BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA PRACTICA 4ª

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES

DEPARTAMENTO DE LABORATORIO DE MICOLOGÍA
UZIEL SÁNCHEZ AQUINO

AISLAMIENTO Y SIEMBRA DE HONGOS

EN PLACA Y TUBO.
TÉCNICA DE PUNTO
 INTRODUCCIÓN

La mayoría de los alimentos y productos agrícolas, son invadidos por diversos micro-
organismos durante su desarrollo y su almacenamiento, siendo los hongos los más
abundantes y la principal causa de los procesos de putrefacción de los
alimentos y de los granos, ocasionando severas pérdidas económicas. Algunos hongos
se encuentran como flora normal de diversas cavidades y mucosas del
organismo humano, así como están presentes en el suelo y las plantas, donde se consi-
dera que tales sitios son su hábitat normal.

OBJETIVO

El alumno se familiarizará y aprenderá a manejar las diversas técnicas de

aislamiento y siembra de hongos para su posterior identificación.

TÉCNICAS A EMPLEAR

C) TÉCNICA DE DILUCIÓN Y VERTIDO EN PLACA (SUSTRATOS SÓLIDOS O LÍQUIDOS MUY

CONTAMINADOS)

1. Preparar de 4 a 5 tubos con 9 mL de agua destilada, o bien, solución salina

isotónica, esterilizar y numerar del 1 al 5.

2. Se suspende en el tubo 1, un mL, o bien, un gramo de alimento ó muestra a

analizar.

3. Homogenizar perfectamente la prueba.

4. Con ayuda de una pipeta estéril, tomar 1 mL del tubo 1 y traspasarlo al tubo 2;
con otra pipeta estéril, se toma una alícuota de 1 mL y se lleva al tubo 3; así
sucesivamente hasta llegar al tubo

5. De las dos últimas, tomar 1 mL de cada una y depositarlos respectivamente en las

placas de Petri estériles y vacías.

6. Adicionar aproximadamente 20 mL del medio

PDA o SDA, estéril, fundido y enfriado a 45ºC.

7. Homogenizar por rotación de las placas sobre

la mesa.

8. Dejar solidificar e incubar a 28ºC por 4 a 5

días.

9. Hacer observaciones cada 48 h hasta la

aparición de colonias características de
hongos.
 DESARROLLO
 En este método, las suspensiones de células
microbianas se diluyen antes de su siembra en
placa.
 Se siguen estas técnicas cuando la muestra
contiene tantos microorganismos, que la dilución
no se puede realizar en una sola etapa.
 Actividad basada en la suspensión con mil
millones de células por mililitro que debe ser
diluida 107 veces para obtener una suspensión
con un centenar de células por mililitro.
 Por tanto, se realizan diluciones seriadas (en
varias etapas), normalmente de diez en diez, pero
a veces de cien en cien
 Para realizar diluciones de diez en diez, se añade
1 ml de la suspensión micológica a 9 ml (le medio
estéril o solución salina, igualmente estéril. Se
agita vigorosamente para diluir las células y el
proceso se repite cuantas veces sea necesario.
 OBSERVACIONES Y RESULTADOS

A continuación, se puede proceder y analiza:

 En el método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con
agar fundido y se vierten en placa.
 Algunas colonias quedarán embebidas en el agar y otras crecerán en la
superficie.
 Las colonias superficiales se extenderán y serán más grandes. Las
muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa
de agar, extendiéndolas con ayuda de un asa de Diralsky de cristal
estéril.
 La suspensión se absorbe en el agar, dejando las células microbianas
sobre la superficie. En ambas técnicas las placas se incuban hasta la
aparición de las colonias.
 No existe la seguridad de que las colonias que aparecen en las placas
sembradas por extensión o en el agar solidificado sembrado por el
método del vertido en placas sean cultivos axénicos hasta que se repita
el proceso.
 Las dos técnicas de siembra por dilución presentan la ventaja de que
permiten obtener un mayor numero de colonias aisladas que el método
de siembra por estría, por tanto se eligen cuando se ha de seleccionar
una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos.
(Disponiendo de una batería tubo) con medio de cultivo específico o agua es-
téril según los casos.

 Se adicionará una cantidad de muestra sólida o líquida en los tubos sa-

biendo la cantidad de muestra o inoculo que se añade en el tubo inicial. Se
agitará hasta homogeneización.

 Con pipeta estéril se tomará una cantidad específica o exacta y se adicio-

nará al segundo tubo, que se homogeneiza. Repetimos la operación ante-
rior con el tercer tubo y así sucesivamente hasta obtener la dilución
deseada.

 Con la dilución esperada, inocular en placas de cultivo una cantidad de

inoculo exacto y extender con asa de Digrasky previamente estéril.

 Incubar a temperatura precisa durante unas 24 horas y posteriormente re-

contar.

 Existen muchas variaciones de este método. Una de ellas es hacerlo en

medio de cultivo con agar, donde se mezcla en los tubos la muestra y se
diluyen hasta obtener la dilución deseada.

 Posteriormente son vertidos en placa y se deja solidificar.