfermedad de Gauchers Glucosilceramidasa Acumula un glucocerebrosido en los macrófagos Macrofagos no funcionales Anormalidades hepáticas. y hematológicas. estómago. proteasas.Tratamiento de Enfermedades genéticas Enfermedades metabólicas.

microbiológica genera problemas de rechazo. Glutaminasa Serina hidratasa Fenilalanino amonio liasa Leucina dehidrogenasa Experimentación posibles agentes anticancerígenos Ciertos tipos de cáncer no tienen la capacidad de sintetizar aminoácidos y los obtienen del suero . animales y bacterias Ausente del suero de los mamiferos Tratamiento en combinación con quimioterapia Fuente es humana.Cáncer Asparraginasa hidroliza la asparragina Leucemia aguda limfoblástica Leucemia aguda granulocítica Tumores Necesitan asparragina Enzima en plantas.

Drogas anticancerosas inhiben etapas específicas de vías metabólicas Metrotrexato análogo estructural del ácido fólico dihidrofolato reductasa No se produce tetrahidrofolato Síntesis ADN EVITAR TOXICIDAD EN CELULAS NO CANCEROSAS Terapia enzimática prodroga dirigida por anticuerpos ADEPT Terapia enzimática prodroga genética dirigida GDEPT La enzima usada para activar la prodroga es dirigida hacia el tumor en la forma de un gen unido a un vector .Activación de prodrogas Prodrogas son drogas químicamente modificadas y permanecen inactivas hasta que son específicamente activadas.

Fenilcetonuria Fenilpiruvato Biopsia del tejido y medida de la actividad Pruebas en el ADN . DETECCIÓN Y SIGNIFICADO DE DEFICIENCIAS ENZIMÁTICAS Deficiencias enzimáticas debido a problemas genéticos Más de 400 deficiencias Identificación de un metabolito Ej.4.

FENILCETONURIA Déficit de la Fenilalanina 4-mono-oxigenasa Retraso mental Prevención dieta Detección precoz es muy importante .

INHIBIDORES ENZIMÁTICOS (FÁRMACOS) Inhibición de la hidroximetilglutaril CoA reductasa Hipercolesterolemia familiar Niveles de colesterol en sangre Inhibición de la xantina oxidasa Gota Xantina Niveles de ácido úrico Ácido úrico Metabolismo de las Purinas Alopurinol Aloxantina SUSTRATO SUICIDA Inhibidor muy fuerte de la X. Oxidasa .

Inhibidores antiretrovirales nhibidores de la proteasa. Necesarios para completar su proceso de replicación dando lugar a nuevos virus Dimero de 99 aminoacidos . Enfermedad: HIV-1 causante del SIDA. Enzima proteasa cataliza la ruptura de la poliproteína que encápsula el virus.

Hidrólisis ácido-base: Aspartico proteasa Centro activo en el centro de la molécula Inhibidores análogos del substrato Cambio en el enlace peptídico por un isoester .

etc Terapia enzimática Tecnología de ADN Estudios estructurales Diseño de inhibidores . Inmunoensayo. Radioinmunoensayo.Conclusiones Medida de actividades enzimática en diagnóstico clínico Enzimas estimación de metabolitos Equipamiento más sofisticado gran automatización Variedad de enzimas puras: Tecnología de ADN Procesos tecnológicos: Inmovilización.

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