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PRÁCTICA FINAL DE LABORATORIO – INFORME FINAL

PRÁCTICA 1 | ASPECTOS PRÁCTICOS DEL TRABAJO EN EL LABORATORIO AGROPECUARIO

ETAPAS EN UN MÉTODO ANALÍTICO

Introducción. Análisis paso a paso de los métodos analíticos


En un método de análisis se llevan a cabo numerosos pasos (Fig. 1 del documento “Procesos
previos al análisis”), cada uno de los cuales tiene una finalidad específica, por ejemplo: preparar
la muestra para el análisis, disolver el analito, eliminar interferencias o convertir el analito a una
forma adecuada para el análisis. Todos estos aspectos han sido desarrollados en el documento
“Procesos previos al análisis”. Una vez que el analito se encuentra bajo la forma química
adecuada para el análisis, entonces se lleva a cabo la cuantificación, que puede clasificarse, de
acuerdo al tipo de análisis químico en: gravimétrico, volumétrico o instrumental.
En este documento se desarrolla el análisis paso a paso de los métodos mediante la aplicación
de los conceptos vistos previamente. La propuesta del análisis paso a paso se lleva a cabo en dos
formularios: uno consiste en una ficha del método, que contiene la información más general (ítem
1), y el otro en una clasificación de los pasos del procedimiento (ítem 2). Al final de cada sección
se incluye, a modo de ejemplo, el análisis de dos métodos de uso habitual en los laboratorios
agropecuarios: N orgánico en material vegetal por el método Kjeldahl y P extraíble en suelos por
el método colorimétrico de Murphy y Riley.

1. Ficha técnica
Esta ficha o formulario se completa con la información básica del método, que incluye:

1.1. Nombre del método analizado. El nombre debe hacer referencia al método y a la
muestra sobre la cual se aplica.

1.2. Analito: en el análisis de los métodos se debe identificar claramente el analito, es decir,
la especie química que se quiere cuantificar. En algunos métodos se cuantifica sólo una
especie química, pero en otros se cuantifican varias de ellas, relacionadas o no entre sí.
Veamos algunos ejemplos:
 El peachímetro es un instrumento que permite cuantificar potenciométricamente a los
protones en solución acuosa, es decir, la especie química H3O+(ac) (oxonio). Ese
instrumento cuantifica a esa especie química y no a otra. En este caso, se trata de un
solo analito, es decir, de una sola especie química.
 El conductímetro es un instrumento que permite cuantificar la conductividad eléctrica
de una solución. En este análisis se cuantifica una propiedad del sistema que depende
de varias especies químicas: todos los cationes y aniones presentes en la solución. No
se trata de un método que cuantifica sólo una especie química, sino muchas de ellas,
que tienen en común la capacidad de conducir la electricidad.
 En la cuantificación del N de una muestra de material vegetal por el método de
Kjeldahl se cuantifica el catión NH4+ y los compuestos químicos orgánicos que
contienen N en su estructura (aminas, amidas, aminoácidos, etc.). Si la muestra
contiene nitratos y/o nitritos, no serán cuantificados en esta metodología. El método,
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por lo tanto, permite cuantificar varias especies químicas: una de ellas inorgánica (el
NH4+) y las demás, orgánicas. Las especies químicas cuantificadas tienen en común la
característica de transformarse en NH4+ durante el proceso de digestión con ácidos
fuertes (este tema lo retomaremos más adelante en esta misma ficha de cátedra).
 En la cuantificación de P extractable en suelos se realiza la extracción de una fracción
de P mediante la agitación de una muestra de suelo con una solución extractante. En
el extracto estarán presentes, mayoritariamente, especies inorgánicas de P (por
ejemplo: H2PO4-, HPO42-, dependiendo del pH de la solución), aunque también pueden
disolverse algunas especies orgánicas (por ejemplo: ésteres fosfato). Posteriormente
se lleva a cabo una reacción en la que sólo las especies inorgánicas, al entrar en
contacto con nuevos reactivos, forman un compuesto coloreado, que es el que
finalmente se mide espectrofotométricamente. Por lo tanto, aunque se hayan extraído
especies orgánicas, la cuantificación se realiza sobre las especies inorgánicas de P
(cabe aclarar que durante la extracción podría hidrolizarse una fracción del P orgánico
extraído y, por lo tanto, pasar a formar parte del P inorgánico del extracto). El
analito, por lo tanto, será sólo la fracción inorgánica de P en el extracto.

1.3. Total o fracción: se debe analizar si el analito que se cuantifica en un método


corresponde a la totalidad de ese analito que está presente en la muestra o bien a una
fracción del mismo (para una revisión de este aspecto, consultar el punto 2 del
documento “Procesos previos al análisis”).

1.4. Matriz: se debe indicar en qué sistema se cuantificará el analito (la matriz es todo
aquello que está presente en la muestra, que no es el analito). En los análisis frecuentes
en el laboratorio agropecuario, las matrices suelen ser: agua, suelo, granos, forrajes,
alimento balanceado, fertilizantes, etc. Cabe aclarar en este punto, tal como se
mencionó previamente en el documento de “Procesos previos al análisis”, que suelos o
materiales vegetales de características contrastantes (por ejemplo, un tejido de una
planta joven vs. un tejido muy lignificado; un suelo de textura fina vs. uno de textura
gruesa) pueden comportarse como matrices distintas.

Ejemplos de aplicación agropecuaria:


Para los métodos de N Kjeldahl y P extraíble en suelos, las fichas se completarían del siguiente
modo:

Ficha técnica del método N Kjeldahl


Nombre del método analizado N en material vegetal por método Kjeldahl
Analito N orgánico y NH4+
Total, se lleva a cabo una digestión en medio ácido de
Total o fracción
la muestra hasta la disolución completa de la misma.
Matriz Material vegetal

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Ficha técnica del método P extraíble en suelos
P extraíble (Bray y Kurtz) en suelos por
Nombre del método analizado
espectrofotometría.
Analito especies químicas inorgánicas de P (iones)
Total o fracción Fracción soluble en las condiciones de la extracción
Matriz Suelo

2. Clasificación de pasos en el procedimiento


Esta ficha o formulario se completa al clasificar los pasos indicados en un procedimiento dentro
de alguna de las categorías siguientes: obtención/conservación de la muestra; preparación de la
muestra; disolución del analito o de la matriz de la muestra; cambio de forma química o
eliminación de interferencias; y medición de una propiedad del analito. Los detalles de cada una
de estas categorías se han presentado y desarrollado en el documento “Procesos previos al
análisis”. Además de la clasificación, es importante interpretar lo que sucede físico-químicamente
en cada etapa. A continuación se indica cómo debería completarse la ficha de clasificación de
pasos para un determinado método:

1.1. Obtención/conservación de la muestra. En algunos procedimientos de laboratorio se


especifica cuáles son las condiciones en que debe tomarse la muestra a partir del lote
(puede ser una parcela en el campo, una bolsa con el material, un cuerpo de agua, el
agua contenida en un tanque, etc.). Si el procedimiento no indica cómo debe tomarse la
muestra, completar con la frase “no especificado en el procedimiento”. En este primer
paso también pueden incluirse aspectos relativos al almacenamiento y/o conservación de
la muestra (por ejemplo, en el caso de que deban mantenerse refrigeradas, en bolsa
cerrada o en bolsas de papel, etc.).

1.2. Preparación de la muestra. Consiste en indicar cuáles son los pasos del procedimiento
relacionados con las condiciones de preparación de la muestra: filtrado, molienda,
secado, etc. Para una revisión de la interpretación de estos aspectos, consultar el punto 1
de la ficha de cátedra “Procesos previos al análisis”. Si el procedimiento no indica cómo
debe prepararse la muestra, completar con la frase “no especificado en el
procedimiento”.

1.3. Disolución del analito o de la matriz de la muestra. Consiste en indicar cuáles son los
pasos del procedimiento en los que se lleva a cabo la disolución del analito o bien la
disolución de la matriz de la muestra. En el punto 2 de la ficha de cátedra “Procesos
previos al análisis”, se explican y clasifican las diferentes alternativas. En el estudio de
los pasos de un procedimiento se debe clasificar la metodología empleada e interpretar lo
que ocurre en este paso mediante el planteo de una transformación físico-química. Si en
el procedimiento no se lleva a cabo este paso, completar con la frase “no se lleva a cabo
este paso en el procedimiento”. Si es que el analito se encuentra ya disuelto en la
muestra, indicar “no corresponde, el analito se encuentra disuelto en la muestra”.

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1.4. Cambio de forma química – Eliminación de interferencias. En esta fila se debe
completar con los pasos del procedimiento que se llevan a cabo con ese fin. En la
interpretación de este paso es aconsejable plantear una ecuación que indique, en
términos generales, cuáles son los reactivos y cuáles los productos de la transformación.
Si no se llevan a cabo estos pasos en el procedimiento, se debe indicar: “no se lleva a
cabo este paso en el procedimiento”.

1.5. Medición de la propiedad del analito. En esta fila de deben indicar cuales son los pasos
del procedimiento en los que se lleva a cabo la cuantificación del analito. En la
interpretación debe indicarse si se trata de un método gravimétrico, volumétrico o
instrumental. Además, se debe indicar si la cuantificación se lleva a cabo de forma
directa o indirecta.

1.5.1. Cuantificación directa e indirecta


En el análisis cuantitativo las mediciones pueden hacerse en forma directa, es
decir, sobre el analito en cuestión, o bien en forma indirecta, sobre otras especies
químicas distintas del analito, que están cuantitativamente relacionadas con él. Por
ejemplo, cuando se cuantifica pH en una muestra de agua, la determinación se realiza en
forma directa sobre el analito, que es el ión H3O+(ac). Esto se debe a que el peachímetro
tiene un electrodo que mide en forma directa la concentración de oxonios en la solución
acuosa. La mayor parte de las mediciones, sin embargo, no se realizan en forma directa
sobre el analito, sino sobre otra especie química relacionada con el mismo. Analicemos los
ejemplos de N orgánico en material vegetal y P extraíble en suelos (ver procedimientos en
el documento cargado en el aula virtual):

 La cuantificación de N orgánico en material vegetal se lleva a cabo mediante


un método volumétrico (Fig. 1). El analito es el N orgánico de la muestra y el
NH4+. En el método, el N orgánico se transforma químicamente a NH4+ durante
un proceso de digestión con ácidos fuertes (Fig. 1, paso 2). Posteriormente el
NH4+(ac) (que se encontraba como tal originalmente, o que proviene de la
digestión) se transforma en NH3(g) por el agregado de una base fuerte (Fig. 1,
paso 3), y ese NH3(g) se destila y se recoge sobre una solución de ácido bórico.
Una parte del ácido bórico presente reacciona con el amoníaco y es
parcialmente neutralizado (Fig. 1, paso 4). Como producto de esta
neutralización se forma el ión borato diácido. La concentración de ese ión
borato diácido, que es proporcional a la cantidad de NH3 recogido es,
finalmente, cuantificada mediante una titulación con una solución
estandarizada de un ácido fuerte. De acuerdo a esta descripción, en el método
no se cuantifica la concentración el N orgánico, que es el analito, sino la del ión
borato diácido, que está cuantitativamente relacionado con la cantidad de NH3
destilado y, por lo tanto, con la de NH4+ y de N orgánico presente en la
muestra. Se trata, por lo tanto, de una cuantificación indirecta.

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Figura 1. Esquema de la cuantificación de N orgánico en material vegetal (método Kjeldahl).

 La cuantificación del P disponible en suelos se lleva a cabo mediante un


método instrumental, específicamente, un método espectrofotométrico. El
analito es el P inorgánico que se extrae mediante una solución acuosa ácida
denominada solución extractante (Fig. 2, pasos 1-2). Luego de la extracción se
lleva a cabo la filtración y se obtiene una solución que contiene el analito (Fig.
2, pasos 2-3). En las condiciones de la experiencia, el P extraído se encontrará
mayoritariamente bajo la forma de ión fosfato diácido (H2PO4-). Una alícuota
del extracto obtenido se coloca en un tubo al que se agrega otra solución
(solución de reacción), que contiene especies químicas que reaccionarán con el
analito, formando un producto de color azul (Fig. 2, pasos 3-4). Aunque no
conozcamos las fórmulas de estas sustancias, la reacción puede representarse
de la siguiente manera:

H2PO4-(ac) + Reactivos de la solución de reacción(ac) ⟶ Producto de color azul(ac)

Finalmente, la intensidad del color de la solución que contiene el producto


coloreado es medida en un espectrofotómetro. La cuantificación se realiza por
comparación del color desarrollado por la muestra con una curva de calibración
que se preparó a partir de soluciones de concentración conocida de P. De
acuerdo a esta descripción, en el método no se cuantifica la concentración de
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H2PO4-, que es el analito, sino el producto coloreado, que es proporcional a la
cantidad de H2PO4- presente en el extracto y en la muestra. Se trata, por lo
tanto, de una cuantificación indirecta.

Figura 2. Esquema de la cuantificación de P disponible en suelos

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Ejemplos de aplicación agropecuaria:
Para los métodos de N Kjeldahl en material vegetal y P extraíble en suelos (de acuerdo a los
procedimientos presentados en el documento anexo en el aula virtual), las fichas se completarían
del siguiente modo:

Clasificación de pasos en el procedimiento N Kjeldahl


Obtención
/conservación El procedimiento no indica cómo debe tomarse la muestra.
de la muestra
El procedimiento indica: Secar el material vegetal en estufa a 60°C hasta
peso constante. Moler el material hasta que pase por una malla de 1 mm.
Preparación Interpretación: la muestra debe estar seca para expresar correctamente
de la muestra los resultados en base seca y para garantizar su conservación. Además,
debe estar molida para que pueda ser correctamente atacada por los
reactivos durante la digestión.
El procedimiento indica: “Pesar en balanza analítica 0,2 g de material
vegetal seco y colocarlo en un tubo de digestión. Añadir 0,5 g de mezcla
catalítica de sales (sulfato de potasio y sulfato de cobre) y 3 mL de ácido
sulfúrico concentrado. Colocar el tubo en el digestor y digestar
Disolución del aproximadamente 40 min a una temperatura de 380°C (hasta que la
analito o de la solución quede translúcida, sin partículas en suspensión). Dejar enfriar el
matriz de la tubo. Retomar el producto de digestión con 20 mL de agua destilada y
muestra colocar en el tubo de destilación”.
Interpretación: en el procedimiento se disuelve la muestra
completamente mediante reacción con ácido sulfúrico y catalizadores en
caliente. El analito se transforma químicamente en este proceso:
N orgánico (muestra sólida) ⟶ NH4+ (ac; solución ácida)
El procedimiento indica: Tomar un erlenmeyer de 125 mL y agregarle 10
mL de solución de ácido bórico con indicador de pH. Colocar el
erlenmeyer a la salida del condensador del destilador, de manera que el
extremo del condensador quede bajo la superficie de la solución de ácido
Cambio de bórico. En el tubo de destilación agregar, con cuidado y por las paredes
forma química del tubo, 20 mL de solución de hidróxido de sodio 10 mol/L y conectar
– Eliminación inmediatamente al destilador. Destilar con vapor de agua hasta acumular
de un volumen de 25 a 30 mL de condensado.
interferencias Interpretación: el analito, que se transformó en la disolución anterior a
NH4+, se transforma nuevamente en el paso de destilación a NH3 (g), que se
recoge en un recipiente que contiene ácido bórico:
NH4+(ac) + OH-(ac) ⟶ NH3(g) + H2O(l)
NH3(g) + H3BO3(ac) ⟶ H2BO3- + NH4+(ac)

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El procedimiento indica: Retirar el Erlenmeyer, previo enjuague con agua
del extremo del condensador. Titular con solución estandarizada de ácido
sulfúrico 0,01 mol/L hasta viraje de color del indicador. Realizar los
Medición de
mismos procedimientos para un blanco sin muestra.
una propiedad
Interpretación: se trata de una cuantificación volumétrica. La
del analito
cuantificación se logra por comparación con un blanco. El analito se
cuantifica indirectamente (se mide la cantidad de borato diácido
presente en el erlenmeyer en el que se recogió el NH3(g)).

Clasificación de pasos en el procedimiento P disponible en suelos


Obtención /
conservación de El procedimiento no indica cómo debe tomarse la muestra.
la muestra
El procedimiento indica: moler una porción representativa de la
muestra de suelo que fue secada en estufa a 40°C y tamizada hasta
que toda la fracción pase por tamiz de 2 mm.
Preparación de
Interpretación: se debe respetar el tamaño de las partículas, ya que la
la muestra
extracción dependerá del grado de contacto de la muestra con la
solución extractante. El secado del suelo debe hacerse para expresar
el resultado en base seca y para conservación de la muestra.
El procedimiento indica: Pesar 2 g de la muestra en un tubo con tapa,
y agregar 14 mL de solución extractora (fluoruro de amonio 0,03
mol/L y ácido clorhídrico 0,025 mol/L) verificando previamente que su
pH sea 2,6  0,1. Tapar los tubos y colocar inmediatamente en el
Disolución del agitador, con los tubos ubicados en posición horizontal y en el sentido
analito o de la del vaivén del agitador. Agitar durante 5 min a temperatura de 20-25
matriz de la °C. Una vez que finaliza la agitación, inmediatamente centrifugar o
muestra filtrar a través de un papel de filtro para obtener un extracto límpido.
Interpretación: en este paso se disuelve una parte del P inorgánico de
la muestra en la solución de extracción, de acuerdo a las condiciones
de extracción establecidas.
P inorgánico en la muestra ⟶ P inorgánico (ac; solución de extracción)
El procedimiento indica: Tomar una alícuota de 1 mL de extracto y
colocarla en el tubo de ensayo correspondiente. Adicionar 9 mL de
solución reactiva B (contiene ácido sulfúrico, molibdato de amonio,
Cambio de forma tartrato de antimonio y potasio y ácido ascórbico). Homogenizar las
química – soluciones con vortex y esperar como mínimo 30 min para el desarrollo
Eliminación de del color. Se forma en ese tiempo un complejo de color azul que es
interferencias estable por 24 h.
Interpretación: el P inorgánico extraído en el paso anterior reacciona
con los reactivos de la “solución reactiva B” y forma un producto
coloreado:
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P inorgánico (ac) + Reactivos Sc. reactiva B ⟶ Producto coloreado

El procedimiento indica: Leer la absorbancia en espectrófotómetro a


882 nm. Comparar con la curva de calibración que se obtiene
realizando el mismo procedimiento que para la muestra, pero
tomando 1 mL de cada solución de calibración de concentración 0,5; 1;
3; 5 y 7 μg/mL de P. Dichas soluciones de calibración se preparan por
Medición de una dilución de una solución patrón de 100 ppm de P, preparada a partir
propiedad del de fosfato diácido de potasio sólido, grado p.a.
analito Interpretación: se trata de una cuantificación espectrofotométrica
(técnica instrumental). La cuantificación se logra por comparación con
una curva de calibrado.
El analito se cuantifica indirectamente (se mide la cantidad de
producto coloreado, que será proporcional a la cantidad de P
inorgánico en el extracto).

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