Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Métodos de Análisis

5IV1

Violeta Larios Serrato

Determinación de proteínas por el Método de Bradford.

Fechas de realización de la practica:

Lunes 30 de agosto de 2021 y jueves 2 de septiembre de
2021

Fecha de entrega de practica:

Miércoles 8 de septiembre de 2021

López Solorio Jazheel Kibsaim

Preguntas extra:
a) ¿Cumple su curva la ley de Bouger y Beer?
R: La curva de calibración que se realizó en la práctica cumple con la ley de
Bouger y Beer ya que podemos observar que al aumentar la concentración de
proteína aumentaba la absorbancia.
b) ¿Entre que límites de cantidad de proteína?
R: Este comportamiento se puede observar en el intervalo en el que se
desarrolló la curva de calibración, entre el intervalo de 25 a 125mg/mL de
proteína ya que no podemos saber que comportamiento obtendríamos en
valores superiores o inferiores a los obtenidos.
c) A partir de la recta ajustada por regresión lineal y la ecuación de la misma,
obtenga la expresión matemática para calcular la cantidad de proteína.
y−0.1618
X=
0.0037
X= Concentración de proteína en g
Y=Absorbancia a 595nm

Discusión de resultados:
Procedimiento de la determinación de proteínas por el método de Bradford
El procedimiento de Bradford es un procedimiento rápido ya que solo se necesitan
10 min en la preparación de la muestra a analizar, pero solo tenemos una vida útil
de la reacción de aprox 40 min, al utilizar solo 1 reactivo es muy poco probable
tener variaciones en el método y así no tener interferencias. Este método se lleva
a cabo en un medio acido. Si con la reacción llegara a manchar las celdas en las
que se trabajaron se deberán de lavar cuidadosamente para no tener
interferencias.
Curva de calibración:
Para realizar la curva de calibración se realizaron por duplicado las
determinaciones esto para poder tener una mayor exactitud a la hora de obtener la
línea de tendencia que tienen la curva de calibración, se obtuvo un coeficiente de
correlación de 0.99, esto nos indica que los datos obtenidos son aceptables y que
siguen un comportamiento directamente proporcional. Se observó que los datos
eran muy cercanos a la línea de tendencia lo que podemos deducir que la
precisión con la que se llevó a cabo el análisis fue adecuada. Esta curva de
calibración nos permite conocer la absorbancia entre 25 y 125g/ml de
concentración de la proteína ya que al salir de este intervalo el comportamiento
podría ser diferentes.
Análisis estadístico:
Para realizar el análisis estadístico se utilizó las mismas condiciones que el tubo
No. 3, porque hay un incumplimiento en la ley de la fotometría en concentraciones
altas y en concentraciones bajas por lo que siempre se elige la concentración
intermedia entre la curva de calibración que se realizó. Obtuvimos un grado de
imprecisión del 5.42%, el analista que realizo este método tuvo una precisión de
aproximadamente el 94% al realizar las pruebas del análisis estadístico.
Diferencia entre el método de Lowry y Bradford
El método de lowry se lleva apox 40 min en realizar el método mientras que en la
de Bradford son 10 min, en el método de lowry se utilizan reactivos los cuales se
deben de preparar en el momento por su volatilidad, mientras que en Bradford
solo se utiliza 1 y no es volátil. El método de lowry se puede determinar hasta 24
horas después de su reacción lo que nos da un mayor tiempo de funcionalidad, en
el método de Bradford solo contamos con 40 min. Se realizó una prueba de t
student y nos dio un valor superior a de tablas lo que nos indica que el método de
Bradford es mucho más exacto que el método de lowry, en la precisión no hubo
una diferencia significativa al calcular la F de Fisher y compararla con la obtenida
en tablas.

Efecto de sustancias no proteicas:

Fenol: Al agregar fenol las proteínas que se encuentran en el tubo precipitan, esto
no afecta en el complejo de proteína y el reactivo de Bradford pero nos dio un
falso positivo, esto puede ser debido a que el fenol también tienen una cierta
absorbancia que interfiera con los datos.
Tris 1 M, pH 7: Obtuvimos un falso negativo al agregar esta sustancia, esto debido
a que tiene un pH de 7 modificando la reacción que se está llevando acabo debido
a que esta reacción se realiza en un medio acido, esto altera a la tonalidad que se
esperaba.
Urea al 5%: La urea hace que las proteínas se precipiten, aunque no afecta el
complejo formado con el reactivo de Bradford, puede causar un falso negativo por
una interferencia en la absorbancia en las proteínas o porque la urea también
tiene cierta absorbancia.
SDS y detergente comercial: Tanto el SDS como el detergente comercial
desnaturaliza las proteínas de su forma esto afecto significativamente en el
desarrollo del complejo proteína-reactivo de Bradford por lo que las lecturas nos
dieron un falso negativo ya no hubo un cambio de color significativo.

Conclusiones
Se utilizó un método fotométrico para realizar la curva de calibración, los datos
recabados en este método fueron aceptables para la linealización de la recta ya
que el coeficiente de correlación nos arrojó un valor de 0.99.
Se observó que las sustancias no proteicas tienen diferentes interferencias en el
desarrollo del método, los detergentes causaron una mayor interferencia en el
método porque desnaturalizaban a la proteína y esto afecto en la formación del
complejo colorido.
Si hay diferencia estadísticamente significativa entre el método de lowry y Bradford
ya que la t calculada nos dio un valor superior a la t de tablas, no se encontró
diferencias en cuanto a la precisión de los métodos ya que la f calculada fue
menor que la f de tablas.
Una ventaja significativa con este método es que es más exacto y que el tiempo
para realizar el método es menor, pero una gran desventaja es el tiempo en el que
se puede determinar es bajo con respecto al método de lowry.