PRÁCTICA N° 02

INDUCCIÓN DE FIEBRE UTILIZANDO UN MODELO EXPERIMENTAL DE

INFECCIÓN POR E. Coli EN RATAS

1. INTRODUCCIÓN:
A lo largo de la historia se han utilizado animales de experimentación para crear
distintos modelos que ayuden a comprender las causas, diagnóstico y
tratamiento de enfermedades que afectan al humano y a los propios animales.
También han servido como aporte a la docencia biológica, desarrollo, producción
y control de medicamentos y alimentos (1).

En el contexto de la sepsis/shock séptico existen una gran cantidad de modelos

animales que intentan replicar la fisiopatología de la sepsis humana. Sin
embargo encontramos importantes diferencias entre ambas especies y el
desarrollo del proceso séptico normalmente no reproduce las condiciones de la
sepsis humana. En primer lugar, la sepsis en humanos es una patología de
presentación paulatina e insidiosa y en los animales la sepsis suele ser mucho
más aguda (2).

En segundo lugar, la intervención experimental sucede en las etapas tempranas

de la sepsis, cuando todavía los niveles de citocinas inflamatorias están
elevados y el daño orgánico y vascular es mínimo, a diferencia del ser humano,
donde la intervención terapéutica habitualmente se produce cuando la respuesta
de las citocinas proinflamatorias está cambiando a antinflamatorias y el daño
orgánico ya es aparente.

En tercer lugar, es habitual que la población susceptible en humanos sea en los

extremos de la vida (niños y adultos mayores), en cambio los animales que se
utilizan para experimentación son adultos jóvenes sin otras comorbilidades. En
cuarto lugar, los animales en la mayoría de las modelos no reciben un
tratamiento de soporte completo que incluya la ventilación mecánica,
fluidoterapia, fármacos inotrópicos, antibioterapia, soporte nutricional enteral o
parenteral y terapia renal sustitutiva. Por último, el tiempo transcurrido desde el
comienzo de los síntomas hasta el fallo orgánico es mucho más corto en
modelos animales, en los que el proceso se concentra en unos pocos días. En
humanos el tiempo transcurrido hasta el fallo orgánico suele ser de semanas.
Todo esto afecta severamente a la evaluación de las terapias farmacológicas
anti sepsis (3).

Y de aquí que no exista un modelo idóneo, cada modelo presenta ventajas y

desventajas en función del parámetro que se desea estudiar y el animal de
experimentación empleado. Uno de los modelos de experimentación animal más
utilizada es el creado a partir de la inyección, tanto local como sistémica de
bacterias vivas, con frecuencia Escherichia coli o de productos bacterianos o
endotoxinas como los lipopolisacáridos (LPL) (4).

El uso de endotoxinas presenta una gran cantidad de limitaciones en roedores,

siendo la principal, la elevada dosis necesaria para producir un estado de shock,
que es entre 10 y 100 veces superior a la necesaria en humanos. Por otro lado,
existen diferencias en la clínica que la endotoxina induce en roedores y en
 humano (5,6). Otros modelos se generan a partir de la manipulación del intestino
y el vertido de contenido fecal a la cavidad peritoneal generando una peritonitis
polimicrobiana y como consecuencia una respuesta inflamatoria sistémica.

2. OBJETIVO GENERAL:
En esta práctica el estudiante comprenderá los mecanismos fisiopatológicos de
la fiebre en un cuadro infeccioso por E. coli.

3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

• Comprender los procedimientos básicos en la replicación de un modelo

experimental.
• Comprender los mecanismos fisiopatológicos de la fiebre en un cuadro
infeccioso producido por E. coli.
• Comprender el manejo de animales de experimentación en modelos
experimentales

4. COMPETENCIA A DESARROLLAR:
Comprende en los procesos fisiopatológicos de la fiebre a través de un modelo
experimental de infección por E. coli en ratas.

5. MATERIALES A UTILIZAR:

• 9 Ratas Sprague-Dawley.
• E. coli 1010 UFC (unidades Formadoras de Colonias)
• Micropipeta
• Jeringa graduada 1ml
• Vaso de precipitado
• Agitador de vidrio
• Mascarilla
• Guantes de látex
• Mandil o bata
• Zapatos cerrados
• Cofia

6. METODOLOGÍA

Experimental y participativa.

7. DESCRIPCION DEL DESARROLLO DE LA PRÁCTICA:

Los estudiantes se dividirán en 4 mesas de trabajo y leerán con detenimiento el
procedimiento de la presente práctica y al finalizar serán evaluados mediante
cuestionario planteado en la presente guía.

Desarrollo de la práctica.

Se utilizan ratas Sprague-Dawley®, machos de 5 semanas de edad, con peso

entre 270-280 g.
a. Preparación de animales de experimentación
Todos los animales deben estar sanos y no recibir tratamiento previo. Los
animales se deben mantener con comida y agua ad libitum (a disposición), con
un ciclo 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, y una temperatura ambiente
de 22±2ºC con una humedad relativa del aire del 50-70% y con 15-20
renovaciones/hora sin recirculación de aire.
Deben permanecer en grupos ninguno en solitario, para favorecer el
comportamiento grupal de los mismos.

Aclimatación, se mantienen una semana en las condiciones ambientales

mencionadas anteriormente para permitir su aclimatación antes de la ejecución
del presente modelo experimental.

b. Distribución de grupos de experimentación

Distribuir animales de experimentación en tres grupos. Se realiza un marcaje
mediante tatuaje temporal o permanente en la cola de las ratas, para poder
hacer el seguimiento individual del estado de bienestar de cada una de ellas.
Grupo I (N=3),
Grupo II (N=3),
Grupo III (N=3).

c. Preparación del inóculo

Extraer con ayuda de micropipeta graduada 1cc de E. coli 1010 UFC, diluir en
un vaso de precipitado con 10 ml de agua destilada, mantener por 1 hora a una
temperatura de 20-25°C para su incubación.

d. Administración de inóculo
Se realiza inyección intraperitoneal 1ml del inóculo a los grupos I, II y III
conformados previamente.

Preparación de materiales
Colocarse los guantes de látex.
Cargue 1 ml de solución de inóculo en la jeringa de 1ml.

SUJECION E INMOVILIZACIÓN.
El animal de experimentación debe ser sujetado de la siguiente manera:
1. Realice una pinza en la base de la cola con el dedo meñique y la palma de la
mano.
2. Luego se debe tomar el pliegue cutáneo dorsal del cuello con los dedos índice
y anular. En este procedimiento el animal debe ser dirigido desde la cabeza
en dirección ventral, para garantizar que las vísceras intestinales se desplacen
hacia el tórax y disminuya el riesgo de perforar el intestino.

Imágenes referenciales.

Ubicación de la aguja-jeringa:
1. Realizar el procedimiento de inmovilización
2. Sujetar la jeringa con la mano libre. Para ello debe tomar la jeringa con los
dedos índice y anular en dirección latero medial
3. El dedo pulgar debe ubicarse en el mango del embolo. Con esta ubicación se
debe observar que el embolo de la jeringa este hacia arriba, así la aguja-
 jeringa debe dirigirse en ángulo de 45 grados con relación al aspecto ventral
del animal.
4. Se traza un cuadrante abdominal imaginario, en donde se ubicaría una línea
desde el cartílago xifoides hasta el orificio urogenital, así mismo se ubica una
línea que cruce por la mitad de la primera línea en dirección latero-lateral. Con
esto el abdomen queda dividido en cuatro cuadrantes. La inoculación debe
realizarse en el cuadrante inferior derecho ya que al lado izquierdo está
ubicado el ciego y existe un riesgo de perforación.

Imágenes referenciales.

Instilación de la sustancia.
Una vez esté ubicada la aguja-jeringa, se debe iniciar la administración de la
sustancia, esta debe hacerse a una velocidad media observando si hay algún tipo
de reacción anormal en el animal. Normalmente el animal no debe tener ninguna
reacción durante la administración.

Retiro de aguja-jeringa y observación del animal

Una vez se termine la instilación, la aguja-jeringa debe ser retirada del animal, esto
no suele presentar complicaciones. Con algunas sustancias los animales pueden
presentar manifestaciones leves de dolor que pueden durar unos cuantos
segundos.

e. Administración de extracto con posible actividad antimicrobiana (o

antibióticos conocidos)

Grupo I con suero fisiológico (N=3),

Grupo II con antibiótico (Ampicilina) (N=3),
Grupo III con antibiótico (ceftriaxona) (N=3).

Dosis/presentación:
Antibiótico Dosis Presentación
Vial de 1g, para disolver
Ampicilina 200 mg/kg en 5 ml de agua
destilada
 Vial de 1g, para disolver
Ceftriaxona 50 mg/kg en 5 ml de agua
destilada

Cálculo de dosis para ampicilina:

- Peso de la rata: 250g

- Dosis: 200 mg/kg.

Si Uniformizar unidades de medida

200mg → 1 Kg 200mg → 1000g
X mg → 250g X mg → 250g

200𝑚𝑔 ∗ 250𝑔
𝑋= 𝑋 = 50𝑚𝑔
1000𝑔

Si Uniformizar unidades de medida

5ml → 1g 5ml → 1000mg
X ml → 50mg X ml → 50mg

5𝑚𝑙 ∗ 50𝑚𝑔
𝑋= 𝑋 = 0.25𝑚𝑙
1000𝑚𝑔

Para una rata de 250 mg, administrar 0.25ml de ampicilina.

f. Evaluación de actividad antimicrobiana.

GRUPO I
El resultado cualitativo de la infección por E. coli en el Grupo I es la muerte por
septicemia, se toman muestras de hígado, riñón, intestino y peritoneo para
evaluación histopatológica, para la observación de absceso en la superficie del
hígado. Infiltración de PMN y colonias bacterianas (A). PMN y E. coli en
superficie peritoneal (B). Los parámetros valorados son: congestión hepática,
polimorfonuclerares (PMN) en sinusoides hepáticos, PMN en superficie de
hígado y peritoneo y colonización de bacterias en superficie de hígado y
peritoneo.
 GRUPO II y GRUPO III
La valoración cualitativa del efecto antimicrobiano es la sobrevivencia de los
animales de experimentación, se mide a las 24 horas del inóculo.

La valoración cuantitativa del efecto antimicrobiano se mide mediante la

extracción de muestras de sangre para cultivo microbiológico en agar sangre.

8. INDICADORES DE LOGRO Y CRITERIO DE EVALUACIÓN:

Se evalúa los indicadores de logro a través de un informe práctica.

9. OBSERVACIONES:
Cada estudiante debe:
 Prestar especial atención a la explicación del procedimiento del modelo
experimental para evitar errores de procedimiento, asimismo debe leer con
anterioridad el tema tratado en práctica.
Analizar el material audiovisual, con el fin de usar la información para responder
las preguntas, según su informe de práctica que se le entregara al término de la
práctica.

10 VESTUARIO:
Cada estudiante debe traer a cada práctica de laboratorio los siguientes
materiales básicos:

• Mandil
• Gafas de seguridad
• Guantes
• Cofia

11. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

1. Danner RL, Elin RJ, Hosseini JM, Wesley RA, Reilly JM, Parillo JE.
Endotoxemia in human septic shock. Chest 1991;99(1):169-7.
doi:10.1378/chest.99.1.169.
2. Danner RL, Elin RJ, Hosseini JM, Wesley RA, Reilly JM, Parillo JE.
Endotoxemia in human septic shock. Chest 1991;99(1):169-7.
doi:10.1378/chest.99.1.169.
3. Liu X, Wang N, Wei G, Fan S, Lu Y, Zhu Y, et al. Consistency and
pathophysiological characterization of a rat polymicrobial sepsis model via
the improved cecal ligation and puncture surgery. Int Immunopharmacol
2016;32:66–75. doi:10.1016/j.intimp.2015.12.041.
4. van der Heijden KM, van der Heijden IM, Galvao FH, Lopes CG, Costa SF,
Abdala E, et al. Intestinal translocation of clinical isolates of vancomycin-
resistant Enterococcus faecalis and ESBL-producing Escherichia coli in a
rat model of bacterial colonization and liver ischemia/reperfusion injury.
PLoS One 2014;9:e108453. doi:10.1371/ journal.pone.0108453.
5. Martinez-G LA, Quintiliani R, Tilton RC. Clinical experience on the detection
of endotoxemia with the limulus test. J Infect Dis 1973;127:102–5.
doi:10.1093/infdis/127.1.102.
6. Perkash I, Satpati P, Agarwal KC, Chakravarti RN, Chhuttani PN. Prolonged
peritoneal lavage in fecal peritonitis. Surgery 1970;68:842–5.

12. RESULTADOS Y CONCLUSIONES Serán establecido por los estudiantes

en el informe de práctica)

Resultados: Conoce el procedimiento del presente modelo experimental como

parte del proceso de formación en investigación científica.