LABORATORIO DE BIOQUIMICA I INFORME #5 EFECTO [S] SOBRE LA VELOCIDAD DE LA REACCION CATALIZADA SOBRE LA ENZIMA UREASA.
AUTORES:
Franco Bravo Gustavo
Reyes Sosa Yajaira
Carriel Angie
Ramon Sandy
GRUPO: G1-B
DOCENTE: Msc. Nilda Cedeño Albán
FECHA: 01/08/2017
CICLO: 2017-2018
1. Titulo
Efecto [s] sobre la velocidad de la reacción catalizada sobre la enzima ureasa.
2. Marco teórico
Ureasa
La ureasa, cuyo nombre sistemático es amidohidrolasa de urea, tiene un peso
molecular de 483 000 Dalton. La ureasa consta de 6 subunidades estructurales iguales. Es una enzima muy específica, que existe en varios tipos de vegetales, por ejemplo, en el frijol de soya. La ureasa se utiliza mucho como agente catalítico para la medición cuantitativa de urea. El hidróxido de amonio que se forma puede titularse y puede relacionarse, estequiométricamente, con la cantidad de urea presente en una muestra. Aunque la ureasa no es muy común en la naturaleza, esta enzima ha tenido más importancia en el desarrollo de la enzimología moderna que ninguna otra. Las investigaciones sobre la ureasa han permitido deducir el principio importante en las reacciones enzimáticas: la función de los grupos SH (sulfhídrico) en la catálisis. La ureasa posee 3 o 4 grupos activos, es una representante de un gran número de enzimas cuya actividad depende de la existencia de grupos SH, intactos, procedentes de cisteínas que forman parte de la cadena poli peptídica de la enzima.
Reacción catalizada por la ureasa:
La ureasa, de acuerdo con la clasificación internacional de enzimas, pertenece al grupo de las hidrolasas un ejemplo es el anterior.
Indicador de pH: Rojo fenol, a) acido: color amarillo, pH 6.8 b) alcalino: color rosado rojo, pH 8.4 El indicador de iones hidrogeno rojo fenol muestra la producción de ureasa por los miembros de la subfamilia Protege mediante la demostración disminuida de la concentración de iones hidrogeno a causa de la formación de dos moléculas de amoniaco.
Para inhibir la acción de la ureasa, se utiliza el cloruro de mercurio (II). En el sitio
catalítico, la ureasa presente presenta grupos –SH (sulfhídrico), provenientes del aminoácido cisteína que forma parte de su cadena peptídica. El cloruro de mercurio se une irreversible a los grupos –SH, los inactiva y así, se detiene la actividad enzimática de la ureasa
Las enzimas son proteínas que aceleran la velocidad de la reacción química en
nuestro organismo, con excepción de los ribosomas (que son poli nucleótidos con actividad catalítica). La actividad enzimática, definida como cantidad de producto formado o cantidad de sustrato degradado por unidad de tiempo, es afectada por una serie de factores tales como:
Temperatura El pH La concentración de sustrato La concentración de enzima
Efecto de la temperatura sobre la actividad de la ureasa
Para toda enzima una temperatura optima de actividad, a la cual la velocidad de reacción es máxima. A temperaturas debajo de esta temperatura, la frecuencia de choques entre la enzima y el sustrato es baja y, por tanto, la velocidad de reacción también lo es. Conforme se incrementa la temperatura, aumenta la frecuencia de choques y se favorece la velocidad de reacción (la formación del producto). Pero si la temperatura es muy elevada, pueden romper la estructura de Vander Waals y los puentes de hidrogeno que estabilizan la estructura terciaria y cuaternario de las enzimas, como consecuencia, se produce su desnaturalización y la perdida de la actividad enzimática. Efecto del pH sobre la actividad de la ureasa La estructura tridimensional de una enzima de origen proteico determina su sitio catalítico y, por lo tanto, su actividad. Dicha estructura se encuentra estabilizada por una serie de enlaces no covalentes (hidrofóbicos, puentes de hidrogeno, atracciones electrostáticas) y covalentes (puentes de disulfuro) que existen entre los grupos R de los aminoácidos que no son neutros (como el aspartato, la lisina, la arginina y el glutamato), e interfieren con las atracciones electrostáticas y su estabilidad estructural tridimensional, lo que provoca una pérdida total o parcial de la actividad enzimática. Para cada enzima existe un pH óptimo en relación con la actividad, el cual varía según la región celular en que se encuentre dicha enzima: por ejemplo, el pH dentro del lisosoma o en el estómago es alrededor de 2 (y ese es el pH óptimo de las enzimas allí localizadas), mientras que las enzimas presentes en el plasma o en el duodeno tienen un pH óptimo de actividad entre 7.0 y 8.0. La ureasa actúa en los compuestos a nivel de los puentes C-N excepto en aquellos que contiene puentes peptídicos. El pH óptimo para la actividad de la ureasa es de 7. Efecto del tiempo de reacción en la cantidad de urea hidrolizada En toda reacción enzimática, la enzima no es consumida ni sufre modificación alguna, de manera que puede continuar transformando otra molécula de sustrato en producto. Por lo tanto, si se garantiza que la concentración de sustrato no será un elemento limitante (es decir, que no se agotará), a mayor tiempo de reacción, mayor será la formación del producto o de la degradación del sustrato. Efecto de la concentración de enzima sobre la actividad enzimática En todas reacciones enzimáticas, si se incrementa la concentración de enzima, se forma mayor cantidad de productos por unidad de tiempo. EL incremento en la velocidad de reacción es directamente proporcional al incremento en la concentración de enzima, siempre y cuando la cantidad de sustrato no sea limitante, es decir, que el sustrato no llegue a agotarse. CINÉTICA ENZIMÁTICA: EL COMPLEJO ENZIMA-SUSTRATO. Los enzimas actúan de acuerdo con los mismos principios generales que los demás catalizadores: aumentan la velocidad de las reacciones químicas combinándose transitoriamente con los reactivos de manera que estos alcanzan
un estado de transición con una energía de activación menor que el de la reacción
no catalizada. Hay que destacar sin embargo que los enzimas son mucho más eficaces que cualquier catalizador artificial conocido. Se ha podido comprobar que los aumentos de velocidad que producen son de entre 107y 1014 veces la velocidad de la reacción no catalizada. La actividad molecular (número de moléculas de sustrato transformadas por una sola molécula de enzima por minuto) de distintos enzimas oscila entre unos pocos miles y varios millones de moléculas de sustrato por minuto. Cabe preguntarse pues, cómo consiguen los enzimas aumentos tan espectaculares en la velocidad de las reacciones químicas que catalizan.
3. Fundamento de la práctica.
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por
enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especificad del enzima. La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc., y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos.
4. Objetivo general Determinar la velocidad de la reacción catalizada por el enzima ureasa. 5. Objetivos específicos Analizar los efectos al colocar diferentes volúmenes durante la reacción catalizada por la enzima ureasa.
Calcular la constante de Constante de Michaelis-Menten (Km).
6. Procedimiento
Sustrato (urea 0,1 0,2 0,3 0,4 0,6 0,8 1,0 ------ 0,25M) Buffer (7,2) 0,9 0,8 0,7 0,6 0,4 0,2 ----- 1.0ml MEZCLAR – BAÑO 37° C / 3min Ureasa 50 50 50 50 50 50 50 50ml MEZCLAR – BAÑO 37° C / 5min Fenol 1 1 1 1 1 1 1 1ml Hipoclorito 1 1 1 1 1 1 1 1ml MEZCLAR – BAÑO 37° C / 5min Retirar los tubos del baño y añadir a todos los tubos 2ml H2O, Mezclar, leer las Abs, a 540nm frente al blanco.
7. Resultados
Datos para elaboración de la curva de Michealis-Menten
8. Conclusión: Podemos concluir que la velocidad de la reacción catalizada por la enzima ureasa varía dependiendo de la cantidad de sustrato y enzima que se agregue teniendo en cuenta que la temperatura y pH son factores principales.
9. Aprendizaje:
Aprendimos a calcular la acumulación de sustrato que se necesita para alcanzar la
velocidad máxima con la fórmula de Km. También aprendimos a elaborar la curva de velocidad enzimática de Michealis- Menten y a linealizarla mediante el teorema de Lineweaver-Burk.
