Métodos Rápidos para el

control Microbiológico de
Alimentos
Vigo, 8 de septiembre del 2011

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

1
 Necesidades en el análisis de alimentos

• Contaminación microbiana: principales problemas

asociados al consumo
• Las toxiinfecciones alimentarias conllevan un elevado
impacto económico (patógenos)
• Las alteraciones de alimentos también preocupan a las
industrias alimentaria (indicadores
( de calidad))
• Sistemas APPCC es la herramienta de seguridad
alimentaria más reconocida
• Requiere de un gran número de análisis y obtención
rápida
p de resultados

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

2
 Necesidades en el análisis de alimentos

• Métodos
Mé d cada d vez más
á rápidos
á id (industrias,
(i d i l b
laboratorios)
i )
• Métodos sencillos
• Métodos fiables
• Métodos reconocidos
• Métodos trazables
• Métodos sensibles
• Métodos económicos

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

3
 Métodos tradicionales/oficiales:

• Largos
Surgen los métodos
alternativos
• Elevada (rápidos y/o
manipulación
automatizados)
• Tediosos

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

4
 Métodos rápidos:
y
• Disminuyen uno o varios días frente a los
protocolos tradicionales

Métodos automatizados:
• Utilización de un equipo que realiza una o varias
tareas que habitualmente realiza un técnico

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

5
 Métodos Rápidos: Consideraciones generales

CARACTERISTICAS DE UN MÉTODO RÁPIDO/AUTOMATIZADO

IDEAL
¾Preciso
¾Rápido
p yp
productivo
¾Económico
¾Aceptable
¾Realización simple
¾Entrenamiento
¾Reactivos comunes
¾R
¾Reputación
t ió d de lla compañía
ñí
¾Buen servicio técnico
¾Requerimientos de espacio y utilidad óptimos
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
6
 Métodos Rápidos

Clasificación en áreas de acuerdo a lo que se busca:

¾Sistemas para facilitar la toma de muestras

¾Métodos para ayudar al procesamiento de las muestras
¾Sistemas de cuantificación microbiológica
¾Métodos para identificación y cuantificación de microorganismos
¾Sistemas especiales para análisis de muestras de aguas, ambientales y
superficies
¾Sistemas de identificación mediante métodos moleculares
¾Métodos inmunológicos para detección y/o cuantificación de microorganismos
¾Otros métodos misceláneos

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

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Métodos rápidos para ayudar a la toma de

muestras
t
MUESTREADORES, APLICADORES

Muestreo dinámico
Estandarización
Concepto de trazabilidad

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

8
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Métodos rápidos para ayudar al procesamiento

de la muestra
DILUIDORES
Estandarización
Aumentan productividad
Trazabilidad

PREPARADORES y DISPENSADORES DE MEDIOS DE CULTIVO

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

9
 Indicadores de calidad

Recuentos

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

10
 Métodos rápidos aplicados a Indicadores
microbiológicos
FILM HIDRATABLE: PETRIFILM: 3M

¾Optimizan el espacio de incubación Láminas

deshidratadas que
¾Manual se rehidratan al
¾Algunos protocolos Express inocular la muestra

¾Posibilidad de lector automático

¾Validaciones internacionales

Recuento total
Enterobacterias
E.coli/Coliformes
Mohos y levaduras
Staph. Aureus
Listeria ambiental

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

11
 Métodos rápidos aplicados a Indicadores
microbiológicos
g
SISTEMA TEMPO: bioMerieux

•Fácil preparación de muestra

Trazabilidad
•Trazabilidad
•Mismo protocolo para diferentes parámetros
•Validaciones internacionales

•Recuento Total
•Enterobacterias
E t b t i
Sistema totalmente
•Coliformes
automatizado
E.coli
•E.coli
NMP miniaturizado
i i t i d
•S. Aureus
Lectura por
fluorescencia •Mohos y levaduras
•Bacterias Lácticas

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

12
 Protocolo de trabajo

dilu
ent

X g (or ml) 9X ml

10-1 suspension

Sample
p preparation
p p
Inoculation

Reading & interpretation

13 Incubation
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
 Protocolo de trabajo

dilu
+ =
ent

X g (or ml) 9X ml

10-1 suspension

Sample
p preparation
p p
Inoculation
WIFI

Reading & interpretation

14 Incubation
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
 Protocolo de trabajo
+ =
dilu
ent

X g (or ml) 9X ml

10-1 suspension

Sample
p preparation
p p
Inoculation
WIFI

Reading & interpretation

15 Incubation
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
 Protocolo de trabajo
+ =
dilu
ent

X g (or ml) 9X ml

10-1 suspension

Sample
p p preparation
p
Inoculation
WIFI

RESULTS
READING
REPORT
Reading & interpretation
16 Incubation
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
 Métodos rápidos aplicados a Indicadores
microbiológicos
g

SISTEMAS BASADOS EN IMPEDANCIA: BACTRAC

•Fácil
Fá il preparación
ió de
d muestra
t
•Lectura automática
Más sencillo cuando es “mono-producto”
•Más mono producto
•Necesaria calibración para recuento
•Esterilidad comercial (pasa/no pasa)

Recuento total
E t
Enterobacterias
b t i
Mide los cambios que producen
E.coli/Coliformes los microorganismos de un
Hongos y levaduras cultivo que alteran las
substratos cambiando su
Staph. Aureus conductividad eléctrica y esto
Ácido Lácticas varía la impedancia

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

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 Métodos rápidos aplicados a Indicadores
microbiológicos
g
SISTEMAS BASADOS EN CITOMETRIA DE FLUJO

AES: Bactiflow
•Fácil preparación de muestra
•Lectura automática
•Rápido
•Utilidad:
Utilid d yogures, champús,
h ú cremas,
refrescos, zumos de frutas

Marcaje de las células,

detección una una y contaje
R
Recuento
t ttotal
t l
Enterobacterias
Hongos y levaduras
Salmonella
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
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Métodos rápidos aplicados a Indicadores

microbiológicos
Sembradores en espiral y lectores automáticos de colonias
Deposición
p automática de la
muestra líquida en la superficie
de un placa rotatoria de agar

•Estandarización
•Eliminación de diluciones
•Lectura automática
Ahorro de tiempo
•Ahorro
•Trazabilidad

Lectores
automáticos de
colonias

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

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 Métodos rápidos aplicados a Indicadores
microbiológicos
SISTEMA SimPlate: Biocontrol

. Fácil de leer
· Consistente y reproducible
· Rápido
· Fácil
Fá il de
d preparar
· Menos interferencia
· Amplio rango de conteo
· Tecnología
g innovadora

Placa de p
plástico circular de 84 pocillos
p
Lectura por fluorescencia Recuento total
El número de positivos se convierten en Coliformes/E.coli
valores
l NMP
Mohos y levaduras
Campylobacter

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

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 Métodos rápidos aplicados a Indicadores
microbiológicos
g
SISTEMAS BASADOS EN ATP
•Económico
•Rápido
Utilización en el entorno lácteo: esterilidad comercial
•Utilización
•Más utilizado en control de limpieza y desinfección

Mide niveles de ATP

Lo relaciona con niveles de
contaminación

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

21
 Patógenos

Ausencia/presencia

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

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 Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g
PROTOCOLOS CORTOS
Salmonella:
•Pre-enriquecimiento y placa
•SESAME (BIOSER)
•Manuales
•IBISA ((AES))
•Medios cromogénicos o semisólidos
•SMS (AES)
•Validaciones internacionales
•SALMONELLA PRECIS (OXOID)
•Económicos
E ó i
•RAPID SALMONELLA (BIORAD)
Listeria Monocytogenes:
•ALOA ONE DAY (AES)
•Salmonella
•LISTERIA PRECIS (OXOID)
•Listeria spp
•RAPID LMONO (BIORAD)
•Listeria monocytogenes
•COMPASS LISTERIA (BIORAD)
•CHROMOID LMONO (BIOMEREIUX)
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
23
 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
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 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
25
 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
26
 Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g
SISTEMAS BASADOS EN PRUEBAS ELISA:

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

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 Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g
SISTEMAS BASADOS EN PRUEBAS ELISA
Si
Sistema VIDAS (bi
(bioMerieux)
M i )
•Salmonella
•Equipo automatizado
•Listeria
Li t i spp/Listeria
/Li t i
•Tecnología ELFA
monocytogenes
(elisa+fluorescecia) e
•Campylobacter
py spp
pp inmunoconcentración
•E.coli O157:H7 •Resultados en 16-24 horas
•Toxina Staph aureus •Validaciones internacionales
•Lectura automática, no calibración,
no interpretación
•Procesado de muestras: 12-30
simultáneamente cada 45 minutos

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

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 Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

29
 Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g
SISTEMAS BASADOS EN ELISA

Sistema TECRA (Biotrace)

Salmonella
Listeria spp
•Manual
Campylobacter spp
•Desarrollo
Desarrollo de color
•Resultados : 1-2 días
- +
•Validaciones internacionales
•Posibilidad de realizarlo
automáticamente con el UNIQUE
PLUS

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

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 Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g
SISTEMAS BASADOS EN ELISA

Sistema TRANSIA
(Biocontrol)
Salmonella
Listeria Monocytogenes
Listeria spp

•Automático
•Manejo de elevados volúmenes
•Procesado de muestras: 93
muestras simultáneamente
•Resultados rápidos: 1-2 días
•Validaciones internacionales

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

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 Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g
SISTEMAS BASADOS EN ELISA
L
Lateral
l fl
flow
Rapid test (Oxoid)
VIP (BioControl)
RayAl (Rayal Ltd)
REVEAL (Neogen)
Rapidcheck (Bioser) •Manual
•La
L muestrat difunde
dif d por
capilaridad hacia la zona de Ac
•Lectura habitual p
por una línea
de color
•Validaciones internacionales

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

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 Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g
SISTEMAS BASADOS EN PCR

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

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 Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

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 Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g
SISTEMAS BASADOS EN Real Time PCR (BAX System: Oxoid)

•Procotolos diferentes según

matriz
•Validaciones internacionales
Salmonella spp
•Resultados
R lt d en 24-33
24 33 h
horas
Listeria spp
Listeria Monocytogenes
•Sonda Sybr Green

Campylobacter
E.coli O157:H7
Enterobacter sakazakii
Mohos y levaduras
S.aureus

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

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 Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g

SISTEMAS BASADOS EN REAL TIME PCR (Applied Biosystem):

•2 tipos de kits: Taqman y Microseq

•Validaciones internacionales Salmonella spp
•Resultados en 20-28 horas Salmonella entérica
Listeria spp
Listeria Monocytogenes
E.coli O157:H7
Campylobacter jejuni
•Cronobacter sakazakii
•E. coli O157:H7
•Listeria monocytogenes
•Pseudomonas aeruginosa
•Staphylococcus aureus

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

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 Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g

SISTEMAS BASADOS EN PCR (Adia food: AES)

Salmonella spp
•Termociclador: Stratagen Listeria spp
•Resultados en 19-21 horas Listeria Monocytogenes
E.coli O157:H7
E coli O157:H7 y Salmonella
E.

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

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 Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g

SISTEMAS BASADOS EN REAL TIME PCR (iQ-CHECK: Biorad)

•Sondas: Molecular Beacons

Varios termocicladores:iCycler iQ, chrom 4,
•Varios
iQ 5 y miniOpticon.
•En algunos software de interpretación de
resultados
lt d
•Validación 16140

Salmonella spp
y g
Listeria Monocytogenes
Listeria spp
Campylobacter
E.coli 0157:H7

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

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 Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g
SISTEMAS BASADOS EN REAL TIME PCR (Assurance GDS:
Biocontrol)
•Salmonella
•Listeria spp
•Listeria monocytogenes
•E.coli O157:h7
•Shiga
Shiga Toxin
To in

•Combina concentración de muestra

y detección
d t ió de
d DNA
•Termociclador:Assurance GDS
Rotor-Gene™.

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

39
 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
40
 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
41
 Métodos rápidos aplicados a la detección de
Patógenos
g
SISTEMAS DE DETECCIÓN CON FAGOS
Salmonella
E.coli 0157:H7

•Detección rápida y
+ automática de patógenos
mediante FAGOS ligada
g a
fluorescencia.

Salmonella

+ •Detección
D t ió rápida
á id y
manual de patógenos
mediante FAGOS (lateral
flo )
flow)

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

42
 Food & envt.

225 ml of BPW +
supplement (green)

41.5 +/- 1 °C
18-24 h

Heat & Go 5 min*

min
*Except for poultry & egg products

VIDAS UP Salmonella
48 min
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
43
 Identificación

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

44
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Métodos rápidos aplicados a la identificación de

microorganismos
g

IDENTIFICACIÓN CON SISTEMAS MINIATURIZADOS

•Manual
•Miniaturización de pruebas bioquímicas
•Diferentes formatos: galerías, tubos de plástico,

•API: bioMerieux
•BBL
BBL Enterotube: BD
•BBL Crystal: BD
•RapID™
RapID System: REMEL

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

45
 Métodos rápidos aplicados a la identificación de
microorganismos
g

SISTEMAS AUTOMÁTICOS DE IDENTIFICACIÓN

Fenotípica:
VITEK: bioMerieux
•BIOLOG: AES
•PHOENIX: BD

•Resultados a partir de 4 horas

•Combinan reacciones enzimáticas y
bioquímicas

Genotípica: •Secuenciación del

•MICROSEQ:
C OS Q ABI ARN 16 S

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

46
 Métodos rápidos aplicados a la identificación de
microorganismos
CLASIFICACIÓN FILOGENÉTICA VITEK, API, BIOLOG, PHOENIX

Family Genus Species Subspecies Strain

DNA sequencing

MicroSeq 16S rDNA sequencing

ARDRA

Riboprinter Riboprinting

tRNA PCR
tRNA-PCR

ITS-PCR

BioRad PFGE, LFRFA, RLFP

Multilocus Isozyme

Whole cell protein profiling

ABI AFLP

RAPD APPCR

Diversilab rep-PCR

G
Genetic
ti Differences:
Diff M
More F
Fewer

Technique Discrimination: Low High

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
47
 Métodos rápidos aplicados a la identificación de
microorganismos

•Genera huellas genéticas únicas y reproducibles para cada

una de las muestras
•13 muestras en 4 horas

1. Extracción de ADN: Extracción de ADN a partir de cultivos aislados.

2. Amplificación mediante rep-PCR: Amplificación de muestras con la técnica rep-PCR y los
correspondientes kits de identificación genética DiversiLab (DiversiLab DNA Fingerprinting kits).
3. Detección: Separación de fragmentos mediante electroforesis de microfluidos en chip (DNA
LabChip Kits).
4. Análisis de datos: Análisis de los datos en tiempo real, con informes a los que se puede
acceder a través de un sitio web individual y seguro.
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
48
 Métodos rápidos aplicados a la
identificación de microorganismos
ESPECTROMETRÍA DE MASAS

• Técnica analítica para determinar la composición elemental de

una muestra

• El principio de MS consiste en la ionización de compuestos

químicos p
q para g
generar moléculas cargadas
g y medir su relación
masa/carga (m/r)

• MALDI-TOF
MALDI TOF (Matrix
(M t i Assisted
A i t d Laser
L Desorption
D ti / Ionisation
I i ti -
Time of Flight), es un tipo de espectrometría de masas que
permite el screening de proteínas directamente a partir de
bacterias intactas
Ionization
Mass
Ion
InletDetector
Analyzer
System
System

Data
Sample Analysis
S
System
Under Vacuum
Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
49
 • Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time
Of Flight.
Flight MALDI is the Ionization System-TOF is
the Mass Analyzer system.

1 Una muestra en una solución matriz absorbe energía de un haz láser. El resultados
es una ionización de la muestra.
2 Todos los iones son acelerados a la misma energía cinética, entran en el tubo y
son separados de acuerdo con su masa
3 Detección al final del tubo

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

50
 Métodos rápidos aplicados a la
identificación de microorganismos
ESPECTROMETRÍA DE MASAS

<<C:\Dokumente und Einstellungen\m.erhard\Eigene Dateien\AnagnosTec-dc\Zwischenablage\Dokument Banner.txt>> Spec [BP = 3

3775
3

100
1648.1

7075
90

10939
8074

8744
80

9453

9994
70

7980
% Intensity

60

10347
5015

50

7863
40

11572
7092
5931

9654
3581

6837
30

10226
9330

0608
7367

8450

1906
20

10
7

1
8

11
10
0
3000 5000 7000 9000 11000 13000
Mass (m/z)

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

51
 Métodos rápidos aplicados a la
identificación de microorganismos
ESPECTROMETRÍA DE MASAS

Fungi, yeast and mycobacteria:

On-target extraction

addition of
1.0 µL matrix solution

di t
direct solvent evaporation
at room temperature
Target slide

No selección previa de la colonia

Identificación en solo 2
minutos
automated
MS analysis

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

52
 Métodos rápidos aplicados a la
identificación de microorganismos
•VITEK MS RUO:
bioMerieux
•Maldi Biotyper: Bruker

Pow e r Ionis ing V a cuum N eg ative

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

53
 MUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIÓN

Ana María Fuertes Barrio

ana-maria.fuertes@biomerieux.com

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos

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