Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos

Pruebas de susceptibilidad
a los antimicrobianos

Carlos M. Rodríguez Pérez

Muchas áreas de la ciencia están continuamente cambiando y esto también se aplica al

campo de los agentes antimicrobianos y al tratamiento de las enfermedades infecciosas.
Nuevos agentes están siendo producidos constantemente y probados para uso humano;
mientras que, al mismo tiempo, muchas especies de bacterias son cada vez menos sensibles.
Hacia finales de los años 50 del siglo XX, las pautas para el test de susceptibilidad eran
un verdadero caos, porque no existía un procedimiento estandarizado aceptable. En 1977, los
participantes en una reunión organizada por la OMS en Ginebra, expresaron su alarma por la
creciente difusión de la resistencia a los antibióticos en el mundo, causada por el uso cada
vez mayor, y a menudo indiscriminado, de estos productos. En los últimos años las bacterias
resistentes han causado brotes graves de infecciones que produjeron muchas muertes. Por
ello es necesario mantener una vigilancia estrecha de la resistencia de las bacterias a los
antibióticos, utilizando pruebas de sensibilidad fidedignas que proporcionen datos compa-
rables. La información microbiológica y epidemiológica disponible ayudará a los clínicos a
seleccionar el agente antimicrobiano más apropiado para tratar cada infección.
Para que la predicción sea válida, la prueba de sensibilidad deberá efectuarse mediante
un método exacto y reproducible, cuyos resultados puedan aplicarse directamente a la situa-
ción clínica. El criterio definitivo de fiabilidad de cualquier método de prueba de la sensibili-
dad es su correlación con la respuesta del paciente al tratamiento antimicrobiano.

DEFINICIÓN CLÍNICA DE LOS TÉRMINOS

RESISTENTE Y SENSIBLE. EL SISTEMA DE TRES
CATEGORÍAS
El sistema más sencillo que se aplica a una prueba de sensibilidad a las drogas
antimicrobianas es el de sensible o resistente; con fines estadísticos es muy útil, pero muy
rígido para la clínica. Por ello y en este último sentido, debe adoptarse una clasificación de
tres categorías que deben ser bien interpretadas por médicos y personal del laboratorio por
su significación clínica.

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Microbiología y Parasitología Médicas

1. Sensible: decimos que un determinado microorganismo es sensible a un antimicrobiano,

cuando la infección que causa el primero responde al tratamiento con ese fármaco a la
dosis recomendada.
2. Intermedio: corresponde a dos situaciones:
a) Incluyen aquellas cepas "moderadamente sensibles" a un antibiótico que puede
aplicarse en dosis altas, dada su baja toxicidad o porque puede concentrarse en el sitio
de la infección.
b) Cepas moderadamente sensibles a un antibiótico muy tóxico que no puede aplicarse
en dosis elevadas. En este caso, esta categoría es una zona de transición de lo sensible
a lo resistente (sensibilidad intermedia).
3. Resistente: indica que no es probable que el microorganismo responda a un medicamento
determinado con independencia de la dosis y la localización de la infección.

La decisión definitiva sobre el uso de un determinado antibiótico y la dosificación del

mismo no solo depende de los resultados del laboratorio, sino de la interpretación que el
médico pueda darle y de otros factores, como son la virulencia del microorganismo, efectos
secundarios, farmacocinética del medicamento, difusión en el organismo y estado inmunitario
del hospedero.

INDICACIONES DE LAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD

Estas van dirigidas a:

1. Guiar al clínico en la selección de un agente antimicrobiano de la máxima eficacia para ser

utilizado ante un determinado paciente.
2. Servir de instrumento epidemiológico al detectar la resistencia de los microorganismos
dentro del hospital y en el seno de la comunidad.

Los métodos para determinar sensibilidad y resistencia en las bacterias pueden ser:

1. Cuantitativos: determinan la menor concentración de un antibiótico que inhibe visible-

mente el crecimiento de un microorganismo: concentración inhibitoria mínima (CIM).
2. Cualitativos: son aquellos que, empleando la difusión de un antibiótico concentrado en
un disco de papel, permiten categorizar a los microorganismos en susceptibles, interme-
dios o resistentes cuando se enfrentan a un agente antimicrobiano específico (difusión).

Los métodos mas comúnmente utilizados en los laboratorios de microbiología son:

1. Difusión en discos.
2. Difusión por revestimiento de agar.
3. Dilución en macrocaldo.
4. Dilución en microcaldo.

Señalamos que los métodos automatizados se difunden cada día más en todo el mundo.

MÉTODOS DE DIFUSIÓN EN DISCOS PARA PRUEBAS

Difusión en agar por diseminación superficial (Bauer-Kirby)

Principio. El disco impregnado de antibiótico hace contacto con la superficie húmeda
del agar. El agua es absorbida por el papel de filtro y el antibiótico difunde hacia el medio
circundante. La velocidad de difusión del antibiótico fuera del disco es mayor que la de su
difusión hacia el medio, de modo que la concentración del antibiótico inmediatamente adya-
cente al disco puede exceder la del mismo disco. Sin embargo, a medida que aumenta la
distancia al disco, ocurre una reducción logarítmica de la concentración del antibiótico hasta
que se alcanza un punto en el que el desarrollo bacteriano de la superficie del agar ya no es
inhibido. El resultado es una zona de inhibición del desarrollo con bordes bien delineados
(halo de inhibición) (tablas 151.1 y 151.2).

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 Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos

Tabla 151.1. Criterios de interpretación basados en el método de Bauer-Kirb

Contenido Diámetro (mm) de la zona de inhibición

Antimicrobiano del disco Resistente Intermedio Sensible

Amikacina 30 µg 14 o menos 15-16 17 o más

Ampicillina en pruebas con microrganismos
gramnegativos y enterococos 10 µg 11 o menos 12-13 14 o más
Ampicilina1 en pruebas con estafilococos y
microorganismos sensibles a la penicilina 10 µg 20 o menos 21-28 29 o más
Azlocilina 75 µg 17 o menos - 18 o más
Carbenicilina2 en pruebas con especies de
Proteus y con E. coli 100 µg 17 o menos 18-22 23 o más
Carbenicilina2 en pruebas con Pseudomonas
aeruginosa 100 µg 13 o menos 14-16 18 o más
Cefaloridina cuando se registra sensibilidad a la
cefaloridina, ceflaclor, cefradoxil, cefalotina,
cefalexina, cefapirina, cefazolina, cefacetrilo
y cefradina 30 U 14 o menos4 15-17 18 o más3
Cefazolina 30 µg 14 o menos 15-17 18 o más
Ceftriaxone 30 µg 13 o menos 14-20 21 o más
Cefotaxima 30 µg 14 o menos 15-22 23 o más
Cloranfenicol 30 µg 12 o menos 13-17 18 o más
Colimicina 10 µg 8 o menos 9-10 11 o más4
Eritromicina 15 U 13 o menos 14-17 18 o más
Estreptomicina 10 U 11 o menos 12-14 15 o más
Gentamicina cuando se registra sensibilidad a la
gentamicina y a la sisomicina 10 U 12 o menos 13-14 15 o más
Kanamicina 30 U 13 o menos 14-17 18 o más
Meticilina5 5 µg 9 o menos 10-13 14 o más
Novobiocina 30 U 17 o menos 18-21 22 o más6
Oxacilina 1 µg 10 o menos 11-12 13 o más
Penicilina en pruebas con estafilococos 6 µg 10 o menos 11-28 29 o más
Penicilina en pruebas con otros
microorganismos 6 µg 11 o menos 12-21 22 o más
Tetraciclina 7 30 U 14 o menos 15-18 19 o más
Vancomicina 30 U 9 o menos 10-11 12 o más
Cefuroxima 30 µg 14 o menos 15-17 18 o más
Ceftazidima 30 µg 14 o menos 15-17 18 o más
Ciprofloxacina 5 µg 15 o menos 16-20 21 o más
Sulfametoxazol-trimetoprim 23,75 µg/1,25 µg 10 o menos 11-15 16 o más

Tomado de: Discos para antibiograma. EPB Carlos J Finlay.

1 . El disco de ampicilina se utiliza para pruebas de sensibilidad a la amoxicilina y la hetacilina. Para los ensayos con especies de Haemophilus, las
pruebas deben realizarse usando discos tanto de ampicilina como de penicilina, y los gérmenes aislados que presenten sensibilidad a la ampicilina y
resistencia a la penicilina se considerarán resistentes a la ampicilina.
2 . El disco de carbenicilina (piopén) se emplea para probar la sensibilidad a la carbenicilina y a la ticarcilina.
3 . Los estafilococos que presenten resistencia a la meticilina se registrarán como resistentes a las cefalosporinas.
4 . La difusión en agar de la colistina y la polimixina B es deficiente, por lo que conviene confirmar los resultados de la prueba por un método de
dilución.
5 . El disco de meticilina se utiliza para determinar la sensibilidad de todas las penicilinas resistentes a la penicilinasa (meticilina, cloxacilina,
decloxacilina, oxacilina y nafcilina), y para establecer la resistencia a las cefalosporinas.
6 . No aplicable a un medio que contenga sangre.
7 . El disco de tetraciclina se utiliza para determinar la sensibilidad a todas las tetraciclinas (clortetraciclina, doxiciclina, metacilina, oxitetraciclina,
minociclina y tetraciclina).

Procedimiento:

1. Medio de cultivo: el agar Mueller-Hinton fue seleccionado como el medio de cultivo

óptimo, pues en él pueden crecer muchas de las bacterias aisladas de material clínico,
posee bajo contenido de inhibidores y un elevado índice de reproducibilidad. El volumen
del medio por placa es de 25 mL para las placas de 100 por 13 mm, y de 60 mL para las de
150 mm, con una profundidad del mismo de 4 a 6 mm. Cuando se cultivan bacterias de
difícil crecimiento como Streptococcus, Neisserias, Haemophillus, etc., puede enrique-
cerse el medio con 5 % de sangre de carnero desfibrinada.

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Microbiología y Parasitología Médicas

Tabla 151.2. Intervalos permisibles para las cepas de referencia

Intervalos de variación previstos para el

diámetro de la zona en mm
Contenido S. aureus E. coli P. aeruginosa
Antimicrobiano del disco ATCC 25923 ATCC 25922 ATCC 27853

Amikacina 30 µg 23-28 19-26 18-26

Ampicilina 10 µg 24-35 15-20 -
Azlocilina 75 µg - - 24-30
Cefaloridina 30 U 25-37 18-23 -
Cefazolina 30 µg 29-35 23-29 -
Ceftriaxone 30 µg 22-28 29-35 17-23
Cefotaxima 30 µg 25-31 29-35 18-22
Cloranfenicol 30 µg 19-26 21-27 -
Colimicina 10 µg - 11-15 -
Eritromicina 15 U 22-30 8-14 -
Estreptomicina 10 U 14-22 12-20 -
Gentamicina 10 U 19-27 19-26 -
Kanamicina 30 U 19-26 17-25 -
Meticilina1 5 µg 17-22 - -
Novobiocina 30 U 22-31 - -
Oxacilina 1 µg 18-24 - -
Penicilina 6 µg 26-37 - -
Carbenicilina 100 µg - 24-29 20-24
Tetraciclina 30 U 19-28 18-25 -
Vancomicina 30 U 15-19 - -
Cefuroxima 30 µg 27-35 20-26 -
Ceftazidima 30 µg 16-20 25-32 22-29
Ciprofloxacina 5 µg 22-30 30-40 25-33
Sulfametoxazol-
trimetoprim 23,75 µg/1,25 µg 24-32 24-32 -

Tomado de: Discos para antibiograma. EPB Carlos J Finlay.

1 . El disco de meticilina se utiliza para determinar la sensibilidad de todas las penicilinas resistentes a la
penicilinasa (meticilina, cloxacilina, decloxacilina, oxacilina y nafcilina), y para establecer la resisten-
cia a las cefalosporinas.

2. Preparación del inóculo: partiendo de un cultivo puro, se debe tomar entre 4 y 6 colo-
nias de apariencia similar con asa o aguja de inocular; se transfieren a un caldo (2 a 5 mL
de caldo triptona-soya, caldo corazón o caldo Mueller-Hinton); se incuban de 2 a 5 horas
de 35 a 37 °C (fase exponencial de crecimiento). Se debe controlar la turbidez con patrón
Mc Farland, escala 0,5 y ajustar la misma con solución salina fisiológica o caldo Mueller-
Hinton.
3. Inoculación de las placas: se toma un hisopo seco y estéril, se lleva a la suspensión
bacteriana, se elimina el exceso presionando y rotando el hisopo sobre las paredes del
tubo por encima del nivel del líquido. Se estría la superficie del medio en tres direcciones
para obtener una siembra uniforme. La estandarización del inóculo se hace porque el
tamaño del halo de inhibición varía inversamente al tamaño del inóculo. Se deja secar la
placa por 3 a 5 min.
4. Colocación de los discos: los discos se colocan manualmente con una pinza estéril o con
un dispensador de discos, a una distancia no menor que 15 mm del borde de la placa, y
una separación entre ellos no menor que 25 mm para evitar la superposición de los halos
de inhibición. La placa se incuba de 35 a 37 °C por un período de 18 a 24 horas.
5. Lectura e interpretación: la zona de inhibición es el área que rodea al disco donde el
crecimiento ha sido completamente inhibido; sin embargo, con las cepas de Proteus la
zona puede aparecer invadida aunque se define claramente (spread). No se debe tener en
cuenta esta invasión. La zona de inhibición debe ser cuidadosamente medida e incluye el
diámetro del disco. Los resultados se comparan con los diámetros de las zonas dadas en
la tabla de interpretación de los halos de inhibición y permiten expresar en términos de
resistente, intermedio y sensible, al microorganismo sometido a la prueba frente a dife-
rentes drogas.
Con las sulfamidas y el cotrimoxazol puede observarse un ligero desarrollo microbiano
en la zona de inhibición, al que no se debe dar importancia; en la evaluación de la
sensibilidad a la penicilina por parte de los estafilococos productores de ß-lactamasa, se

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 Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos

forman zonas de inhibición de bordes netos abultados, reconocibles al compararlo con

un testigo sensible, tales zonas deben considerarse como exponentes de resistencia.

Difusión por revestimiento en agar

De una suspensión de un microorganismo incubado por 4 a 8 horas, se toma 1 µL y se
disuelve en 9 mL de agar Mueller-Hinton a una temperatura de 45 oC. Se hace homogénea y
coloca sobre una placa de 150 mm que ya posee una capa de este agar solidificado (4 mm de
espesor), se deja enfriar y posteriormente se procede como se había descrito antes.

Pruebas directas de susceptibilidad con materiales clínicos

La aplicación directa de rutina de material clínico para pruebas de sensibilidad debe
evitarse, excepto en situaciones de emergencia como muestras de líquido cefalorraquídeo u
otros líquidos corporales que dan frotis de Gram, indicando que puede esperarse un cultivo
puro. El uso de una placa de "verificación de pureza" es muy útil en estas situaciones de
emergencia.
Los resultados conocidos de estas pruebas de emergencia deben, a menos que se
hayan logrado resultados de cultivo puro y un inóculo apropiado, comunicarse como preli-
minares o tentativas, así como repetirse y confirmarse usando uno de los métodos recomen-
dados.

Errores potenciales del método de difusión

1. Densidad del inóculo.
2. Momento en que se colocan los discos.
3. Temperatura de incubación.
4. Tiempo de incubación.
5. Tamaño de la placa, espesor del medio y distancia entre los discos.
6. Potencia de los discos de antibióticos.
7. Composición del medio.

PRUEBAS DE DILUCIÓN
Diversos métodos estandarizados han sido descritos para determinar de forma cuanti-
tativa la actividad inhibitoria de un agente antimicrobiano in vitro. Variadas concentracio-
nes de antimicrobianos son adicionados a medios en caldo o con agar. Se realiza una serie de
concentraciones del agente antimicrobiano diluidas al doble, que representan los niveles
permisibles en sangre para la terapéutica. Estas varían considerablemente para cada tipo de
agente antimicrobiano. Por ejemplo para la gentamicina, los rangos de concentración proba-
dos van de 0,25 a 16 µg/mL; sin embargo, para la penicilina estos fluctúan de 4 a 128 µg/mL.

Consideraciones generales
Soluciones de stock. La preparación de soluciones de stock requiere la obtención de un
estándar del fabricante o proveedores de laboratorio destinada a aportar estos materiales de
prueba. Las preparaciones antimicrobianas de uso humano no son aceptadas como reactivos
de prueba para laboratorios, porque pueden ser químicamente impuras e inexactas en cuanto
a la actividad citada. Los materiales de prueba deben:

1. Poseer fecha de vencimiento.

2. Tener reflejada su actividad en microgramos o unidades por miligramo o mililitro.
3. Estar fechados al abrirlos.
4. Guardarse en un desecador.

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Microbiología y Parasitología Médicas

5. Pesarse en balanzas analíticas o medirse con pipetas apropiadas.

6. Esterilizarse por filtración cuando sea necesario.
7. Disolverse o diluirse en el solvente o diluyente apropiado.
8. Conservarse entre −20 y −70 oC.

Dilución en agar
En este método se utilizan diversas concentraciones de agentes antimicrobianos que
son añadidos individualmente a un medio fundido y enfriado a 50 oC y vertidos posterior-
mente en placas petri (placa vertida). Después de solidificado el agar, un número estandari-
zado de bacterias (104 UFC para aerobios) es colocado sobre la superficie del agar; para ello
se utiliza un dispositivo de replicación (también llamado replicador de Steer) el cual puede
inocular simultáneamente hasta 36 cepas diferentes en cada placa. Se incuban las prepara-
ciones toda la noche y se realizan posteriormente las lecturas, informando la más baja con-
centración de antimicrobiano que inhibe el crecimiento visible (la presencia de 1 a 2 colonias
no resta valor a la prueba).
Aunque este método es reproducible, es utilizado casi siempre para realizar investiga-
ciones dada la complejidad del mismo. La vida promedio de las placas es breve, ya que
deben conservarse en refrigeración entre 2 y 8 oC, y muchos antimicrobianos son lábiles a
estas temperaturas. Además, el método es práctico si se van a probar de 32 a 36 cepas por
placa. Sin embargo, es el método recomendado para testar bacterias anaerobias.

Dilución del macrocaldo

Este método ha sido utilizado por años, pero solo cuando se prueban escasos aislamien-
tos frente a algunos antimicrobianos. El mismo no es práctico para la rutina de un laboratorio
donde se utilicen 10 o más drogas frente a un solo aislamiento. En él se emplean tubos que
contienen entre 1 y 2 mL de una concentración de antimicrobianos diludos al doble, a los cuales
se les inocula una suspensión estandarizada de bacterias que contienen 5 x 105 UFC/mL. Se
incuba toda la noche y se realiza la lectura de CMI como la más baja concentración del
antimicrobiano que visualmente inhibe el crecimiento, evidenciado por la ausencia de turbi-
dez. Un tubo-control no inoculado puede ser útil para interpretar este punto terminal de-
terminado visualmente.
Las pruebas de susceptibilidad en macrocaldo también permiten transferir alícuotas
desde los tubos sin crecimiento visible a superficies de placas de agar, para poder determinar
las concentraciones bactericidas mínimas.

Dilución en microcaldo
El método de dilución en macrocaldo ha sido adaptado a micrométodo, para ello se han
utilizado bandejas plásticas que contienen entre 80 y 100 pocillos, los cuales son llenados
con pequeños volúmenes (± 0,1 mL) de una concentración de antimicrobianos diluidos al
doble y suspendidos en caldo Mueller-Hinton, que contiene una concentración específica
de cationes divalentes (Ca++ y Mg ++). Un número estandarizado de bacterias es inoculado en
cada pocillo de forma simultánea. Un pocillo para control del crecimiento (caldo más el
inóculo) y otro para control de la esterilidad (caldo solamente) se incluyen en cada bandeja.
Se incuba toda la noche y se realiza la lectura de la CMI igual que en el macrocaldo.
A diferencia de la dilución en macrocaldo, este representa un método práctico para la
rutina de un laboratorio, donde una batería de drogas puede ser probada contra un aisla-
miento en una sola placa.

Pasos que se deben seguir en una prueba de microdilución en caldo

1. Preparación del inóculo en caldo Mueller-Hinton o caldo soya tripticasa, hasta lograr una
turbidez 0,5 de Mc Farland (1,5 x 10 8 UFC/mL).

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 Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos

2. Diluir el inóculo a una concentración final de 5 x 10 5 UFC/mL.

3. Añadir el mismo a los pocillos que contienen los antibióticos en las diferentes diluciones
y concentraciones.
4. Incubar a 35 °C por 16 a 24 horas en una incubadora regular o en atmósfera de CO2, en
caso de bacterias fastidiosas.
5. Comprobar el crecimiento en el pocillo control del mismo y no crecimiento en el de
esterilidad.
6. Se realiza lectura interpretando la misma como:
a) Sensible.
b) Intermedia.
c) Resistente.

Basado en las tablas existentes al respecto: cuando se utiliza este método para determi-
nar la sensibilidad de los estafilococos a la penicilina, una CMI mayor que 0,12 µg/mL se
interpreta como resistente, y aquellos con una CMI menor que 0,06 µg/mL son susceptibles.
Aislamientos de este microorganismo con una CMI entre 0,06 y 0,12 µg/mL pueden ser
resistentes debido a que la concentración de β-lactamasa es baja, y este método no siempre
detecta estas cepas penecilina-resistentes. Por ello, estos aislamientos con estos resultados
específicos deben ser sometidos al test que detecte la presencia de β-lactamasa, y si este
resulta positivo, se informa como resistente a la penicilina. Si el test resultara negativo, se
informa sensible a la penicilina.
La dilución en microcaldo se realiza en múltiples laboratorios dispensando los medios
de cultivo, las concentraciones de antibióticos y los microorganismos con pipetas
multicanales. A su vez, la preparación de las soluciones stock de los antimicrobianos es
extremadamente laboriosa. Hoy día se ofertan placas que contienen los antimicrobianos (con
las diluciones correspondientes) congelados o desecados y, también, determinados instru-
mentos que viabilizan el proceso, además de existir equipos automatizados o
semiautomatizados que facilitan uno o más pasos en el método, como por ejemplo la inocu-
lación o la lectura final.

Modificaciones de la difusión en discos rutinaria y la CMI por microcaldo

para bacterias problemáticas y fastidiosas
Staphylococcus aureus resistentes al meticillín (MRSA). Fue reportado como resis-
tente al meticillín en 1961, poco después de la introducción del meticillín como agente tera-
péutico para estos microorganismos resistentes a la penicilina. Es de gran importancia como
patógeno nosocomial, y se detecta también en pacientes no hospitalizados; casi siempre es
resistente a múltiples antibióticos, por ello, la detección de MRSA reviste un especial
cuidado por parte del laboratorio, debido al impacto directo de la terapia antimicrobiana
específica que se deba utilizar.
La resistencia estafilocócica clásica a las penicilinas resistentes a la penicilinasa, meticillín,
oxacillín, etc., no está mediada por una enzima que modifica la droga, sino por la presencia de
alteraciones a nivel de la superficie de las células resistentes, que son mediadas por un gen
responsable de estas propiedades fenotípicas y que se designa como mec. Algunos aisla-
mientos que poseen el gen mec pueden generar poblaciones sensibles y resistentes al
meticillín. A causa de esta heterogeneidad fenotípica, los MRSA son referidos como
heterorresistentes.
Los MRSA que muestran su resistencia por la presencia del gen mec lo son también a la
clindamicina, eritromicina y algunas veces al cloranfenicol, tetraciclina, trimetoprim-sul-
fametoxazol y a los aminoglucósidos.
Los estafilococos también ofrecen esta resistencia a las penicilinas resistentes a las
penicilinasas por una alta concentración de β-lactamasa, ya que ellos interfieren de esta
forma la actividad antibacteriana de estos agentes. Los métodos para detectar este microor-
ganismo con estas características incluyen:

1. Ligeras modificaciones del disco de difusión estándar.

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Microbiología y Parasitología Médicas

2. Modificaciones del método de dilución en caldo.

3. Screening con resultados satisfactorios.

Para cualquiera de estos tres métodos, se prepara el inóculo en caldo o solución salina
hasta obtenerse la turbidez deseada. La oxacilina es recomendada para el screening, debido
a su estabilidad y reproducibilidad de los resultados. La temperatura de incubación es
de 35 oC y por 24 horas completas de incubadora regular.
La medida del resultado final es crítica. En la prueba de difusión en disco, las placas se
examinan utilizando luz transmitida, y cualquier crecimiento es considerado significativo. No
resulta inusual observar pequeñas colonias o una suave niebla dentro de la zona de inhibi-
ción en las cepas heterorresistentes; sin embargo, algunos aislamientos que poseen una
amplia subpoblación de células resistentes pueden mostrar un crecimiento confluente sobre
el disco. En la determinación de la CIM por dilución en microcaldo cualquier evidencia de
crecimiento es significativa.
Todos los estafilococos aislados que muestren resistencia in vitro a la oxacilina o
cualquier otra penicilina resistente a la penicilinasa deben ser considerados como resisten-
tes al grupo entero y también a otros agentes β-lactámicos incluyendo penicilinas,
cefalosporinas, combinación de agentes inhibidores β-lactamasa e imipenem.
Las recomendaciones antes descritas son aplicadas a los estafilococos coagulasa
negativa.
Enterococcus spp. Este microorganismo está llamando seriamente la atención en térmi-
nos de terapia y pruebas de susceptibilidad antimicrobianas, debido al incremento mostrado
en términos de resistencia, la cual es producida por:

1. Alteraciones de superficie (fenotípicas) no mediadas por enzimas.

2. Producción de β-lactamasas.
3. Presencia de plásmidos (resistencia a los aminoglucósidos).

Por ello las pruebas de laboratorio han sido, de algún modo, modificadas. La difusión en
disco debe ser examinada con luz transmitida, y cualquier crecimiento alrededor del disco
debe considerarse significativo. Las cepas resistentes a los aminoglucósidos (HLAR) deben
ser testadas por microdilución en caldo, con dosis de 500 µg/mL y de 2 000 µg/mL de
gentamicina (ya que la CIM puede exceder de 2 000 µg/mL.
Haemophilus influenzae. Su resistencia a los antimicrobianos (fundamentalmente pe-
nicilina) se debe a la producción de β-lactamasa mediada por plásmidos y por alteraciones
fenotípicas de superficie. Esto trae como consecuencia algunas modificaciones en los proce-
dimientos de difusión en agar y dilución en microcaldo. Siempre debe utilizarse el caldo
Mueller-Hinton y no otro, un espectrofotómetro debe emplearse para estandarizar el inóculo
y la incubación debe efectuarse en atmósfera de CO2. Existen tablas específicas para medir la
sensibilidad y resistencia de estos microorganismos cuando se utiliza el método de difusión
en disco.
Streptococcus pneumoniae. La resistencia presentada por este microorganismo a la
penicilina es de origen cromosómico por alteraciones fenotípicas de superficie. Para detectar
esta resistencia se utiliza el disco de oxacillín de 1 µg (zonas de inhibición menores que 20 mm
indican resistencia) colocado en placas de agar Mueller-Hinton con 5 % de sangre de carnero.
Neisserias:
N. gonorrhoeae: su resistencia a la penicilina obedece a la producción de β-lactamasa
mediada por plásmidos, y a cambios en la permeabilidad de origen cromosómico.
Las pruebas para detectar β-lactamasa no evidencian la segunda, por lo que se propo-
nen otros métodos como la difusión en disco y dilución en agar para ponerla de manifiesto.
N. meningitidis: algunos aislamientos resultan resistentes a la penicilina por producir
β-lactamasa. Para la resistencia a la rifampicina y sulfonamidas se utilizan los test de difusión
en disco, aunque los métodos estandarizados deben estudiarse mejor.
Anaerobios. Las pruebas de susceptibilidad para anaerobios casi nunca se realizan para
todos ellos, en parte por la demora del aislamiento, identificación y ejecución de las pruebas.
Los clínicos inician siempre una terapia empírica basada en esquemas de susceptibilidad
existentes para estos agentes.

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 Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos

Una prueba de susceptibilidad para anaerobios debe realizarse solamente en situacio-

nes donde exista una alta probabilidad de que el anaerobio aislado tiene correlación con la
clínica del paciente. Los métodos recomendados con estos fines son: CIM por dilución en
agar y CIM por dilución en microcaldo.
Existen tablas específicas que miden la resistencia y sensibilidad de estos
microorganismos a los antimicrobianos.

CONDICIONES ESPECIALES PARA LAS PRUEBAS

CON ANTIMICROBIANOS

PRUEBAS DE ACTIVIDAD BACTERICIDA

La mayoría de las pruebas de susceptibilidad bacteriana son inhibitorias y las respues-
tas o resultados de las mismas pueden ser inadecuados; la concentración letal suministra
información específica y precisa. Esta situación puede surgir en el paciente cuyos mecanis-
mos de defensa están comprometidos; en este caso el antimicrobiano puede carecer del
sinergismo del efecto de defensa del hospedero, y la valoración de la actividad bactericida
es necesaria e importante. Precisamente en esta circunstancia se justifica un reajuste del
tratamiento antimicrobiano basado en el resultado de la prueba bactericida. La terminología
empleada para este efecto se conoce con el nombre de concentración letal mínima (CLM).
Las pruebas bactericidas comienzan con una prueba de susceptibilidad en caldo, como
para las pruebas comunes de susceptibilidad. La CLM se expresa en microgramos por
mililitro, como la concentración de mayor dilución que no evidencia crecimiento visible; los
pocillos que no muestran turbidez se subcultivan a una placa de agar-sangre o chocolate y
se incuban a 35 oC. La CLM se informa en microgramos por mililitro como la concentración y
mayor dilución que determina una muerte de 99,9 % del inóculo original.

PRUEBAS PARA DETECTAR ENZIMAS INACTIVADORAS

DE ANTIMICROBIANOS
1. Detección de β-lactamasas (pruebas rápidas): se utilizan pruebas rápidas, directas,
para detectar cepas productoras de β-lactamasa; ellas son:
a) Método acidimétrico rápido: se basa en la inactivación enzimática por la hidrólisis que
sufre el antibiótico.
b) Cefalosporina cromogénica (nitrocefina): es el método más sensible para la detección
de la enzima que ataca el anillo β-lactámico de una cefalosporina cromogénica (amarilla
cuando está intacta, roja si el anillo β-lactámico se rompe). Detecta β- lactamasas de N.
gonorrhoeae, Staphylococcus y Haemophilus.
c) Método yodométrico rápido: depende de la decoloración de una mezcla de almidón y
yodo, como resultado de la acción del ácido peniciloico para reducir el yodo. Se realiza
en placa de microtitulación y en papel.
Enterobacteriáceas y Pseudomonas spp. producen diversos tipos de β-lactamasas;
sinembargo, no existe una prueba específica para detectar esas enzimas en el laboratorio.
2. Pruebas para detectar la resistencia al cloranfenicol (Acetil-transferasa): uno de los
mecanismos primarios de resistencia al cloranfenicol es la producción de la enzima acetil-
-transferasa por diversos microorganismos y que destruye la actividad antimicrobiana
del mismo. Los microorganismos que la producen son: H. influenzae, S. pneumoniae y
Salmonella spp. El fundamento de la prueba consiste en:
a) Lisar las bacterias con dodecilsulfato sódico y EDTA.
b) Mezclar el lisado con acetil-CoA, cloranfenicol y dithionitrobenzeno (indicador
colorimétrico DTNB).
c) Si se produce acetil-transferasa, se transfiere el grupo acetilo al cloranfenicol y el grupo
sulfhidrilo al acetil-CoA, el cual reacciona con el DTNB y produce un cambio de color
al amarillo.

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Microbiología y Parasitología Médicas

CONTROL DE LA CALIDAD
DE LOS PROCEDIMIENTOS DE SUSCEPTIBILIDAD
Cada procedimiento de prueba de susceptibilidad tiene sus propias consideraciones de
control de calidad, y deben evaluarse con regularidad.

CONSIDERACIONES GENERALES
DE CONTROL DE CALIDAD
1. Cada laboratorio debe mantener cuidadosamente una colección de todos los
microorganismos necesarios para verificar medios, las mismas pruebas y cualquier reactivo
utilizado.
a) Para difusión por discos:
– S. aureus: ATCC 25923.
– E. coli: ATCC 25922.
– P. aeruginosa: ATCC 27853.
b) Para dilución en caldo:
– S. aureus: ATCC 29213.
– S. faecalis: ATCC 29212.
2. Almacenamiento correcto de los microorganismos de stock.
3. Evaluación de la esterilidad de los medios.
4. Comportamiento del medio, frente a las cepas de referencia o discos impregnados en
antibióticos.
5. Preparación y conservación de las soluciones de antimicrobianos.
6. Pruebas de eficiencia externa.

RESUMEN
Los métodos para determinar sensibilidad y resistencia en las bacterias se clasifican en
cuantitativos (CMI) y cualitativos (difusión en placa). Son descritos los métodos de difusión
por disco (Bauer-Kirby) y por revestimiento en agar y los errores potenciales del método; los
de dilución en agar, macrocaldo y microcaldo (CMI), y las características especiales de
bacterias problemáticas y fastidiosas como MRSA, Enterococcus spp., H. influenzae, S.
pneumoniae, Neisseria y anaerobios. Se señalan las pruebas para detectar enzimas
inactivadoras de antimicrobianos (β-lactamasas y acetil-transferasa) y de actividad bactericida,
así como los aspectos generales del control de la calidad de los procedimientos de suscep-
tibilidad.

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