AGRADECIMIENTOS

En primer lugar quiero dar las gracias al Dr. Ramón Oliver y Dr. Santiago Hernández por darme la oportunidad de participar en este proyecto realizado en el Departamento de Quimiometría de la Universidad de Barcelona.

En segundo lugar, dar las gracias a la dirección de la parte experimental de este proyecto, al Dr. Xavier Saurina, sus consejos han hecho posible el desarrollo de este.

También agradecer a los compañeros del laboratorio de quimiometría, en especial a Anna y Toni, que me han ayudado a resolver los problemas y dudas que han ido surgiendo durante estos 4 meses.

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CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN

1.1. El vino y sus propiedades
El vino es una bebida alcohólica que se obtiene a partir de la fermentación alcohólica del zumo de uvas y por extensión la obtenida a partir de otros frutos o materiales vegetales. Su elaboración consta de 3 fases principales: obtención del mosto, su fermentación y por último su conservación y envejecimiento. El vino forma parte de nuestra cultura des de hace aproximadamente 6.000 años. A lo largo de estos años la consideración social del vino ha ido cambiando. Hace poco tiempo que el estudio del vino estaba enfocado en los efectos adversos que producen sus componentes, ya que contiene especies químicas causantes de las alteraciones relacionadas con la seguridad alimentaria. En cambio, desde hace una década, el interés científico se ha centrado en los efectos beneficiosos que comporta el consumo moderado del vino para la salud. Los polifenoles no tienen una función conocida en la nutrición (o sea no son nutrientes) y en los estudios se ha demostrado las propiedades biológicas como antioxidantes, antisépticos, antimutagénicas, anticarcinogénicas y antinflamatorias entre otros, que son beneficiosas en la prevención de enfermedades y en la protección del genoma, particularmente para las células epiteliales intestinales, unos de los tejidos más proliferativos del cuerpo humano. Los componentes más importantes del vino son el agua (componente mayoritario), el alcohol etílico (entre 7 y 17 grados alcohólicos), pequeñas cantidades de otros alcoholes, ácido málico, tartárico, cítrico, acético y carbónico, polifenoles (tañimos, antocianos), sustancias nitrogenadas (aminoácidos, aminas), hidratos de carbono, especies inorgánicas (potasio y fosfatos) y sustancias volátiles (aldehídos, cetonas, ésteres). La composición cualitativa y la cuantitativa depende de la clase del vino. La calidad de los vinos se encuentra condicionada por la materia prima, los microorganismos que intervienen en la vinificación y por las condiciones tecnológicas de la elaboración.
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Arantza León Sanz

Una Denominación de Origen es una indicación geográfica que garantiza el origen y la calidad de un vino. Indica que el vino se ha obtenido en zonas delimitadas y que ha estado elaborado según el reglamento preciso (variedades de cepas, rendimiento límite por hectárea, grado alcohólico, prácticas vinícolas y envejecimiento, calidades organolépticas, etc.)

1.1.1.

Vinificación
nombrado vinificación

Las diversas etapas del proceso de elaboración del vino son las siguientes:

Vendimia: es la cosecha de la uva cuando ha alcanzado el grado de maduración deseado, la composición de la cual depende de la variedad, el clima, el suelo y del agua. La mezcla de variedades de uva: se determina por el vino que se quiere obtener. La separación de la rapa: se ha de separa la parte leñosa del racimo de la uva mediante una máquina llamada despalilladora. Obtención del mosto: puede ser por dilaceración (rotura de los granos del racimo mediante rodillos o cilindros), por centrifugación (separando las partes sólidas del líquido) o por prensado (directamente o mediante separación previa de la rapa). En otros tiempos se conseguía pisando la uva con los pies. Correcciones y manipulaciones del mosto: es la enyesada (con sulfato de calcio), la sulfatación (con dióxido de azufre o derivados) y la fosfatación (con fosfatos) para obtener vino de características correctas y constantes. Fermentación alcohólica: se vuelcan en grandes depósitos de madera o acero inoxidable donde el mosto va fermentando debido a las levaduras, transformando los azúcares en alcohol etílico y CO2. Actualmente se acostumbra a inactivar la levadura del mosto por sulfatación y se añade la levadura seleccionada. Durante el proceso, en el cual se ha de controlar la temperatura y el aire, los restos de sólidos suben a la superficie impidiendo la correcta ventilación. La fermentación que primeramente es lenta, después es tumultuosa y finalmente vuelve a ser lenta, tiene una durada que oscila entre unos cuantos días y algunas semanas. Es importante controlar el pH de este proceso ya que de él depende su rendimiento. Si se trata de un vino negro o rosado hace falta que la piel esté en contacto con el mosto fermentado ya que los antocianos (donadores del color) sólo se disuelven bien en alcohol. En este caso, se lleva a cabo la maceración carbónica, proceso en el cual el racimo se fermenta sin romper la uva. El método convencional de fermentación alcohólica comporta la rotura o aplastamiento de los granos de uva para liberar el zumo y la pulpa de la piel. En la maceración carbónica el zumo fermenta mientras se encuentra aun dentro de la piel del grano. Fermentación málico láctica: es debido a bacterias que producen la descarboxilación del ácido málico dando lugar al ácido láctico, alcoholes
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pero también puede conducir a su deterioramiento debido a la formación de aminas biogénicas. el vino se vuelve a trasegar. • • Trasegar: facilita el aireo y la separación del poso. Reserva y Gran Reserva. -9- . Polifenoles en el vino Los polifenoles son un grupo de sustancias químicas formadas por anillos aromáticos y caracterizados por la presencia de al menos un grupo fenol en su estructura. pero. se puede someter el vino a diversas correcciones: alcoholización o adobamiento. Pasa en las bodegas y puede incluir una fermentación málico láctica espontánea. Estructuralmente van des de moléculas simples como los ácidos fenólicos a polímeros de alto peso molecular como los taninos. bentonita o enzimas.2. en esta etapa se producen un conjunto de oxidaciones. Puede dar lugar espontáneamente después de la fermentación alcohólica o se puede inducir. habitualmente roble. corrección de la cata del vino dulce con azúcar o con mosto (vino vertido) y clarificación con gelatina. después del cual el vino adquiere unas características similares a las que se conseguirían haciéndolos envejecer en la bodega durante tres meses. que se añade al trasegado. Embotellamiento: para obtener la calidad deseada. perdida de color y aumento del acidez volátil. Son productos esenciales para la fisiología vegetal y en general. Estos vinos serán los nombrados de Crianza. que consiste en mantenerlos a una temperatura próxima a la de su punto de congelación durante un periodo de ocho días. adición de ácido tartárico o ácido cítrico. reducciones y esterificaciones que completan la maduración del vino. La mayoría de vinos de mediana y baja calidad son sometidos. Tiene lugar en botas de madera. neutralización. son potentes antioxidantes. corrección del color. Envejecimiento: químicamente. Prensa de la parte sólida: da un nuevo líquido. al envejecimiento acelerado.Determinación de Polifenoles en el Vino y CO2. Esta fermentación aporta una disminución del pH a la vez que aumenta el contenido en polifenoles y glicerol. Segunda fermentación lenta: reposo y enfriamiento del vino que facilita su transparencia. la cual cosa da lugar a una perdida de acidez del vino y una ganancia en suavidad y aroma. y el intercambio de aromas entre el vino y la madera le confiere a estos unos rasgos más complejos. • • • 1.000 polifenoles diferentes. o se obtiene un vino de menos calidad (vino prensado). Después. y tiene una duración que varía desde tres meses hasta más de cinco años. Se estima que hay más de 8.

Tabla 1. como ahora los taninos.--------------. pero se piensa que es muy alta. Estos efectos son debidos al hecho que algunos polifenoles.--------------.C1 Ácidos Fenólicos Ácido Gálico -------------------------.1. el interés nutricional de estos compuestos requiere en los efectos adversos que se producen. en semillas y en la pulpa.------------------------.------------------------------7 C6 .Clasificación de los polifenoles. y puede superar el gramo por día en algunas poblaciones.------------------------------8 C6 . Clasificación Polifenoles Átomos de Carbono Esqueleto Tipo Ejemplos presentes en vino 6 C6 Fenoles Simples Benzoquinonas -------------------------.------------------------.C2 Derivados de Tirosina Ácidos Fenilacéticos Tirosol . No obstante esto. precipiten proteínas presentes en los alimentos y también forman complejos insolubles con algunos oligoelementos y por lo tanto disminuyen el valor nutricional de los alimentos. La siguiente tabla muestra el tipo de polifenol según el número de átomos de carbono y ejemplos de esos polifenoles en el vino. y después del proceso de vinificación los encontraremos en el vino. hasta hace poco tiempo. Los compuestos polifenólicos de la uva se encuentra en la piel.Arantza León Sanz Los polifenoles se subdividen de la siguiente manera: Figura 1. La ingesta total de polifenoles en el ser humano es difícil de calcular.10 - .

Papel de los polifenoles en el vino Los polifenoles se les atribuye diferentes efectos beneficiosos para la salud humana.C2-C6 Estilbenos Antraquinones -------------------------.--------------. por lo tanto.------------------------.1.------------------------------n6 (C6)n Melaninas Catecolicas -------------------------.--------------.------------------------.Determinación de Polifenoles en el Vino -------------------------.--------------.------------------------------9 C6 .------------------------------15 C6-C3-C6 Flavonoides Isoflavonoides Quercetina Cianidina Catequina Miricetina Malvidina -------------------------.------------------------. En la última década los compuestos polifenólicos han despertado un gran interés en la comunidad científica.--------------. neurodegenerativas como el Alzheimer o el Parkinson.--------------. Muchos se investigan con profundidad para determinar si resultan útiles como anticancerígenos y en el tratamiento de otras enfermedades de gran trascendencia social.------------------------------n15 (C6-C3-C6)n Taninos Condensados Procianidina 1. ya que la mayoría de estos compuestos actúan como antioxidantes y.--------------.------------------------------13 C6 -C1-C6 Xantonas -------------------------.------------------------------10 C6-C4 Naftoquinones Ácido Cafeico -------------------------.------------------------.--------------.--------------.C3 Ácidos cinámicos Fenilpropenos Cumarinas -------------------------. .2.------------------------.--------------.11 - .------------------------.------------------------.------------------------.------------------------.------------------------------18 (C6-C3)2 Lignanos Neolignanos -------------------------.------------------------------30 (C6-C3-C6)2 Bioflavonoides Resveratrol -------------------------.--------------.------------------------------n9 (C6-C3)n Ligninas -------------------------. el proceso de envejecimiento o el cáncer).------------------------. podrían tener efectos beneficiosos sobre enfermedades en que la oxidación representa un papel importante (enfermedades cardiovasculares.------------------------------14 C6.

Concentracion en mg/L de algunos constituyentes polifenolicos del vino.0 0.5 9.12 - . A . Además. se han realizado diversos estudios que demuestran que el vino tinto presta mayor protección cardiovascular a diferencia del vino blanco. pero en cantidades diferentes.0 0.Arantza León Sanz Los polifenoles se encuentran en todos los tipos de vinos. Urquiaga en su estudio [1] de polifenoles dan valores equivalentes a los de la tabla 1.1 8.0 0.03 Tabla 1.3 donde se comparan diversas bebidas [2]. Tabla 1.0 1. Polifenoles Ácido gálico Catequina Epicatequina Ácido cafeico Cianidina Malvidina 3-glucosa Rutina Miricetina Quercitina Resveratrol Vino tinto Vino blanco 95 191 82 7. F.5 7 35 21 2.3.1 2. El vino tinto contiene muchos más polifenoles que el blanco.8 0.7 1. [3] La fracción de polifenoles hidrosolubles representa el 71% de sus componentes fenólicos por lo tanto lo más importante en cuanto a capacidad antioxidante.2.5 7.8 23. Leighton y I. contenido total de polifenoles en diversas bebidas.0 0. mientras que los vinos rosados se encuentran en una posición intermedia. Contenido total de polifenoles (mg/L) Vino tinto Vino blanco Cerveza Te 1000-4000 200-300 60-100 750-1050 En un estudio de un vino tinto Cabernet Sauvignon se hizo un fraccionamiento y análisis por cromatografía líquida de alta presión (HPLC) obteniéndose como resultado tres fracciones: • • • Polifenoles neutros Polifenoles ácidos En la fracción acuosa residual las antocianinas.

2. y recientemente se asocia a la protección de enfermedades neurodegenerativas. Ácidos Fenólicos • Ácido Siríngico • Ácido Gálico . hablamos del resveratrol. y se unen a las lipoproteínas humanas de baja densidad (LDL) después de un consumo moderado de vino.Determinación de Polifenoles en el Vino pesar de estola fracción de polifenoles neutros es la que tuvo mayor actividad antioxidante por unidad de concentración de polifenoles.13 - . Su contenido en el vino depende de la variedad de uva y de la tecnología aplicada en la producción vinícola. ayuda a reducir el riesgo de enfermedades coronarias.2. que es un producto natural que se encuentra principalmente en la piel y piñones de la uva. Polifenoles Utilizados A continuación se muestra una lista con la clasificación y la estructura de cada uno de los polifenoles estudiados en este proyecto: 1.[4] Como ejemplo de los polifenoles. Es un potente antioxidante al que se le atribuyen diferentes efectos beneficiosos como actividad antiinflamatoria y antitumoral. [5-7] 1.

Arantza León Sanz • Ácido Vanílico • • 3.4-dihidroxibenzoico • 4-hidroxibenzoico .14 - .

15 - .Ácidos Cinámicos • Ácido Cafeico • Ácido Cumárico • Ácido Felúrico . .Determinación de Polifenoles en el Vino 2.

Arantza León Sanz 3. .Flavonoides • Epicatequina • Catequina • Quercetina .16 - .

4. De todos ellos se da una descripción en [22]. el tipo de uva. También se han descrito métodos inmunológicos y enzimáticos [16.9] CE [10-12] o GC [13-15]. El HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica. La caracterización de los vinos según la familia de compuestos estudiada la caracterización se enfoca en una dirección o en otra. La caracterización de los vinos respecto a los polifenoles esta enfocada más en este sentido que no con el proceso vinícola. 1. a pesar de que la composición de compuestos polifenólicos también se puede caracterizar los vinos según la región. el análisis discriminante linear (LDA). Este perfil composicional puede dar información relevante. el contenido de polifenoles [19.17] de gran interés debido a la rapidez del análisis. Cromatografía de líquidos (HPLC) liquid La cromatografía líquida de alta eficacia o High performance chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografía en columna. Estos métodos realizan la detección mediante técnicas espectrofotométricas. las redes neuronales artificiales (ANN) y la refresión por mínimos cuadrados parciales (PLS) se utilizan para obtener clasificaciones mas especificas. los orígenes o otros factores. fluorimétricas o acoplamiento a MS.3.1. La composición elemental e isotópica [18]. . el envejecimiento. Técnicas utilizadas 1. Otros métodos como el análisis de agrupaciones (CA). La determinación polifenoles se suele llevar a cabo mediante técnicas de separación como HPLC [8.20] y las imprentas digitales de compuestos volátiles [21] han estado utilizadas en diversos estudios para clasificar y correlacionar los vinos según la vinificación.17 - . Métodos analíticos para la determinación y caracterización de los polifenoles en el vino Los polifenoles son los compuestos más relacionados con las propiedades organolépticas del vino. También hay estudios que tratan de extraer información de otras propiedades.4. El contenido de los polifenoles en los vinos mantiene una fuerte dependencia con el clima.1. la agricultura y las prácticas vinícolas. Los estudios realizados con polifenoles se decantan para caracterizar los vinos según sus propiedades organolépticas. En la HPLC isocrática el compuesto pasa por la columna cromatográfica a través de la fase estacionaria (normalmente. etc. El análisis por componentes principales (PCA) es el método quimiométrico más utilizado para un estudio preliminar de las propiedades de los vinos a partir de los datos de los perfiles composicionales anteriormente nombrados. un cilindro con pequeñas partículas redondeadas con ciertas características químicas en su superficie) mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna.

visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas. o sea. Electroforesis Capilar (CE) Se basa en una técnica de separación de analitos mediante la aplicación de un campo eléctrico. La absorción de las radiaciones ultravioletas. Fluorescencia La fluorescencia es la propiedad de una sustancia para emitir luz cuando es expuesta a radiaciones del tipo ultravioleta. de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. una molécula absorbe un fotón de alta energía. 1.2. En el proceso. El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retención y se considera una propiedad identificativa característica de un compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria. Sus límites de detección están condicionados por el pequeño volumen de muestra introducida en el capilar. Cuando la luz atraviesa una sustancia. generalmente del orden de pocos nL. esta técnica resulta adecuada para separar muchos analitos en una gran diversidad de áreas.Arantza León Sanz La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna.3. Para facilitar la detección se ha desarrollado diversas estrategias de derivatización.18 - . Espectrofotometría La espectrofotometría es un método de análisis óptico que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto. la energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida. son transformadas en luz visible. 1. [23] 1.4. rayos catódicos o rayos X. y es característica para cada sustancia química. La diferencia de energía entre la absorción y la emisión. eleva eficacia y bajo consumo de muestra. es disipada como calor (vibraciones moleculares). En la fluorescencia todo el proceso es muy corto . El gran poder de separación.4.4. aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe radiaciones de longitudes de onda que no pertenecen al espectro visible. El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbidas. de una longitud de onda mayor al incidente. La Ley de Beer declara que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentración en la solución. El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto. y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia. se excita y después emite como un fotón de baja energía (mayor longitud de onda). Las radiaciones absorbidas (invisibles al ojo humano). el agua fuertemente en la región del infrarrojo. parte de la energía es absorbida.4. Todas las sustancias pueden absorber energía radiante.

P la matriz de vectores propios. de modo que el primer componente principal describe la máxima cantidad de información posible referente al sistema. suelen representarse los scores del primer componente principal con respecto a los scores del segundo. que representan la dirección de los componentes principales en el espacio de las variables originales. Métodos quimiométricos tratamiento de datos para el El análisis por componentes principales (PCA) se basa en concentrar la información de un sistema. También. Los componentes principales se obtienen por combinación lineal de las variables originales a través de una serie de transformaciones. es ortogonal o perpendicular al primero y describe la máxima cantidad de la información residual. . El análisis por componentes principales actúa a modo de filtro de datos. 1. El superíndice T se utiliza para indicar la matriz transpuesta. eliminando la información repetitiva y las variaciones aleatorias asociadas al proceso experimental.Determinación de Polifenoles en el Vino (>10-5 s) y este intervalo de tiempo es la principal diferencia con otro conocido fenómeno luminoso. la fosforescencia (<10-5 s). se consigue una distribución bidimensional de los objetos en la que pueden apreciarse las diferentes agrupaciones y los objetos que se separan de ellas. En ciertos casos particulares son interesantes las representaciones de los componentes principales superiores. todos ellos ortogonales entre sí. por su parte. De esta forma. las representaciones de los loadings proporcionan un información muy útil acerca de la relevancia de las variables y de sus posibles correlaciones. De esta forma se van calculando los componentes principales superiores hasta que toda la información relevante del sistema queda descrita. autovectores o loadings.19 - . que originalmente puede estar contenida en un gran número de variables. Puede utilizarse para una caracterización preliminar de los datos y para establecer pautas y dosificaciones. y E la matriz de error de la reproducción de los datos en sus componentes principales.5. Normalmente. El PCA descompone la matriz de datos experimentales en sus componentes principales de la siguiente forma: R = TP T + E (1) Siendo R la matriz experimental. El segundo componente principal. T la matriz de coordenadas principales o scores que contiene las coordenadas de cada muestra en el nuevo espacio de componentes principales.

4-dihidroxibenzoico (3.4-h) Catequina (Cat) 4-hidroxibenzoico (4-h) Epicatequina (Epi) Ácido Siringico (Syr) Ácido Cafeico (Caf) Ácido Vanílico (Van) Ácido Cumárico (Cum) Ácido Felúrico (Fel) . reactivo para HPLC) 2-Propanol (Merck.20 - .1. reactivo para HPLC) Agua Milli-Q (Millipore) Ácido Fosfórico (Merck. Reactivos Reactivos y disolventes: • • • • • • Tetraborato de sodio decahidratado (Merck. reactivo analítico) Hidróxido de sodio (Merck. reactivo analítico) Metanol (Merck. reactivo analítico) Polifenoles: • • • • • • • • • • Ácido Gálico (Gal) 3.CAPÍTULO 2: PARTE EXPERIMENTAL 2.

2007. 2.o. d. La Mancha. Tinto Fino (100%) 2006. d. • • • • • • • • • • Clos Gebrat. Crianza (M5) Torres Coronas. Tempranillo 2005. Gran Reserva (M16) Protos. d. Joven (M8) de Barberà. Soluciones Las soluciones madre de cada uno de los polifenoles se han preparado en concentraciones de 100 mM en metanol.o. Catalunya. Tempranillo 2007.3. 2007.o.2.o Liria. d. La Mancha. Crianza (M14) Pata Negra. Ull de llebre 70%. d. Conca Tempranillo 2008. d. Costers del Segre 2006. Todas las soluciones se mantienen en el frigorífico. Ribera del Duero. Joven (M17) • • • • • • . Valdepeñas. Cabernet Sauvignon 2005. La Mancha.o. Costers del Segre. Joven (M1) Castillo de Liria. d. Tempranillo 2001.o.21 - . Crianza (M12) Señorío de los Llanos. d. tempranillo 1999. Joven (M9) Abadia Raimat. Penedès. d.o. d. d. Valdepeñas.o. Catalunya. d. Crianza (M6) Señorío de los Llanos. d.o. Tempranillo 2006.Determinación de Polifenoles en el Vino • Resveratrol (Resv) 2. Crianza (M10) René Barbier. Joven (M2) Viña Fadrí. Tierra de Extremadura. d. Ull de llebre (100%) 2004.o. d.o. Valdepeñas. Tempranillo y Garnacha 2007. Reserva (M11) Raimat viña 32. 2007.o. Joven (M13) Estola. Muestras de vino De cada vino se almacena en la nevera 30 mL en un recipiente de plástico. Priorat.o. Gran Reseva (M15) Finca Vieja. Tinta del País 2007. A partir de las soluciones madre se han preparado todas las soluciones de trabajo utilizando agua Milli-Q como disolvente. Joven (M3) Don Luciano. d. Cabernet Sauvignon. Cabernet Sauvignon 20% y Merlot 10% 2004. Ribera del Duero. Crianza (M4) Finca Resalso.o.o. sin filtrar y sin desgasificar. d. • 5 viñas.o.o. Crianza (M7) Josep Foraster. 2006.

Joven (M21) Tierras Reina. Tinta de Toro. d. Joven (M18) Bajoz.o. Sauvignon Tempranillo y Merlot 2007. 2007. Sauvignon Tempranillo y Merlot 2005. d. Reserva (M27) Irache.4.o. Crianza (M23) Viña Vial. d.. Cabernet Sauvignon. Cabernet Sauvignon y Garnacha 2007. d. Garnacha Tinta y Mazuelo 2004. d. Joven (M25) Duque de Azara.i. Columna cromatográfica Synergi Hydro-RP C-18 (150 mm x 4. (M29) Garnacha y Cabernet • • • • • 2.22 - . Crianza (M26) Señorío de Lazán. Ribera del Duero. Joven (M28) Gran Feudo. Bierzo. detector de diodos en serie G1315B equipado con una celda de flujo de 13 µL y detector de fluorescencia G1321A.o. Rioja. d. • • • • • .o.i. 2006.o.o. Tempranillo 2006. 670 mm de longitud total y 587 mm de longitud efectiva. Mencía 2007.o. Somontano.Arantza León Sanz • • • • • • • Tilenus. Tempranillo. Joven (M19) Valpinicia.o. desgasificador de vacío G1379A. d. x 375 m d. la inyección de las muestras se lleva a cabo mediante una válvula de inyección de seis puertos Rheodyne 7725(i) con un helicoide de 20 µL de volumen. Rioja.o. Navarra. Navarra.o. Electroforesis Capilar (HP 3D CE. Somontano. Somontano. Rioja. Joven (M22) Viña Zaco.) de la misma casa. Reino Unido) Espectrofotometro Perkin-Elmer λ-19.) y 4 µm de diámetro de partícula de Phenomenex con una precolumna C18 (4mm x 3mm d. Tempranillo. Rioja. Instrumentación y Aparatos Los instrumentos y aparatos utilizados han sido los siguientes: • Cromatógrafo de líquidos Agilent 1100 series equipado con bomba cuaternaria G1311A. 2007. Agilent Technologies. 2008.e.o. controlado por ordenador Espectrofluorímetro Aminco serie 2 modelo AB2. d. Reserva (M24) Duque de Azara. Germany). d. equipada con un detector en serie de diodos y refrigeración del capilar por aire. Reserva. d.6 mm d. (CMS. Tempranillo. Moristel y Tempranillo 2004. Sauvignon 2004. Crianza (M20) Señorío de Arriezu.i. d.o. Capilares de sílice fundida de 75 m d. d.

La detección se ha realizado a 230 nm con un detector en serie de diodos y para la obtención de datos se ha utilizado el software suministrado por el fabricante (HP ChemStation). 100.e.1. 320 nm. . Tiempo (min) 0 20 22 27 28 % Eluyente B 5 60 95 95 5 Se inyecta un volumen de 20 µL de cada vino filtrado previamente con un filtro de 45 m con ayuda de una jeringa. Japan) 2. Nichiryo Co. Tabla 2.) de la misma casa.i. todos ellos a una presión de ~ 1 bar finalmente se ha de equilibrar el capilar con el electrolito de separación aplicando el potencial de trabajo durante 30min.2) con un 20% de 2-isopropanol. Cromatografía de líquidos (HPLC) Para la separación de los polifenoles se ha utilizado una columna cromatográfica Synergi Hydro-RP C-18 (150 mm x 4.6 mm d. Para la obtención de datos se ha utilizado el software suministrado por el fabricante (HP ChemStation).i. La detección se ha realizado a 280 nm.2.1 M durante 20 min.5. El electrolito de separación es bórax 20 mM (pH acuoso 9. y el eluyente B.. Electroforesis Capilar (CE) Para la separación de los polifenoles se ha utilizado un capilar de sílice fundida de 75 m d. 360 nm y 520 nm con el detector UV-Visible. La temperatura de termostatización del capilar de 25ºC. En el detector de fluorescencia la detección esta comprendido en un intervalo de 260 – 375 nm. El caudal es de 1 mL / min. solución orgánica.1 M durante 2 minutos seguido de 1 min de agua y 2 min de electrolito todos ellos a una presión de ~ 1 bar. 1000 y 5000 µL (Nichipet EX.5. Procedimiento experimental 2.5.) y 4 µm de diámetro de partícula de Phenomenex con una precolumna C18 (4mm x 3mm d. solución acuosa. el capilar se ha de activar con NaOH 0.23 - .1. es metanol 100%. Antes de cada inyección se proceden a un pre-condicionamiento de capilar con NaOH 0. es ácido fosfórico a una concentración de 9 mM. 5 min de agua y 3 min de electrolito. Tabla del gradiente.Determinación de Polifenoles en el Vino • Micropipetas automáticas de 10. Acondicionamiento del capilar Antes de la primera inyección del día. El eluyente A. 670 mm de longitud total y 587 mm de longitud efectiva. 2. El potencial de separación es + 25 KV y las intensidades obtenidas del orden de 30 A. x 375 m d..i.

2. Fluorescencia Se han registrado los espectros de excitación – emisión de 29 muestras de vino en un intervalo de longitud de onda de excitación entre 250 nm y 275 nm y de emisión entre 260 nm y 460 nm. El objetivo. Se trabaja con una solución de 200 µL de vino en un matraz de 10 mL enrasado con agua Milli-Q. Se utiliza como blanco el agua Milli-Q. Espectrofotometría Se han registrado los espectros UV-Visible de cada muestra de vino en un intervalo de longitud de onda comprendido entre 200 nm y 900 nm. Las muestras de vino se diluyen en agua Milli-Q. es determinar el punto máximo de excitación y el de emisión.24 - . Las muestras de vino se diluyen en agua Milli-Q. Se trabaja con 100 µL de vino que se lleva a un matraz de 10 mL y se enrasa con agua Milli-Q.5.3.5. .4.Arantza León Sanz 2.

1. epicatequina. 360. ácido felúrico.6 mm d. ácido siríngico.) y 4 µm de diámetro de partícula de Phenomenex Precolumna C18 (4mm x 3mm d. 320.CAPÍTULO 3: RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3. resveratrol) de los cuales se ha estudiado el tiempo de retención y los espectros de cada uno. las condiciones experimentales de separación han de permitir separar el máximo nombre de analitos en el menor tiempo de análisis.1. Como criterio de optimización.i. ácido cumárico. Optimización del gradiente de elución a) Estudio de muestras sintéticas de polifenoles Se ha analizado el comportamiento cromatográfico de 11 polifenoles (ácido gálico. Y de la solución anterior se prepara otra de 200 µL en 1mL de agua Milli-Q teniendo así una concentración de 0.25 - .0025 mM. Cromatografía de líquidos (HPLC) En este apartado.i. ácido cafeico.1. catequina. 3. se describirán todos los estudios realizados para separar el mayor número de compuestos polifenólicos.5) Eluyente B: Metanol 100 % Caudal de 1mL/min λ = 280. a partir de las soluciones madre 100 mM preparadas en metanol.) de Phenomenex • 3. 520 nm Columna cromatográfica: Synergi Hydro-RP C-18 (150 mm x 4. 4-hidroxibenzoico. Se ha preparado una solución madre de polifenoles de 25 µL de cada polifenol en 2 mL de metanol. ácido vanílico. . Se han fijado algunas de las condiciones cromatográficas: • • • • • Eluyente A: 9 mM H3PO4 (pH = 2.4-dihidroxibenzoico.

5. llamado post-time. 10 D) Tiempo (min) 0 30 32 34 35 % Eluyente B 0.15 180. es decir. Para asegurar que entre cada análisis la columna esté estabilizada se añade un periodo de 5 minutos más al final.27 168. sin cola y que se pueden identificar todos ellos excepto 3 polifenoles que son difíciles de separar adecuadamente. se estudia el comportamiento de los polifenoles en función del porcentaje inicial del eluyente B (Metanol) de la pendiente del gradiente de metanol generado. Tabla 3.26 - . 5. 5. . 5. 5. Método A) Tiempo (min) 0 15 17 19 20 % Eluyente B 0. 10 60 95 95 0. 10 C) Tiempo (min) 0 25 27 29 30 % Eluyente B 0. Optimización de la programación del gradiente de elusión para las muestras sintéticas de polifenoles.1 se muestra el diseño experimental utilizado. 10 60 95 95 0. 10 60 95 95 0. 5. 10 60 95 95 0.16 Familia Flavoniode Ácido Fenólico Ácido Cinámico En la tabla 3.2. Estos polifenoles son: Tabla 3.3 se refleja los tres polifenoles sintéticos que no se han podido definir correctamente en función del porcentaje inicial de eluyente B frente al tiempo que transcurre la pendiente del gradiente de metanol generado (60%). 10 Comprobamos que los picos salen bien definidos.Arantza León Sanz Con esta última solución. 10 B) Tiempo (min) 0 20 22 24 25 % Eluyente B 0. Polifenoles Polifenol Epicatequina Ácido vanílico Ácido Cafeico Peso molecular 290. 5.1. 5. En la tabla 3.

4 11.8 12 12.5 17 17. 402 14. 2 11. 264 DAD1 A. Sig=280. 50 (ARANTZA\14ABR006.449 Tiempo (min) 30 11. Se estudia el comportamiento de los polifenoles en función del porcentaje inicial del eluyente B (Metanol) de la pendiente del gradiente de metanol generado. 5 12.606 16.5 18 min 0 13.900 30 20 20 20 10 0 0 11.665 11. 5 19 19.5 16 16.5 min 0 12 12. En este caso se amplia el tiempo de post-time a 10 minutos para asegurar que la columna está estabilizada y preparada para el siguiente análisis.5 12 12.5 min 11 11.928 15. Sig=280.5 14 14.784 12.4 Ref =600.4 10. D) 11.5 15 15. Sig=280.594 12.4 Ref =600. D) 15.020 14.5 min 0 0 12 12.982 40 60 50 40 11.728 70 19.4 se muestra el diseño experimental utilizado. 50 (ARANTZA\14ABR009.513 13.5 16 16.4 11.164 15.50 (ARANTZA\ 16ABR001.D) 17.521 30 16. 271 15.5 13 13.5 14 14.2 12.4 Ref =600. .6 min DAD1 A. 012 20 15.5 18 18.5 15 15. 5 14 14.5 15 15.4 Ref =600. Sig=280.8 12 12.272 13. 653 30 30 13. Sig=280.282 11. 377 16.592 30 30 30 14. D) m AU mAU 70 mAU 14.6 10.846 14.4 Ref =600. 4 11. % Eluyente B 0 DAD1 A.718 10.50 (ARANTZA\14ABR001.741 20 20 20 10 10 10 0 14.8 11 11.851 14.4 Ref =600. Sig=280.4 min 9.4 Ref =600.5 13 13. 240 20 20 20 10 10 10 0 13.4 12.5 min 0 12. 295 DAD1 A.6 11.6 11.5 16 16. Sig=280. D) 5 DAD1 A. Sig=280. se estudia una muestra de vino filtrada previamente con un filtro de 45 µm para asegurar que no entra ninguna partícula que pueda obstruir la precolumna y la columna. 2 11. Sig=280. D) 16.50 (ARANTZA\16ABR002.50 (ARANTZA\14ABR005.744 14.D) 13.480 40 10. 50 (ARANTZA\14ABR008.603 60 60 60 50 50 50 30 40 40 40 30 17. 5 18 18. 512 18.457 DAD1 A. D) DAD1 A.953 12. 50 (ARANTZA\ 14ABR010.978 12.8 11 11.5 16 16.022 16.3.065 10.468 10 DAD1 A.8 10 10.4 Ref =600.4 Ref =600.5 15 min DAD1 A.D) mAU 90 mAU 100 mAU 100 12.4 Ref =600.5 14 14.2 12.954 30 18.8 13 min 0 10.4 Ref =600.5 17 17. Sig=280.4 Ref =600.5 17 17.5 14 14. En la tabla 3. Optimización de la programación del gradiente de elución de separación de polifenoles. 5 min b) Estudio con una muestra de vino En este apartado.096 DAD1 A. 50 (ARANTZA\14ABR007.6 12.5 13 13.563 13.50 (ARANTZA\14ABR004. 298 12.2 10.Determinación de Polifenoles en el Vino Tabla 3. D) 14.167 60 60 60 50 50 50 15. 928 13. Sig=280.113 . 318 10.50 (ARANTZA\14ABR012.922 17. D) 13. 2 11.5 15 15.27 - 13. 079 80 80 80 70 60 60 15 11. Sig=280.003 25 40 40 40 mAU 80 mAU 70 mAU 70 18. 446 20 40 40 40 12.5 20 min 0 15 15. 647 13 13. 5 min DAD1 A. D) DAD1 A.50 (ARANTZA\14ABR003. 084 mAU 80 mAU 80 mAU 70 70 70 60 60 60 50 50 50 14.531 20 20 10 10 10 0 16.

5 Tabla 3.708 15.246 4.576 7.488 15.940 3.160 17.28 - 16. 10 % Eluyente B 0. 5.336 6.810 35 35. 10 60 95 95 0.062 9.060 12.498 21.960 18. Sig=280.490 0 0 0 0 19.871 13.993 22.490 2. Sig=280.947 24.732 2.244 20. Optimización de la programación del gradiente de elusión aplicada en muestras comerciales de vino.439 14. 5.095 18.637 7.245 17.604 5.4 Ref =600. 10 Figura 3.443 8.256 14.129 2.966 10. 5.423 3. 10 60 95 95 0.322 23.695 3.443 1.362 12. 10 60 95 95 0.965 6.939 10 % Eluyente B 0.198 14.713 12.092 11.583 23.324 3.263 10.4.568 1.689 15 14.695 1. 5.543 1.405 12.323 15.562 12.5 11.316 17.5 28.409 10.479 6.937 33.092 21.531 24.077 6.042 14.059 27.702 17.465 9.038 17.266 19.819 2. 5.909 4.233 35.578 2. 5.008 3.688 6.439 38 33 28 23 20.141 13.130 23.473 14.514 9. .198 22.2.733 13.811 4.829 17. 10 % Eluyente B 0.468 18.823 8.441 4.840 26.764 15.818 min min .319 13.856 20 20.837 11.586 11.313 2.763 2.915 5.327 3.415 18.685 20 32.068 3. 5.944 29.667 12.420 5 8.583 16.842 Tiempo (min) Tiempo (min) Tiempo (min) Tiempo (min) 10 10.133 4.335 30 30.420 11. Cromatograma de una mezcla de vino.506 10.464 23.354 4.876 17.426 1.032 7.674 21.361 17. 0% de eluyente B inicial a 15 min.905 7.50 (ARANTZA\16ABR005.608 2.765 19. 10 % Eluyente B 0.D) DAD1 A.968 7.530 12.992 18.201 13.882 2.4 Ref =600.181 15.599 8.017 12.869 5.5 1.883 6. 10% de eluyente B inicial a 30 min. 5.513 17.696 7. 9.813 15 30 32 37 25 27 32 20 22 27 15 17 22 25 25.378 7.285 9.312 DAD1 A.748 16.732 9.50 (ARANTZA\16ABR006.330 24.D) 5 5.960 12.953 1.548 10.232 2.662 4.871 3.824 9.159 6. Figura 3.492 13.372 18.570 5.189 6. Cromatograma de una mezcla de vino.126 5.456 17.523 15.Arantza León Sanz mAU 100 200 300 400 500 0 100 150 200 250 300 350 400 50 mAU 450 0 0 Método 0 E) F) G) H) 2.451 7.1.808 14.199 8.620 16.054 2.377 6.286 5. 10 60 95 95 0.686 5.

Es decir. a diferencia del estudio de los polifenoles no se puede apreciar con facilidad cuál de los estudios es el más adecuado como se puede ver en los ejemplos de las representaciones cromatográficas.083 32.685 18.428 28.937 n Picos 75 73 70 83 80 85 93 86 82 85 87 79 n Picos Filtrados 71 70 67 79 77 83 91 86 77 83 86 77 * Tiempo que dura el gradiente de elusión aplicado.197 33. Seleccionamos dos criterios para tratar los datos obtenidos: a) Factor de tiempo (dtiempo) Se da el valor 1 cuando el tiempo es inferior a 15 min y se da el valor 0 al tiempo que supere 30 min.Determinación de Polifenoles en el Vino En este caso. Escoger el último pico del cromatograma como referencia para establecer el tiempo de análisis.517 23. Eliminar todos los picos con una altura inferior a 3 mAU (n picos filtrados). Este tratamiento consiste en: 1.174 33. En este caso interesan los valores más próximos a 1 (óptimo) que los próximos a 0. por lo tanto. se hace un tratamiento de datos.3. (min) 18.286 28. Estos límites se fijan por criterio propio. .29 - . 2. 4.548 23.646 18. Representación gráfica del criterio factor tiempo. Tabla 3. 3. Tratamiento de datos para optimizar el método.394 28. desde el %B inicial hasta el 60% de B.604 23. Figura 3.5. Seleccionar todos los picos del cromatograma (n picos). Método % Eluyente B Tiempo (min)* 0 15 0 20 0 25 0 30 5 15 5 20 5 25 5 30 10 15 10 20 10 25 10 30 Pico ref.

Figura 3. Límite Inferior = 15 min Límite Superior = 30 min b) Número de picos (dpicos) Se da el valor 0 cuando el número de picos es inferior a 50 picos y se da el valor 1 al número de picos que supere 100 picos. Estos límites se fijan por criterio propio.30 - . Límite Inferior = 50 picos Límite Superior = 100 picos Estos criterios se relacionan mediante la función conjunta: Dconjunta =  d picos — dtiempo      1/2 (4) .4.Arantza León Sanz Se aplica la siguiente ecuación: d = tiempo Límite Superior − Pico de Referencia Límite Superior − Límite Inferior (2) Donde. Se aplica la siguiente ecuación: n Picos Filtrados − Límite Inferior Límite Superior − Límite Inferior d picos = (3) Donde. Representación gráfica del criterio número de picos. En este caso interesan los valores más próximos a 1 (óptimo) que los próximos a 0.

36 * Tiempo que dura el gradiente de elusión aplicado.65 y 0.72 0.82 0. Representación gráfica del gradiente optimizado.44 0. Se elige el método con 5% eluyente de B inicial y duración de 20 minutos.44 0.34 0.82 0. desde el %B inicial hasta el 60% de B.66 0.50 0.40 0.54 0.6.09 0.10 0. Es decir.82 0. 0.50 0.65 0.34 0.33 0.34 0. porque los valor de dtiempo y dpicos son.59 0. Método % Eluyente B 0 0 0 0 5 5 5 5 10 10 10 10 Tiempo* (min) 15 20 25 30 15 20 25 30 15 20 25 30 dtiempo 0. más iguales entre ellos.10 dpicos 0.42 0. Tiempo (min) 0 20 22 27 28 % Eluyente B 5 60 95 95 5 100 80 % Eluyente B 60 40 20 0 0 3 6 9 12 15 t (m in) 18 21 24 27 30 Figura 3. . Gradiente optimizado.60 0.58 0.54 Dconjunta 0. De esta manera se ha optimizado el método que queda de la siguiente manera: Tabla 3.54 0.41 0. en comparación al otro método.5. Como se puede observar en la función (Dconjunta) hay dos posibles métodos que podrían ser óptimos.31 - .72 0.52 0.57 0.57 0. Relación de los criterios según la función conjunta.5.58 0.Determinación de Polifenoles en el Vino Tabla 3.82 0.56 0.66 0.66.66 0.

434 16.624 5.054 22.1.794 5.595 15.932 100 1. Se coge 200 µL de la solución madre de polifenoles y 800 µL de vino. Se ha obtenido los siguientes cromatogramas de los cuales se han podido identificar los polifenoles indicados: .32 - . Se coge 200 µL de la solución madre de polifenoles y 800 µL de agua Milli-Q. Muestra adicionada.359 14.616 20.656 11.233 11.628 13.285 18.288 10.Arantza León Sanz mAU 500 400 300 6.125 16. Muestra de vino diluida.645 4.063 7.846 12.823 8.759 2.888 2.355 20.1.569 1.210 18. se analiza: 1.783 17.300 7.9653.577 7.707 22.435 8.743 6. Cromatograma de una muestra de vino utilizando el gradiente optimizado.140 21.009 4.216 17.926 14.695 3. 3.577 12.789 9.231 200 12. Se coge 200 µL de agua Milli-Q y 800 µL de vino.316 5.1.229 4.213 5.278 15.6.841 min Figura 3.278 9.661 11.366 18.042 10.680 23.834 13.668 6.146 2.178 9. 2.2.807 13.938 5.517 23.447 1.780 4.998 20.236 25 0 0 5 10 15 20 25.937 19.047 20.507 4.701 24.340 2.887 7.034 3.009 10.540 18.148 22.603 2.240 8.810 4. Con las condiciones mencionadas anteriormente y con el gradiente de elución que se ha establecido en el apartado 3. Solución de polifenoles.550 13.739 25. 3.068 16. Identificación de polifenoles en muestras vino En este apartado se intenta identificar los polifenoles que anteriormente se han estudiado en una muestra concreta de vino.994 15.516 10.546 6.704 1.070 8.

165 24.446 2.606 7.919 14.650 2.240 18.703 22.037 5.661 13.946 1.780 16.547 23.477 10 10 10.397 25 25 min 23.10.662 15 4-h Figura 3.054 25.D) 0 1.7.120 10.975 13.4-h 3.021 21. Sig=280.980 2.464 6.974 2.100 150 200 250 300 350 400 50 mAU 0 100 200 300 400 mAU 0 0 DAD1 A.548 15. (ver Tabla 3.021 Resv 19.180 4. Figura 3.597 13.476 Resv Determinación de Polifenoles en el Vino 20 20.947 5.217 16.384 5 DAD1 A.690 Cum Cum 16.742 23.534 1. se identifica los espectros de cada pico en la muestra de vino y en la adicionada.530 24.4-h 9.186 11.036 25.752 18.461 22.754 7.456 Cat Cat 11.797 8.626 19.018 3.787 20 20.188 2.644 4.8462.996 21.914 21.50 (ARANTZA\14MAY 002.061 22.558 10.288 2.237 min .606 20.810 7.103 7.560 1.411 8.405 24.808 10.33 13.183 6.733 24.348 8.452 1.474 15 15. teniendo de referencia el tiempo de retención y el espectro de cada solución sintética de polifenol individualmente.118 15.624 15. Espectros de los polifenoles) . Sig=280.4 Ref =600.558 18.112 6.047 7.D) 5 3.818 25. Cromatograma de la solución de vino con identificación preeliminar de picos.448 1.175 5.268 7.184 17.406 14.346 Fell 17.108 11. Cromatograma de la adición de polifenoles en el vino con identificación de picos.606 11.062 10.567 8.680 18.415 6.436 4.124 22.252 9.718 15.328 2.353 7.481 12.169 22.709 1.266 25.025 20.491 2.823 16.048 4.011 8.944 19.256 17.377 Ga Ga 6.341 18.636 9.191 5.697 20.575 Para verificar los polifenoles identificados en los cromatogramas. 12.055 Caf Syr 14.710 4.852 4.201 2.400 16.908 4-h 12.168 15.50 (ARANTZA\14MAY 004.173 9.449 18.157 24.774 22.130 20.947 9.858 Van Van 13.775 13.702 5.365 18.275 16.515 22.908 3.703 1.8.272 10.766 Fel 17.804 2.030 10.839 11.4 Ref =600.271 Caf Syr 14.697 11.208 14.693 2.463 5.553 8.730 11.759 6.

Espectros de los polifenoles.4-H 9.59 .98 Van 13.Arantza León Sanz Tabla 3.17 Cat 11.7.04 4-H 12.34 - .48 Epi 12.12 3. Polifenol Tiempo retención Espectro polifenol Espectro vino Espectro vino+adición Gal 6.

68 Fell 17. así que es muy probable que ese pico esté formado por varios componentes.35 - . .Determinación de Polifenoles en el Vino Polifenol Tiempo retención Espectro polifenol Espectro vino Espectro vino+adición Caff 13.76 Syr 13. se identifica mejor en la adición de polifenoles en el vino que en la muestra de vino sola.19 Resv 19. En concreto.91 Coum 16. el 4-hidroxibenzoico su espectro en el vino sólo es muy similar en cambio con la adición no se podría asegurar. con el resveratrol pasa al revés.35 Se puede ver que la mayoría se corresponden con el espectro del polifenol sólo. En cambio.

9.23 .87 1.42 0.4 Ref =600.35 148. la información es insuficiente.17 .17 9.56 10. podemos decir que la identificación es correcta.50 Ref =600.4 Sig=280. Repetibilidad Polifenol Ga 3.30 0. Sig=280. Es uno de los tres componentes que en el estudio de polifenoles no se podía separar adecuadamente.51 1191. A. por lo tanto es posible que por el tiempo de retención y el espectro que se obtiene al identificar el ácido vinílico.15 178.10 10.64 4.68 Área RSD (%) RSD (%) (Tiempo) promedia (Area) 0.61 1055.Arantza León Sanz Otra observación es que en el vino sólo y en el vino con la adición de polifenoles no se ha podido identificar el polifenol epicatequina. Pero.9. Cromatograma de repetibilidad a 280 nm.3.37 0. 3.25 0. Repetibilidad En este apartado.10 11.D) (ARANTZA\12MAY 003.55 1.50 (ARANTZA\12MAY 001.27 9.4 Sig=280.1.54 2.36 1093. En general.4 Sig=280.96 0.D) (ARANTZA\12MAY 005.55 11.24 0.50 Ref =600. Otra manera representativa queda reflejada en una tabla: Tabla 3.38 89.47 0.55 0. forme parte de éste.4 Sig=280. Se ha decidido analizar la muestra seis veces a 280 nm y queda representado de la siguiente manera: DAD1 DAD1 DAD1 DAD1 DAD1 DAD1 mAU 400 A.D) 350 300 250 200 150 100 50 0 0 5 10 15 20 25 min Figura 3.50 Ref =600. la finalidad es obtener el mismo perfil cromatográfico respecto al tiempo de retención y el área del pico de los analitos de una misma muestra de vino analizada repetidamente con el mismo método para verificar que el método seleccionado es válido. A.4 Sig=280.50 Ref =600. A. A.D) (ARANTZA\12MAY 006.32 0. A.50 Ref =600.4-H Cat 4-H Epi Van Caff Tr* promedio 6.D) (ARANTZA\12MAY 002.D) (ARANTZA\12MAY 004. se necesitaría hacer un estudio más amplio para verificar que la adición de los polifenoles tiene un comportamiento proporcional.36 - 3106.

4.24 0.41 2.56 13. Cromatograma de los polifenoles estudiados en detector de fluorescencia con λ excitación=260 .19 1668. Detector de Fluorescencia En este apartado.10.723 21.D) LU Van 140 120 100 80 13. se da válida la repetibilidad. se conecta el detector de fluorescencia simultáneamente al detector de UV-Visible. 3. Como en el apartado 3.309 22. Em=375 (ARANTZA\18MAY 001.45 3422.04 13.67 3109. Por lo tanto.1.22 0.1..490 17.22 0.48 3.370 3.Determinación de Polifenoles en el Vino Syr Coum Fell Resv 11.66 * Promedio del tiempo de retención En esta tabla se muestra el valor de RSD del área del pico y el tiempo de retención de los polifenoles identificados en el vino. Se ha utilizado el mismo método cromatográfico optimizado para el detector de absorción molecular UV-Visible.2.66 0.031 4-h 20 Resv 19.348 9.90 12.025 19.37 - . Se ha fijado como criterio que el RSD no puede ser superior al 5%.150 Cat 40 11. La finalidad es ver si algunos polifenoles pueden ser estudiados fluorimétricamente.4-h 12. teniendo en cuenta que la muestra sólo se filtra. se ha identificado los polifenoles de la solución madre que presentan mayor intensidad de fluorescencia y se han identificado en una muestra de vino: FLD1 A. Ex=260.53 3214. λemisión= 375 nm .533 Syr 60 14.05 1.185 0 0 5 10 15 20 25 min Figura 3.13 2.

o.370 19.039 19. d.862 23. 2006.396 9. Ull de llebre (100%) 2004.2. 2007.D) 14.274 Ga 12.714 20. Joven (M1) Castillo de Liria.o Liria.414 23.o.237 23.o.909 20. Electroforesis Capilar.055 5. Crianza (M4) Finca Resalso. En los perfiles electroforéticos aparecen diferencias y similitudes: . d.408 14.603 19.989 21. d.185 7.o.2.174 14.o. El procedimiento experimental está explicado en el apartado 2. Ribera del Duero.715 22.015 10. Joven (M2) Viña Fadrí.660 3. Tierra de Extremadura.139 20 21. Electroforesis Capilar En este apartado se estudiará el comportamiento electroforético de diversos vinos utilizando unas condiciones experimentales optimizadas anteriormente. La Mancha.691 15. los seis vinos escogidos son de dos tipos diferentes: joven y crianza.603 17.791 160 140 12.814 13.613 5. d. Ex=260.288 120 13.194 Caf 13. Crianza (M5) Torres Coronas.Arantza León Sanz FLD1 A.957 15.5. Joven (M3) Don Luciano.783 6.621 15. Tempranillo y Garnacha 2007.591 11.370 11. Tinto Fino (100%) 2006.782 7. d.369 Cat 11.11.378 8.839 12.425 LU 100 80 13.658 Resv 0 0 5 10 15 20 25 min Figura 3.38 - .218 6.192 3.148 8.385 7. Crianza (M6) • • • • • Además. 2007. λemisión= 375 nm. Catalunya.107 11.437 6.575 8.317 de los perfiles 5 viñas. Catalunya. El estudio realizado ha consistido electroforéticos de 6 vinos diferentes: • en la comparación 22.580 60 9.732 8.841 14. 3.014 22.537 18.165 9. Em=375 (ARANTZA\24ABR006. Cromatograma de una muestra de vino en detector de fluorescencia con λ excitación=260 .564 20. d.996 16.308 16.987 9.585 40 17. se diferencian en la denominación de origen.099 17. la añada y el tipo de uva.

Sig=230. (Ver Anexo 1 Apartado 1. Electroferograma de la M1 a 230 nm. La finalidad es obtener los espectros de absorción molecular de cada vino para ver si hay diferencias entre ellos.3 Espectrofotometría) .Determinación de Polifenoles en el Vino DAD1 A.D) mAU 6 5 4 3 2 1 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 min Figura 3.12.3.D) m AU 16 14 12 10 8 6 4 2 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 m in Figura 3.30 Ref=off (C:\CHEM32\1\DATA\LIDIA\120309_CE 2009-03-12 11-31-33\029-0302.30 Ref=off (C:\CHEM32\1\DATA\LIDIA\090309_CE 2009-03-09 11-54-30\019-0302. 3. DAD1 A.39 - . electrolito de bórax 20 mM con un 20% de 2-isopropanol a +25KV y 30µA. Sig=230. Se ha podido observar que todos los vinos analizados presentan espectros bastante semejantes. Electroferograma de la M5 a 230 nm. electrolito de bórax 20 mM con un 20% de 2-isopropanol a +25KV y 30µA. Espectrofotometría En este estudio se han registrado los espectros de 29 muestras de vino previamente diluidos con agua (100 µL de vino en 10 mL de agua Milli-Q).13.

Se ha podido observar que todos los vinos analizados presentan espectros bastante semejantes.1. Observamos que la longitud de máxima emisión es 260 nm.14.2.4. 35 30 25 20 15 10 5 0 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 Figura 3.4. 3.Arantza León Sanz 3. Espectros de emisión Se ha registrado los espectros de emisión en un intervalo de 280 a 450 nm.4. . Fluorescencia En este estudio se han registrado los espectros de 29 muestras de vino previamente diluidos con agua (200 µL de vino en 10 mL de agua Milli-Q). 3. Excitación Se ha registrado los espectros de emisión en un intervalo de 260 a 320 nm. La finalidad es obtener los espectros fluorescentes o espectros de emisión molecular de cada vino para ver si hay diferencias entre ellos. Observamos que la longitud de máxima emisión es 376 nm.40 - . Representación de los espectros de emisión de las muestras de vino.

que según la zona también quedan próximos entre ellos. la añada y el tipo de uva. se puede ver que los vinos con denominación de origen la Rioja (color lila) tienen un comportamiento similar. Representación de los espectros de excitación de las muestras de vino. Se puede establecer relaciones y pautas según la denominación de origen.4. y no se aprecia conjuntos definidos.5. (Ver anexo 1 Apartado 1. Según la denominación de origen.15. ya que se encuentran relativamente cerca. La Figura 3. 3. En cambio en la 3. se analiza los resultados de las 4 técnicas independientemente mediante el análisis por componentes principales (PCA). teniendo en cuenta que la muestra es muy variable. la crianza.Determinación de Polifenoles en el Vino 35 30 25 20 15 10 5 0 254 256 258 260 262 264 266 268 270 272 274 Figura 3.16. También pasa con algunos vinos de Cataluña.41 - . El estudio también se ha realizado con el resto de técnicas. Estudio de los perfiles composicionales de vinos En este apartado. Estudio PCA) . sino dispersos.15. se puede ver que las muestras de vinos están dispersas. representación de scores de los datos obtenidos mediante la cromatografía de líquidos con detección fluorescente. se representa el mismo score de cromatografía de líquidos por el detector de fluorescencia pero en función el tipo de crianza.

Representación Scores de HPLC con FLD en función la denominación de origen. .42 - .Arantza León Sanz Figura 3. Representación Loadings de HPLC con FLD en función el tipo de crianza.17.16. Figura 3.

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