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Análisis de enzimas de restricción y aislamiento de ADN.

Hipótesis experimental
La muestra preparada sin SDS, un detergente aniónico fuerte romperá las membranas
celulares lo que provocará una menor producción de ADN que la muestra preparada con
SDS.
Objetivos de la práctica
• Aislar DNA de otras biomoléculas utilizando un buffer que contenga el detergente
SDS y otra sin SDS.
• Aislar el DNA usando el método de electroforesis de gel de agarosa.
Marco teórico
El ADN es un ácido nucleico que contiene toda la información genética hereditaria para
desarrollarnos, vivir y reproducirnos [1]. La doble hélice presenta los grupos fosfato
cargados y grupos hidroxilo polares de los azúcares ribosa del esqueleto del ADN [2].
Para el aislamiento de ADN se requiere de la recolección de células, lisis, degradación de
proteínas y precipitación de ADN, el ADN está dentro del núcleo de las células eucariotas,
primero se debe romper la célula y la membrana nuclear para exponer el ADN, mediante
lisis. La lisis celular es el proceso por el cual una célula se desintegra o es destruida a
través de la ruptura de su membrana plasmática y/o pared celular, produce la salida del
material celular, provocado por lisinas. Todas las células tienen una membrana hecha de
fosfolípidos que separan el contenido celular del ambiente extracelular. Esta puede ser
por medios químicos o físicos (por ejemplo, por medio de detergentes fuertes u ondas
sonoras de alta energía) o por infección con una cepa de un virus que puede lisar las
células [3]. Una vez que el ADN está expuesto, puede ser degradado por iones de metales
pesados y pH extremos, por lo que se le agrega una solución tampón de lisis que contiene
detergente para disolver la membrana celular y proteger el ADN, también se debe agregar
una enzima llamada Proteinasa K, que ayuda a degradar los enlaces peptídicos de las
proteínas y separar el ADN de las histonas y otras proteínas. El ADN es insoluble en
alcohol y se precipita fácilmente a bajas temperaturas, por lo que se agrega alcohol frío
para precipitar el ADN. Finalmente, el ADN precipitado se puede disolver y almacenar
en agua desionizada o en un tampón suave [4].
Después se usa un espectrofotómetro para cuantificar la cantidad de ADN y su pureza.
Un espectrofotómetro mide la intensidad de un haz de luz que atraviesa una muestra en
función de su longitud de onda. Los ácidos nucleicos absorben luz a 260 nm, mientras
que las proteínas absorben luz a 280 nm. Al medir la intensidad de un haz de luz a 260
nm, se puede determinar la concentración de ADN [4].
El ADN aislado debería cortarse en secuencias especificas usando enzimas de restricción.
Luego las enzimas de restricción identifican un ADN viral, empiezan a dividirlo cortando
sus segmentos en secuencias de nucleótidos en direcciones 3'-5' y 5'-3' que se pueden
reconocer fácilmente. Cuando el ADN es cortado por estas enzimas, se puede cargar el
ADN en un gel dentro de una cámara de electroforesis y pasar corriente eléctrica por
medio del gel. El ADN con cargas negativas provoca que sus fragmentos migren hacia el
ánodo, los poros del gel ralentizan los fragmentos de ADN más grandes relacionadas con
las secuencias de ADN más pequeñas que por medio de colorantes se unen a las moléculas
de ADN [4].
Cortar el ADN con enzimas de restricción y dividir los fragmentos de ADN con
electroforesis posibilita detectar los tamaños de fragmentos desconocidos relacionados
con una escalera estándar [4].

Metodología de la practica
Reactivos:
• Tampón de lisis I: tampón TE con SDS.
• Tampón de lisis II: tampón TE sin SDS.
• Proteinasa K.
• Cloruro de sodio (NaCl)
• Etanol (C2H5OH)
• Sodio dodecil sulfato (SDS)(𝑁𝑎𝐶𝑙12 𝐻2 5𝑆𝑂4 )
• Agua libre de nucleasas (𝐻2 𝑂 + 𝐶6 𝐻10 𝑂5 )
• ADN de Lambda.
• Tampón NEB.
• Tampón TAE (Tris-acetato-EDTA).
• Enzima de restricción Stul.
• Enzima de restricción BsrGI.
• Polvo de agarosa (C12H18O9).
• Colorante en gel Syber.
• Colorante de carga de gel de ADN 6X.
Material de laboratorio:
• 2 tubos cónicos de 15 mL.
• 1 abatelenguas.
• 1 embudo de vidrio.
• 1 vaso.
• 1 marcador permanente.
• 1 vaso para recogida de residuos.
• 2 varillas de vidrio.
• 1 cronometro.
• 10 tubos de microfuga de 1,5 mL.
• 1 vaso de precipitado de 500 mL.
• 1 pipeta automatizada.
• 10 puntas de pipeta.
• 1 enfriador de enzimas.
Equipo de laboratorio:
• 1 rejilla de microcentrífuga.
• 1 balanza de pesaje.
• 1 microcentrífuga.
• 1 transimulador UV.
• 1 aparato de gel de ADN.
• 1 escalera de ADN de 1kb.
• 1 computadora con conexión a internet.
AISLAMIENTO DE ADN.
El experimento de aislamiento de DNA se realizó bajo dos condiciones experimentales,
una donde se usó un tampón que contenía detergente SDS y otra donde el tampón no
contenía SDS. Se recolectó una muestra de tejido usando las células de las propias
mejillas, se usó un palito de paleta para raspar el interior de la mejilla durante 30 segundos
y se tomó la muestra. Después, se colocó un embudo en un tubo cónico de 15 mL, luego
se tomaron 10 mL de solución salina al 1% y se agitó en la boca sin tomarlo, se hicieron
buches durante 90 segundos y se escupió la solución salina que contenían las células de
la mejilla en el embudo y se acumularon en el tubo cónico. Se etiquetaron dos tubos de
microcentrífuga vacíos con las iniciales de quien usó la muestra de células de su mejilla,
se etiquetó uno de los tubos con la leyenda +SDS y el otro tubo como -SDS,
posteriormente se giraron los tubos en la microcentrífuga durante 30 segundos, se
retiraron los tubos de la microcentrífuga y se trasvasó con cuidado el sobrenadante sin
alterar las células recolectadas en el fondo de cada tubo. A continuación, se llenaron los
tubos con más solución salina que contenía las células de la mejilla y se repitió el paso de
la centrifugación, se repitió este proceso teniendo especial cuidado de distribuir de manera
uniforme las células entre tubos +SDS y -SDS hasta que se recolectó todas las células de
la mejilla. Después, se agregó 1 mL de tampón de lisis que contenía SDS al tubo marcado
como +SDS y luego se suspendió el sedimento celular pipeteando con un movimiento
hacia arriba y hacia abajo. Más tarde, se agregó 1 mL de tampón de lisis sin SDS al tubo
marcado con -SDS y se suspendió el sedimento celular pipeteando hacia arriba y hacia
abajo, posteriormente se agregó 1μL de proteínas de K a cada tubo y se colocó con
cuidado los tubos en un baño de agua a una temperatura de 56°C durante 10 minutos.
Luego de 10 minutos, se retiró con cuidado los tubos del baño de agua y se agregó 100μL
de 𝑁𝑎𝐶𝑙 2,5 M a cada tubo, se cerraron los tubos firmemente y se alternó cada uno varias
veces para mezclarlos. Después, se etiquetó un tubo cónico de 15 mL como +SDS y otro
con -SDS. Se colocó el contenido de cada tubo de microcentrífuga en el tubo cónico de
15 mL que correspondía, se obtuvo una alícuota de 10 mL de Etanol (C2H5OH) al 100%
del congelador. Luego, se sostuvo uno de los tubos cónicos en ángulo y se dispensó
lentamente 1 mL de Etanol (C2H5OH) al 100% en el tubo y se formó una capa sobre el
líquido que estaba en el tubo; se repitió el proceso de igual manera para el segundo tubo
cónico. Se observó un precipitado fibroso presente en la interfaz del etanol (C2H5OH) y
la capa acuosa debajo de éste, el material fibroso contenía ADN aislado, se tomó
fotografía del ADN en el tubo y se tomaron notas descriptivas claras de las observaciones.
Se recogió con una varilla de vidrio el ADN del tubo +SDS y se examinó, se repitió este
paso para el tubo -SDS y se registraron observaciones, después se tomó nota de si uno de
los tubos parecía tener más precipitado que el otro y a que se debía esto. Por último, se
desecharon todos los desechos líquidos en el contenedor de desechos apropiado y se
devolvieron todas las herramientas a los lugares correspondientes.
RESUMEN VIRTUAL DE ENZIMAS DE RESTRICCIÓN.
Se ingresó al sitio web de New England Biolabs y se estudió el funcionamiento de las
enzimas de restricción, después se hizo clic en herramientas y recursos para encontrar la
herramienta NEBcutter y se abrió el programa. Se buscó la lista de “Viral+Fago” y se
seleccionó Lambda, que es el nombre del ADN que se digirió. Se seleccionó la opción
Lineal donde la herramienta decía “la secuencia es” y la opción “NEB enzimas” donde la
herramienta decía “Enzimas para enviar” y se dio clic en “enviar”, en la página siguiente
se mostró un mapa de restricción completo de lambda, a continuación, se hizo clic en
“resumen personalizado” debajo del encabezado “opciones principales”. Después, se
buscó la enzima Stul y se observó que funcionaba de manera óptima el buffer 2.1 o en el
buffer CS, se seleccionó la enzima Stul y se hizo clic en “digerir”. Posteriormente, en la
ventana siguiente se hizo clic en “Ver gel” debajo del encabezado “opciones principales”,
se seleccionó la opción para ejecutar un gel virtual al 1% y se utilizó un resumen de
pBR322-BstN1 y una vez que aparecieron los resultados se tomó una captura de pantalla,
al final se pegó en un documento en blanco. Después, se regresó a la página principal de
la herramienta NEBcutter y se seleccionó “Nuevo resumen personalizado”, esta vez se
buscó la enzima BsrGl y se observó que funcionaba de manera óptima en el tampón 2.1
o en el tampón 3.1, se seleccionó la enzima y se hizo clic en “digerir”, debajo del
encabezado de opciones principales se hizo clic en “ver gel” y se seleccionó las opciones
para ejecutar un gel virtual al 1% y se utilizó un resumen de pBR322-BstN1, se tomó una
captura de pantalla de los resultados y se guardó en un documento de texto. Por último,
se repitió el procedimiento usando Stul y BsrGI juntos en un solo resumen, se tomó una
captura de pantalla y se guardó el gel resultante.
PERFILES DE ADN.
Se colocó las alícuotas de ADN lambda, tampón NEB 2.1, enzima Stul y enzima BsrGI
en un cubo de hielo y se llevó al área de trabajo. Después, se etiquetó un tubo como “Stul”
que contenía el resumen de Stul, se etiquetó otro tubo más como “BsrGI” que contenía el
resumen de BsrGi, luego se etiquetó un tubo más con “S+B” que contenía lo digerido con
ambas enzimas. Posteriormente, se pipetearon 40μL de agua en cada tubo, se usó una
punta de pipeta nueva cada vez y se dispensó 5μL de tampón 2.1 en cada tubo y se pipeteó
hacia arriba y hacia abajo para mezclar, después se agregó 4μL de ADN lambda a cada
tubo y se pipeteó 0,5μL de cada enzima en los tubos correspondientes, se agregó una
cantidad suficiente de agua a cada tubo y se llevó el volumen total hasta 50μL. En seguida,
se incubó a los tubos a una temperatura de 37°C durante 15-60 minutos en un baño de
agua y se devolvió los tampones y enzimas a congelador. Después, se preparó un gel de
agarosa y se ejecutó la digestión, luego en un matraz de 250 mL se mezcló 1 gr de agarosa
en polvo con 100 mL de tampón TAE. Se calentó la solución en el microondas durante
90 segundos a máxima potencia, evitando que la solución se derramara. Por consiguiente,
se retiró con cuidado la solución del microondas con un guante y se dejó enfriar durante
15 minutos; mientras se enfriaba la agarosa, se instaló una bandeja de fundición, una vez
que l solución de agarosa se enfrió, se agregó 5μL de tinte de gel 10,000X SYBR Safe a
la solución. Posteriormente, se agregó el peine que es usado en electroforesis, a la bandeja
de fundición del aparato de electroforesis en gel. Se colocó una solución de gel de agarosa
en la bandeja de fundición y se dejó solidificar; cuando el gel se solidificó se tiró el peine
hacia arriba para sacarlo del gel y se retiraron los diques de la bandeja de fundición.
Después, se colocó el gel en la cámara de electroforesis con los pocillos colocados más
cerca del electrodo negativo o negro, y se llenó la cámara con tampón TAE 1x, así se
cubrió completamente el gel. En seguida, se sacó las muestras del baño de agua y se
agregó 8,3μL de colorante de carga 6x a cada muestra, se dispensó 10μL de la digestión
de pBR322-BstN1 que contenía fragmentos de ADN de tamaño conocido en el primer
pocillo. Se cargó 25μL de muestra Stul en el segundo pocillo, se colocó 25μL de muestra
BsRGI en el tercer pocillo y se cargó 25μL de muestra S+B en el cuarto pocillo. Después,
para ejecución del gel, se enchufó los cables en la cámara de electroforesis y luego en la
fuente de alimentación, el cable positivo rojo se colocó en el extremo más alejado de los
pozos y el cable negativo se colocó más cerca de los pozos, esto se debió a que las
muestras pasaron de negativas a positivas. Se encendió la fuente de alimentación y se
configuró la caja de gel, funcionó a 170 voltios durante 60 minutos aproximadamente.
Para finalizar, se apagó la alimentación de la caja de gel y se desconectó los electrodos
del tanque, luego se retiró el gel de la cámara de electroforesis y se observó con un
transimulador UV, se usó la cámara de un celular y se fotografió el gel directamente desde
arriba y en paralelo a la superficie del gel.

Discusión
Para preparar el buffer de lisis, utilizado en la extracción de ADN, se usan reactivos, los
cuales cumplen papeles fundamentales en la lisis de la célula para obtención de ADN [5].
El SDS (sodio dodecil sultafo) solubiliza los lípidos y proteínas, y desestabiliza la
estructura de la membrana celular. La Sucrosa provoca una desestabilización de la
estructura celular a través del cambio de la presión osmótica. En el NaCl (cloruro de
sodio) los grupos fosfato tienden a repelerse, debido a su carga negativa, lo que permite
disolver al ADN y formar una capa hidratante alrededor de la molécula que se rompe en
presencia de etanol. Esto favorece la unión con cationes como Na+ que reducen las
fuerzas repulsivas entre las cadenas de nucleótidos y permiten que el ADN se precipite.
El Tris (hidroximetil amino metano) es usado para estabilizar el pH de la solución (entre
7,0 y 8,0). Para evitar la degradación se usa el EDTA (Ácido etilendiaminotetraacético),
que atrapa los iones Mg2+ usados por las DNAasas como cofactores. La inhibición de las
enzimas también puede realizarse mediante métodos físicos, como la desnaturalización
por calor (a temperaturas de 65 °C). El HCl (ácido clorhídrico) sólo se usa si es necesario
para ajustar el pH a 8,6. Teniendo en cuenta que el ADN puede ser destruido (depurinado)
a pH ácido (menor de 4,0), es insoluble a pH 5,6 pero soluble a pH 8,0. Por lo tanto, los
procesos de extracción, purificación y almacenamiento del ADN deben mantener el pH
óptimo y brindar una alta concentración iónica [5].
Proteinasa K Sirve para romper/degradar a las proteínas que están unidas al ADN [6], es
una serina proteasa no específica con un peso molecular de aproximadamente 18 kDa.
Esta enzima exhibe alta estabilidad y actividad en presencia de SDS, EDTA y urea, así
como en un amplio rango de pH. La proteinasa K es útil para la inactivación de nucleasas
durante el aislamiento de ADN y ARN [7].
En el programa New England Biolabs Stu1se mostraron siete bandas, mientras que en el
gel y con ayuda del transiluminador UV se observaron cinco bandas. En la enzima BsrG1,
el programa arrojo seis bandas y en nuestro gel también se encontró la misma cantidad.
Al combinar la enzima Stur1 y BsrG1el programa nos arrojó doce bandas y en
comparación con nuestro gel donde se registraron cinco bandas [4].

Conclusión
Al finalizar la presente práctica se pudo concluir que, la muestra que contenía SDS tuvo
una menor producción de bandas, esto debido a que el SDS es un detergente que rompe
las membranas celulares; por el contrario, la muestra sin SDS tuvo una mayor
concentración de bandas.
Bibliografía
[1] Biología: fundamentos para medicina y ciencia de la vida/ Werner Múller-Sterl.
Versión española por Josep Centelles-Barcelona: Reverté, 2008. Recuperado 4 de
noviembre del 2021.
[2] HARPER. BIOQUÍMICA ILUSTRADA. Segunda edición en español por GRAW-
HILL INTERAMERICANA EDITORES 2013 Robert K. Murray, David A. Bender,
Kathleen M. Botham, Peter J. Kennelly, Víctor W. Rodwell, P. Anthony Weil, recuperado
4 de noviembre del 2021.
[3] Lisis celular. Por Raquel Parada Puig (6 de febrero del 2020). Lifeder.com.
https://www.lifeder.com/lisis-celular/. Recuperado 4 de noviembre del 2021.
[4] Análisis de enzimas de restricción y aislamiento de ADN. (Dakota del Norte.).
Jove.Com. de https://www.jove.com/es/science-education/10628/dna-isolation-and-
restriction-enzyme-analysis Recuperado 4 de noviembre del 2021
[5] Preparación de solución de lisis para extracción de ADN Isabel Cristina Cadavid
Giovan F. Gómez (1987)
https://dspace.tdea.edu.co/bitstream/handle/tdea/1476/Preparaci%C3%B3n%20de%20s
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y Recuperado 4 de noviembre del 2021
[6] Alberto Checa Rojas. (2017). Extracción de ADN, Conogasi.org Sitio web:
https://conogasi.org/articulos/extraccion-de-adn-2/ Recuperado 4 de noviembre del 2021
[7] Proteinasa K (Reconstituida o Liofilizada). (2018, April 12). Biocellsci.com.
https://biocellsci.com/portfolio_page/proteinasa-k-reconstituida-o-liofilizada/,
Recuperado el 4 de noviembre del 2021.

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