INFORME DE LABORATORIO

PRÁCTICA 3
DETERMINACIÓN DE BENZODIACEPINAS – TRANQUILIZANTES MENORES

Cristian Alexander Guzmán Santofimio.

Cristian Alberto Triana Basabe.

Andrea Vivian Ortegón Vergara

Liseth Katherine Velásquez Martínez

Docente

Edgar Hernán Beltrán

UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
BACTERIOLOGIA Y LABORATORIO CLINICO
TOXICOLOGIA LABORATORIO
BOGOTÁ D.C
2010
 OBJETIVOS

Determinar la presencia de tranquilizantes menores, específicamente de Benzodiacepinas

(Lorazepam) en la muestra biológica adecuada para esta prueba.

Objetivos específicos

1. Comprender la estructura química de las Benzodiacepinas y el efecto causante en el

organismo, después de su administración, su mecanismo de acción, metabolización
y forma de excreción.

2. Describir el uso farmacológico y terapéutico de las benzodiacepinas.

3. Conocer el fundamento y aplicar la técnica de Cromatografía en Capa Fina para la

determinación de benzodiacepinas (Lorazepam) en Orina.
 MARCO TEÓRICO – PRE-LABORATORIO
BENZODIACEPINA

Grupo de fármacos que producen enlentecimiento de las funciones nerviosas, por lo que producen relajación o sensación de
calma. Se utilizan para tratar cuadros de pánico, contracturas musculares, síntomas de nerviosismo, insomnio, ansiedad, y
convulsiones.
ESTRUCTURA: Las
benzodiacepinas EFECTOS
están compuestas MECANISMOS
DE ACCION FARMACOLOGICOS
por un anillo
bencénico (A) unido
a un anillo
diazepinico (B). están mediados por la
Las BZ son agentes GABA El GABA es el
activación de subtipos de
agonistas indirectos (GABA: neurotransmisor
receptores tipo A del GABA,
ácido gamma amino butírico) inhibitorio más importante
requiriéndose la activación de
es decir que potencian o del SNC de los
receptores que contengan la
amplifican la neurotransmisión mamíferos y se estima
subunidad α1 para conseguir
gabaérgica inhibitoria. que entre el 30 y 50% de
el efecto sedante, mientras
las sinapsis del cerebro
que la acción ansiolítica
estará mediada por
receptores que contengan la
Que las BZ necesitan una
subunidad α2, pero no por
transmisión gabaérgica (sin receptores que contengan la
inhibidores) intacta para
producir sus acciones
farmacológicas
Las BZD clásicas interaccionan
de forma indiscriminada con
todos los tipos de receptores, por
lo que cabe esperar de ellas todo
el abanico de efectos.

FARMACOCINETICA DE LAS BENZODIACEPINAS

ABSORCIÓN Se absorben rápido y completamente por vía oral, salvo el clorazepato que es una prodroga y se descarboxila
rápidamente en el jugo gástrico a Ndesmetildiazepam (o nordiazepam) y luego se absorbe por completo. El
midazolam es el compuesto más liposoluble y el flumazenil el menos liposoluble. La absorción por vía i.m. es
irregular, en caso de ser necesaria la vía parenteral, la de elección es la i.v. Generalmente, el solvente que poseen
es el polietilenglicol, es un polialcohol muy irritante que hace precipitar la BZ en el tejido muscular y por lo tanto
se absorbe mal la droga.
Cuando se administran por vía oral a los 30minutos aparecen los efectos ansiolíticos o hipnóticos.
DISTRIBUCI Las BZ son transportadas por la circulación sistémica a la circulación cerebral capilar, estos agentes tienen alto
ÓN grado de unión a proteínas plasmáticas 80-95%, albúmina principalmente y debido a su escasa fracción libre pasan
poco al líquido cefalorraquídeo.

Son muy lipofílicas, el comienzo de acción después de una dosis oral refleja el grado de absorción gastrointestinal
(aproximadamente 30 min.); la duración de acción demuestra el porcentaje de distribución en tejidos periféricos, el
grado de unión a proteínas plasmáticas y el porcentaje de aclaramiento y eliminación.

Solo la fracción libre es farmacológicamente activa y es la que difunde a través de las membranas biológicas. La
alta unión a proteínas plasmáticas también influencia en la cantidad de droga captada por el cerebro, así la
concentración de droga libre en plasma refleja la concentración cerebral. El volumen de distribución aparente es
amplio (1-2 litros/kg), debido a que estas drogas luego de concentrarse en el cerebro sufren una redistribución
tisular periférica sobre todo en lípidos y músculo.
BIOTRANS- En general las BZ son metabolizadas primariamente por enzimas microsomales hepáticas, sufriendo oxidación
FORMACIÓN microsomal (fase I) y luego glucuronoconjugación (fase II). A diferencia de los barbitúricos no son potentes
inductores enzimáticos hepáticos. La mayoría de las BZ deben ser primero oxidadas (metabolitos activos, fase I) y
luego conjugadas (metabolitos inactivos, fase II). Los metabolitos oxidados son activos y pueden ligarse o unirse
al receptor de BZ (aunque en general poseen menos actividad que la droga madre).
ELIMINACIÓ La eliminación se realiza por filtración y secreción tubular principalmente metabolitos glucuronoconjugados y en
N menor cantidad los oxidados.
 EFECTOS SECUNDARIOS
El perfil toxicológico de las benzodiacepinas ansiolíticas es muy parecido, aunque la frecuencia y gravedad de las
reacciones puede variar de unas a otras. En la mayor parte de los casos, las reacciones adversas son una prolongación de la
acción farmacológica y afecta al SNC. Aproximadamente la mitad de los pacientes presentan en mayor o menor grado
somnolencia durante los primeros días de tratamiento. Frecuentemente aparece: sedación, somnolencia, ataxia.
Ocasionalmente: mareos, sedación, cefalea, depresión, desorientación, disfasia o disartria (alteración del lenguaje),
temblor, cambios en la libido, alteraciones urinarias, diarrea o estreñimiento. Excepcionalmente: hepatitis, ictericia,
dermatitis, urticaria, prurito, discrasias sanguíneas, alteraciones de la visión y audición. Pueden producir incoordinación
motora con riesgo de caída, amnesia anterógrada (dificultad para recordar hechos recientes) y dificultad de concentración.
La intensidad de los efectos depende de las dosis utilizadas y son más importantes en personas con alteraciones hepáticas y
en ancianos porque al disminuir su metabolismo aumenta mucho su semivida plasmática.

 CONTRAINDICACIONES: están contraindicadas (teratogénicas, pueden producir síndrome de abstinencia neonatal)

en el embarazo y lactancia (pasan por la leche materna). También en la hipersensibilidad a la droga, en el glaucoma de
ángulo estrecho (medicado o no) y en pacientes con glaucoma en ángulo abierto no medicado. En los ancianos debe
disminuirse la dosis a la mitad. Los ancianos, son más susceptibles a los efectos depresores y pueden presentar además
síndrome paradojal y síndrome confusional. Puede prolongarse la vida media y producirse acumulación. En la insuficiencia
hepática, puede haber acumulación de BZ. Los pacientes con insuficiencia renal son más sensibles a los efectos depresores
del SNC. En el asma severa, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, debido al peligro de producir apneas nocturnas y
por la relajación muscular que producen las BZ podría disminuirse la capacidad ventilatoria. -En pacientes con porfiria se
puede producir un ataque agudo. La miastenia es otra contraindicación de las BZ, debido al efecto miorrelajante que
producen.

 TOXICOLOGIA
Las BZ poseen amplio margen terapéutico es decir que la dosis efectiva 50 y la dosis letal 50 están muy distanciadas una de
otra. Es por eso que una sobredosis de Bz (pura, no con otros depresores) como intento de suicidio, por ejemplo, raramente
es mortal y cuando lo es seguramente la BZ se asoció a otra droga (ejemplo: alcohol). En casos de intoxicación aguda
mantener libres las vías aéreas, monitorear signos vitales y administrar el antagonista flumazenil.

 USOS TERAPEUTICOS
Las BZ son agentes sintomáticos y solos son útiles en tratamientos a corto plazo debido al desarrollo de tolerancia de sus
acciones farmacológicas (EJ: efecto hipnotico). Están indicadas en enfermedades orgánicas donde la ansiedad es un
componente (úlcera, neurodermitis) o importante factor etiológico como las alteraciones psiconeuróticas que cursan con
ansiedad, insomnio, tensión emocional. En alteraciones neuromusculares se comprobó que el diazepam es superior a
cualquier otro relajante muscular como por ejemplo cari soprodol, clormezanona, baclofeno. También alivia las
contracturas musculares, el dolor discal de las lesiones de la columna y también el tétanos. En la abstinencia alcohólica
aguda, el diazepam es el agente de elección ya que controla el insomnio y la agitación. También son útiles para evitar o
controlar el síndrome de abstinencia alcohólica (delirium tremens). Las BZ son útiles en todo tipo de convulsiones, en la
medicación preanestésica y en anestesiología combinadas con otros agentes (midazolam+ fentanilo por ejemplo). Están
indicadas en el insomnio sobre todo cuando es debido a mioclonos, o secundario a otra medicación o en el insomnio por
dolor o stress (cambio de trabajo, fallecimiento de un ser querido, etc). El triazolam se prefiere en pacientes que les cuesta
conciliar el sueño, por su acción rápida y vida media corta (5 horas) evitando el efecto residual matinal. El flunitrazepam,
flurazepam y nitrazepam poseen acción prolongada, producen sedación matinal, pero no insomnio rebote.

TECNICAS DE DETERMINACION
Existen tres grandes grupos de técnicas analíticas: las inmunológicas, las cromatográficas y las colorimétricas. Estas
últimas comprenden un gran número de reacciones químicas llevadas a cabo sobre la muestra con reactivos relativamente
asequibles (por ejemplo la de Trinder para salicilatos, Fujiwara para hidrocarburos halogenados) y si bien han prestado y
prestan un gran servicio a la toxicología de urgencia y de recursos limitados su baja especifidad y sensibilidad no permite
recomendarlas para esta determinación.

Las técnicas inmunológicas se basan en la reacción antígeno-anticuerpo y comprenden el mismo conjunto de técnicas
empleadas en química clínica, especialmente los enzimoinmunoensayos competitivos. Muchos psicofármacos pueden
realizarse por polarización de fluorescencia (FPIA) y multiplicación enzimática (EMIT) y existen “casettes” con
anticuerpos para los grupos de drogas usualmente encontrados en comas o accidentes (benzodiacepinas, antidepresivos
tricíclicos, opiodes, cannabinoides, cocaína...).

Las técnicas cromatográficas, por otra parte, se basan en la distinta solubilidad de los componentes de una muestra frente
a una fase móvil y permiten la separación de todos esos componentes para su posterior identificación. Contrariamente a las
técnicas anteriores el primer paso es una preparación o “clean up” de la muestra, que tiene por objeto a la vez concentrar las
sustancias buscadas y eliminar las interferencias producidas por otros componentes de la orina

PROCEDIMIENTO

Se falseó la Muestra, se realizó una hidrólisis ácida, una extracción líquido-líquido y finalmente se procedió a
realizar la cromatografía en capa fina para determinar benzodiacepinas en una muestra de Orina

Falsear la Mx con 6 Tomar 10 ml de

Orina sin
HIDRÓLISIS
gotas de ATIVAN ÁCIDA
centrifugar

Colocar en baño Realizar una

de maría por Colocar tubo de hidrólisis ácida con
15min entre 60- reflujo y agitar 3 ml de HCL
70º C concentrado

Marcar el Enfriar los tubos y

Erlenmeyer y pasar el
cápsula de hidrolizado a un
porcelana Erlenmeyer
 para que el eluyente suba por capilaridad de 15-20 minutos

RESULTADOS

Para la determinación de benzodiacepinas en orina, se utilizó el método de cromatografía en capa

fina. Allí la muestra de orina se falseó con la adición de 8 gotas de Ativán. Este procedimiento, se
realizó con el fin de que nuestra muestra sea positiva para benzodiacepinas partiendo del supuesto
de que era completamente libre de estas inicialmente.

Después de la adición del Ativán, se realiza el protocolo de la cromatografía en capa fina con sus
correspondientes reactivos. La última parte de este método, requiere de un eluyente compuesto por
tolueno 20: 1 acetona.

Finalmente, se adicionan a la placa por medio de un frasco aspersor, nitrito de sodio (NaNO2) más
NEDA (Neftilendiamina) con el fin de observar manchas o complejos de color morado-rosado, lo
que indica que es positivo para benzodiacepinas. El resultado que obtuvimos fue negativo a pesar de
que se falseo la muestra.
 1 2 3 4

RF= Distancia recorrida por la muestra RF=___1___ = 0.14285714

Distancia recorrida por el solvente 7

ANÁLISIS DE RESULTADOS

En la obtención de resultados se tuvieron algunos problemas. Las muestras mayormente no

mostraron resultados positivos o no de manera muy clara, como se debía esperar y para esto se
determinaron dos posibles causas:

Es factible que se agregara muy baja proporción de ativán (benzodiacepina patrón) a la muestra
inicial, por lo que los resultados no fueron muy claros.

También es factible que el problema estuviera en el revelado de la placa, sea por que los reactivos
(NEDA y Nitrito de Sodio) estuvieran contaminados o alterados de alguna manera; o porque la
cantidad dispersada sobre la placa no fue la adecuada.

El resultado del RF se tomó en base a los resultados de la mesa 3, en la cual el frente de corrido fue
igual a 7 cm y la distancia recorrida por el analito fue de 1 cm. El RF es específico para cada
analito y para la fase móvil.
CONCLUSIONES

 Los medicamentos benzodiacepinas poseen importantes acciones farmacológicas, propiedades

toxicológicas y aplicaciones terapéuticas como anestésicos, anticonvulsivantes, sedantes,
ansiolítico, hipnóticos y relajantes musculares. Actuando en gran medida sobre el sistema nervioso
central.

 La cromatografía de capa delgada corresponde a un sistema analítico que permite separar los
diferentes componentes de una muestra problema, con el fin de identificarlos y/o cuantificarlos.

 Debido a las propiedades toxicológicas de las benzodiacepinas, es de gran importancia saber

realizar las técnicas para la determinación de esta en la muestra biológica mas adecuada, en este
caso la orina, debido a su metabolización; ya que en toxicología de urgencias se reportan casos de
intoxicación por este fármaco cuando es administrado en uso delictivo.

AUTOEVALUACIÓN
LOGRO-
Objetivos cumplidos FORTALEZAS DEBILIDADES SUGERENCIAS A
CADA DEBILIDAD.

SI NO Dominio de los Mala distribución del Reorganización del

conceptos básicos tiempo durante la material de trabajo
utilizados en práctica al procesar la aplicando el adecuado
toxicología y muestra para procedimiento para
diferenciación entre determinación de cualquier determinación.
X los tranquilizantes benzodiacepinas.
menores y
tranquilizantes
mayores.

BIBLIOGRAFÍA

Documentos web disponibles en:

o http://www.minsa.gob.ni/enfermeria/doc_inter/benzodiacepinas.pdf
o http://www.portalfarma.com/pfarma/taxonomia/general/gp000042.nsf/voDocumentos/66FD0F16FC
E04F02C125725D003A8CC8/$File/DOSSIER%20BENZODIAZEPINAS.pdf
o http://med.unne.edu.ar/catedras/farmacologia/temas_farma/volumen5/2_benzodiaz.pdf
o http://bernirey80.files.wordpress.com/2007/05/benzodiazepinas.pdf
o http://www.sertox.com.ar/retel/n04/004.pdf