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9480–9494 Investigación de ácidos nucleicos, 2019, vol. 47, núm. 18 Publicado online el 31 de agosto de 2019
doi: 10.1093 / nar / gkz737

ENCUESTA Y RESUMEN
Nuevas ribozimas: descubrimiento, mecanismos catalíticos
y la búsqueda para comprender la función biológica
Christina E. Weinberg1, *, Zasha Weinberg 2, * y Christian Hammann3, *
1Instituto de Bioquímica, Universidad de Leipzig, Brüderstraße 34, 04103 Leipzig, Alemania, 2Grupo de Bioinformática,

Descargado de https://academic.oup.com/nar/article/47/18/9480/5557732 por invitado el 27 de septiembre de 2020

Departamento de Ciencias de la Computación y Centro Interdisciplinario de Bioinformática, Universidad de Leipzig,
Härtelstraße 16-18, 04107 Leipzig, Alemania y 3Ribogenética y Bioquímica, Departamento de Ciencias de la Vida y Química,
Universidad Jacobs Bremen gGmbH, Campus Ring 1, 28759 Bremen, alemania

Recibido el 23 de febrero de 2019; Revisado el 08 de agosto de 2019; Decisión editorial 12 de agosto de 2019; Aceptado el 21 de agosto de 2019

ABSTRACTO INTRODUCCIÓN

Las pequeñas ribozimas endonucleolíticas promueven la
autoescisión de su propio esqueleto de fosfodiéster en un enlace
específico. Las estructuras y las reacciones catalizadas por
miembros de familias individuales se han estudiado con gran
detalle en las últimas décadas. En los últimos años, los estudios
bioinformáticos han descubierto un número considerable de
nuevos ejemplos de motivos de ARN catalítico conocidos. Es
importante destacar que también se descubrieron clases de
ribozimas completamente nuevas, para la mayoría de las cuales
se dispuso rápidamente de información tanto estructural como
bioquímica. Sin embargo, para la mayoría de las nuevas
ribozimas, que se encuentran en los genomas de una variedad de
especies, una función biológica sigue siendo difícil de alcanzar.
Aquí, nos concentramos en los diferentes enfoques para
encontrar motivos de ARN catalítico en bases de datos de
secuencias. Resumimos los principios emergentes de la catálisis
de ARN como se observa para las ribozimas endonucleolíticas
pequeñas. Finalmente, abordamos las funciones biológicas de
esas ribozimas, donde se dispone de información relevante y
están surgiendo temas comunes sobre sus actividades celulares.
Concluimos especulando sobre la posibilidad de que la
identificación y caracterización de proteínas que hipotetizamos
están asociadas endógenamente con ARN catalítico podría
ayudar a responder la pregunta siempre presente de la función
biológica del creciente número de ribozimas endonucleolíticas
pequeñas codificadas genómicamente.
En el año actual, miramos hacia atrás a 30 años de continuos
descubrimientos sobre el ARN catalítico, después de que el
Premio Nobel de Química fuera otorgado a Tom Cech y Sid
Altman en 1989 'por su descubrimiento de las propiedades
catalíticas del ARN' (http://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/
1989/ summary /). Los distinguidos descubrimientos se realizaron
en intrones del Grupo I autoempalmes (1) y en la subunidad de
ARN de la ARNasa P bacteriana (2). Las reacciones de estos dos
ARN catalíticos se dirigen al ARN 3′,5′ -enlaces fosfodiéster, ya sea
en una serie de dos reacciones de transesterificación
autocatalítica en cis, o mediante una reacción de hidrólisis
llevada a cabo por el componente catalítico de ARN M1 de la
ARNasa P bacteriana (Figura 1A, C). La mayoría de las ribozimas
naturales conocidas actualmente, abreviatura de enzimas de
ácido ribonucleico, actúan sobre el ARN 3′,5′ -enlaces fosfodiéster,
y otros ejemplos son los intrones del grupo II (3,4) y las pequeñas
ri- bozimas nucleolíticas (5), cuyas reacciones se muestran en la
Figura 1B, D. Por el contrario, el centro de la peptidil transferasa
del ribosoma consiste en un ARN que cataliza la formación de
enlaces peptídicos (6; Figura1MI).
Primeras observaciones hechas por Harry Noller et al. ya apuntaba
fuertemente hacia la posibilidad de que las proteínas se produzcan de una
manera catalizada por un ARN, ya que la traducción demostró ser
resistente al tratamiento proteolítico infantil (7). La prueba final de que los
ARN ribosomales son el catalizador en la formación de proteínas, en lugar
de las proteínas ribosomales, provino de estructuras cristalinas de alta
resolución que revelaron que el centro de la peptidil transferasa está
formado exclusivamente por constituyentes de ARN (6,8). Con toda
probabilidad, las reacciones catalizadas por ARN tuvieron una gama más
amplia de clases de sustrato durante la evolución; Sin embargo, debido a
la mayor diversidad química de las cadenas laterales de aminoácidos, las
enzimas proteicas tomarían el control en la transición de

*
Debe abordarse la correspondencia. ChristianHammann. Tel: +49 421 200374; Fax: +49 421 200374; Correo electrónico: c.hammann@jacobs-university.de La
correspondencia también puede dirigirse a Zasha Weinberg. Tel: +49 341971 6657; Fax: +49 341 9716679; Correo electrónico: zasha@bioinf.uni-leipzig.de La
correspondencia también puede dirigirse a Christina E. Weinberg. Tel: +49 341973 6995; Fax: +49 341973 6919; Correo electrónico: christina.weinberg@uni-leipzig.de

C El autor (es) 2019. Publicado por Oxford University Press en nombre de Nucleic Acids Research.
©
Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/
4.0/), que permite la reutilización, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original esté debidamente citada. Para reutilización comercial, comuníquese
con journalnals.permissions@oup.com
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Figura 1. Reacciones catalizadas naturalmente por ARN. Dos reacciones de transesterificación secuenciales catalizadas por el grupo I. (A) y grupo II (B) intrones en cis.
Estos dan como resultado exones unidos e intrones lineales y en lazo, respectivamente. Hidrólisis de ARN catalizadaen trans por la subunidad de ARN M1 de la ARNasa bacteriana P. (
C) da como resultado un fosfato que contiene 5′ final del tRNA maduro como el 3′ producto de escisión (3′ P) y un 3′ grupo hidroxilo en el 5′ producto de escisión (5′ PAG). Las pequeñas
ribozimas nucleolíticas experimentan reacciones de transesterificación.en cisD), en el que un 2 específico′ -hidroxilo ataca a los 3 vecinos′,5′ -enlace fosfodiéster. Esto da como
resultado un 2′,3′ -fosfato cíclico y un 5′ hidroxilo en el 5′ y 3′ productos de escisión, respectivamente. (MI) Formación de enlaces peptídicos catalizada en el centro de la peptidil
transferasa ribosómica. Esta figura fue adaptada de (163).
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el mundo de ARN9) a la vida actual dominada por proteínas. Tal
cambio en el modo de funcionamiento no es fácilmente
concebible para el centro de la peptidil transferasa en el
ribosoma y, de hecho, esta reacción más central en la generación
de proteínas permaneció catalizada por ARN. Tomando en cuenta
la variabilidad química limitada de las nucleobases de ARN, en
comparación con las proteínas, la eficiencia de la reacción
esencial, no reemplazable de la peptidil transferasa se mejoró
por otros medios. Ejemplos de estas mejoras incluyen no solo las
proteínas ribosómicas y auxiliares obvias, sino también las más
de cien modificaciones químicas que se sabe que ocurren en las
moléculas de ARNt (10). Estas modificaciones permiten una
traducción optimizada como consecuencia de las energías de
unión alteradas entre el codón y el anticodón, como se destacó
recientemente en una contribución fundamental (11). Si bien la
mayoría de las modificaciones del ARNt no son absolutamente
esenciales, la ausencia de modificaciones químicas individuales
en los ARNt puede tener efectos dramáticos en la traducción de
proteínas (12), lo que da como resultado la agregación de
proteínas (13), destacando además su importancia y necesidad
para la optimización de la reacción de la peptidil transferasa.
Por el contrario, los cuatro componentes básicos del ARN parecen
muy adecuados para catalizar reacciones a 3′,5′ -enlaces fosfodiéster, a
menudo con la ayuda de iones metálicos divalentes y,
ocasionalmente, un cofactor catalítico de molécula pequeña en el
glmS la ribozima14y ver más abajo). Más allá de los intrones auto-
empalmados y el ARN M1 mencionados anteriormente, en los últimos
30 años se descubrió un número creciente de clases de ribozimas que
catalizan reacciones de escisión de enlaces fosfo- diéster. Juntos,
estos motivos de ARN forman la familia de las ribozimas que se
autoescinden, ya que escinden de forma natural distintas posiciones
en su propia columna vertebral de fosfodiéster (Figura2). Como la
reacción es reversible, las ribozimas, en principio, también pueden
acelerar la reacción de ligadura inversa (Figura2). Sin embargo, esto
se observa sólo en algunos casos debido a la inestabilidad de los
productos de la reacción de escisión. Se ha acumulado una cantidad
significativa de datos sobre las estructuras de estos motivos de ARN
catalítico y las diferentes estrategias catalíticas que aplican en sus
reacciones. En esta revisión, resumimos diferentes enfoques que se
utilizaron para descubrir motivos de ribozimas autoescindibles
completamente nuevos, o para identificar ejemplos novedosos de
motivos conocidos en varios contextos genéticos. En comparación
con sus estructuras y mecanismos, las funciones biológicas -
particularmente de los motivos ribozimas codificados
genómicamente recientemente descubiertos - han atraído menos
atención. Resumimos el conocimiento actual para aquellas ri- bozimas
donde las funciones son conocidas o emergentes.
DESCUBRIMIENTO DE LAS RIBOZIMAS AUTOBOLSANTES
La primera clase estructural de ribozima autodescindible que se descubrió
fue la ribozima cabeza de martillo (Figura 3A). Se encontró en la hebra de
polaridad negativa de los ARN satélite del virus de la mancha anular del
tabaco (15) después de un importante trabajo de investigación de los
mecanismos de replicación de los ARN de los satélites. También se
descubrieron clases adicionales de ribozimas autodescindibles como
resultado del estudio de los sistemas biológicos en los que participan. La
hebra de polaridad positiva del ARN satélite del virus de la mancha anular
del tabaco reveló la ribozima en horquilla (dieciséis; Figura3B), y hasta la
fecha solo se conocen otros dos ejemplos de ribozimas en horquilla (17).
Esta investigación y
Las observaciones de que el virus de la hepatitis (HDV) tiene
propiedades similares a las de los ARN satélite de plantas
estimularon la identificación de la ribozima del HDV (Figura 3C; 18
). Finalmente, la ribozima satélite Varkud (VS) (Figura3D) se
encontró en transcripciones de satélites de ADN asociados con
mitocondrias en ciertos Neurospora aislamientos19).
DESCUBRIMIENTO POR BIOINFORMÁTICA
Las restantes clases de ribozimas autodescindibles, entre las
conocidas actualmente, se encontraron bioinformáticamente. losglmS
ribozima (Figura 3E) fue descubierto en una búsqueda de nuevas clases de
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riboswitches (20). Los riboconmutadores son ARN que regulan los genes
en función de su capacidad para detectar un metabolito de molécula
pequeña o ligando iónico específico (21). Dado que los riboswitches suelen
ocurrir en los 5′ UTR de genes bacterianos, la búsqueda comparó Regiones
InterGénicas (IGR) en la bacteria.
Bacillus subtilis contra los de otras especies de Firmicute. Se
investigaron más a fondo los IGR conservados corriente arriba de
los genes metabólicos. losglmS ribozima se encuentra en el 5′
UTR de glmS ARNm, cuyo producto sintetiza glucosamina 6-
fosfato (GlcN6P). La ribozima se escinde solo en presencia de
altas concentraciones de GlcN6P (14), y, en un ciclo de
retroalimentación negativa, esta división reduce drásticamente la
expresión génica de glmS (22).
Aproximadamente 10 años después, una búsqueda general de
todo tipo de estructuras de ARN conservadas en bacterias reveló
la ribozima tornado (Figura 3F; (23). Esta búsqueda analizó
múltiples linajes de bacterias y arqueas (24). En resumen, para
cada linaje, agrupó IGR similares basados en BLAST (25)
comparaciones. Para cada grupo de IGR similares, el proceso
determinó una posible estructura secundaria utilizando el
software CMfinder (26) y proporcionó automáticamente una
puntuación para indicar la probabilidad de que cada grupo de
IGR exhiba una estructura secundaria conservada
evolutivamente. Esta búsqueda descubrió muchos ARN de varios
tipos (24), incluido un motivo de ARN conservado ahora conocido
como ribozima tornado (Figura 3F).
La pista inicial de que este ARN podría funcionar como una
ribozima fue que los genes que se encuentran con frecuencia cerca
de las ribozimas tornadoras bacterianas también se encuentran
comúnmente cerca de las ribozimas bacterianas de cabeza de martillo
(23). Esta similitud en los genes asociados sugirió una función similar,
una hipótesis que se confirmó experimentalmente (23). Aún no se ha
determinado la razón de las asociaciones de genes que comparten las
ribozimas twister y hammerhead. Independientemente del papel
biológico de la ribozima en estos contextos genómicos, el hecho de
que dos clases de ribozimas auto-escindibles estructuralmente no
relacionadas se encuentren con frecuencia en estos lugares sugiere
que existe alguna necesidad biológica de una actividad de auto-
escisión altamente eficiente, y que el motivo exacto de ARN no es
importante. Estos hechos, a su vez, sugieren que podría haber clases
adicionales de ribozimas autodescindibles en estos lugares que
tienen el mismo propósito, aún desconocido (27). Esta hipótesis fue
explorada (27) enumerando primero
elementos genéticos comúnmente asociados con ribozimas que se
auto-escinden en bacterias, y luego extraen IGR cerca de estos
elementos genéticos. Se esperaba que estos IGR se enriquecieran con
ribozimas autodescindibles y, por lo tanto, se analizaron con el
método mencionado anteriormente (24) para encontrar con-

Figura 2. El mecanismo de escisión y ligadura de pequeñas ribozimas nucleolíticas. El 2′ OH ataca nucleofílicamente a los 3 vecinos′,5′ -enlace fosfodiéster. Al pasar por
un estado de transición bipiramidal trigonal, la reacción de escisión produce un 5′ producto con un 2′,3′ -fosfato cíclico y un 3′ producto con un 5′ OH. En la reacción de
ligadura inversa, este 5′ El grupo hidroxilo ataca a los 2′,3′ -fosfato cíclico y, pasando por el mismo estado de transición, el
dos ARN están unidos por un 3 convencional′, 5′ fosfodiéster.
sirvió estructuras de ARN. Se consideró que las estructuras de ARN en
estos IGR eran ribozimas autoescindibles candidatas.
De esta manera se encontraron tres clases novedosas de ribozimas
autodescindibles (27): hermana tornado (27), hacha (28) y la pistola (29
) ribozimas (Figura 3SOLDADO AMERICANO). Se descubrieron
estructuras de ARN adicionales que no se escindieron en
experimentos (27,30), y hasta ahora se desconocen las funciones de
estos ARN. Es posible que algunos de ellos funcionen como ribozimas,
pero no fueran activos en las condiciones experimentales probadas.
DESCUBRIMIENTO MEDIANTE MÉTODOS EXPERIMENTALES DE
ALTO RENDIMIENTO
Las clases de ribozimas no naturales autodescindibles han sido
descubiertas por un in vitro estrategia de selección, p. ej.31,32). En
una estrategia de este tipo, las moléculas de ARN sintetizadas
aleatoriamente se someten a un procedimiento de selección en un
laboratorio, de modo que los ARN que se autoescinden pueden
sobrevivir y replicarse, mientras que otros ARN generalmente no se
propagan. Después de múltiples rondas de selección repetida, el
grupo de ARN se enriquece mucho en ribozimas que se autoescinden.
Esta estrategia también es capaz, con ajustes, de encontrar
ribozimas naturales que se autoescinden (33). Mediante el uso de
ARN transcrito de una biblioteca derivada del genoma humano como
material de partida (en lugar de moléculas de ARN aleatorias), la
selección amplificaría cualquier ribozima autoescindible presente en
los seres humanos. Aunque este trabajo no resultó en el
descubrimiento de una nueva clase estructural, descubrió variantes
previamente desconocidas de ribozimas HDV en humanos y otros
mamíferos (33). Por tanto, los métodos experimentales también son
capaces de descubrir ribozimas que se autoescinden.
BÚSQUEDA DE SIMILARIDAD
Los métodos computacionales para encontrar secuencias que son
similares a ejemplos conocidos pueden encontrar nuevos ejemplos de
ribozimas autoescindibles, aunque estos enfoques, por definición, no
son capaces de encontrar nuevas clases estructurales. (Evitamos el
término 'búsqueda de homología', porque hay buenas razones para
creer que algunas ribozimas estructuralmente similares podrían
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resultado de la evolución convergente34). Por lo tanto, decimos que las
ribozimas pertenecen a la misma clase estructural, aunque la homología
es menos segura). En particular, las búsquedas de similitudes fueron
fundamentales para el descubrimiento de la naturaleza generalizada de
HDV (35) y martillo (36–40) ribozimas, que anteriormente se pensaba que
estaban en un grupo de organismos mucho menos diverso. (Un trabajo,
sin embargo, encontró ribozimas de cabeza de martillo generalizadas
utilizando el método discutido anteriormente para descubrir estructuras
de ARN conservadasde novo, donde se encontró que una de tales
estructuras de ARN correspondía a ribozimas bacterianas de cabeza de
martillo (41)).
Los métodos de búsqueda de similitudes se pueden dividir en dos
categorías principales: perfiles estructurales y coincidencia de patrones.
Los métodos de elaboración de perfiles estructurales explotan modelos
estadísticos de la secuencia y conservación estructural de un ARN. El
modelo estadístico más popular para la elaboración de perfiles
estructurales es el modelo de covarianza (42,43). Los modelos de
covarianza utilizan las frecuencias de nucleótidos y pares de bases en las
columnas de la alineación de secuencia múltiple de un ARN para encontrar
secuencias estadísticamente similares. En el software Infernal (en forma de
valores E) se encuentra una implementación rápida y altamente precisa
que proporciona significación estadística de los homólogos previstos (44).
La única entrada que necesita un modelo de covarianza es una alineación
de secuencia múltiple anotada con una estructura secundaria conservada
y las secuencias que se van a buscar. Los modelos de covarianza permiten
búsquedas altamente precisas de ribozimas y otros ARN.
La otra técnica de búsqueda de similitudes popular entre las ribozimas
que se auto-escinden se basa en un patrón de búsqueda definido por el
usuario que especifica la secuencia conservada y las características
estructurales de una clase particular de ribozimas que se auto-escinden.
Por ejemplo, muchos estudios (35–37,40) han utilizado RNABOB (45;
http://eddylab.org/software.html), y también se han aplicado con éxito
varios programas informáticos similares. Definir un buen patrón de
búsqueda puede ser mucho más difícil que trabajar con modelos de
covarianza (46), y los modelos de covarianza aprovechan automáticamente
incluso los sesgos más leves en las frecuencias de nucleótidos para
detectar secuencias similares. Sin embargo, la mayoría de las ribozimas
autodescindibles conocidas tienen ciertas posiciones que exhiben una
conservación extremadamente alta y, en la práctica, las búsquedas
basadas en patrones han tenido éxito para estos ARN, por ejemplo (37).
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A B C D

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mi F GRAMO

H I

Figura 3. Ejemplos de estructuras secundarias de los pequeños motivos de ribozimas nucleolíticos. (A) La ribozima Ara2 de cabeza de martillo (37), un motivo de tipo III, con una
hélice abierta III. El recuadro muestra las formas de las ribozimas de cabeza de martillo de tipo I (izquierda) y tipo II (derecha) permutadas circularmente con hélices abiertas I y II,
respectivamente. (B) La ribozima en horquilla del ARN satélite del virus de la mancha anular del tabaco (164). (C) La ribozima del virus de la hepatitis genómica (165). (D) La ribozima
satélite Varkud (166). (MI) los glmS la ribozima167) con la posición de unión de su cofactor glucosamina 6-fosfato (GlcN6P). (F) Una ribozima tornadora tipo P1 de arroz. El recuadro
muestra las formas permutadas de tipo P3 (izquierda) y tipo P5 (derecha) (23). Ejemplos de una hermana twister (GRAMO), el hachaH) y una pistolaI)
las ribozimas27). Para cada motivo, las hélices se nombran o numeran en negro de acuerdo con la nomenclatura más establecida para esa clase de ribozimas. Esta
La figura fue dibujada con R2R (168) y Adobe Illustrator.

PRINCIPIOS DE LA CATÁLISIS DE RIBOZIMA de todas las ribozimas autodescindibles descubiertas hasta e incluyendo la
ribozima tornado (51). Sin embargo, posteriormente se descubrieron
La investigación exhaustiva de las pequeñas ri- bozimas nucleolíticas
varios motivos nuevos de ribozimas (27-29) y su análisis nos permite
in vitro ha abordado aspectos importantes de los mecanismos
deducir los puntos en común de la catálisis para todas las clases de
químicos mediante los cuales las reacciones de transesterificación
ribozimas que se autoescinden, como se resume a continuación.
(Figura 2) se aceleran. Junto con extensos estudios estructurales,
Todas las ribozimas nucleolíticas pequeñas naturales presentan segmentos
estas investigaciones han dado como resultado para la mayoría de las
helicoidales que están conectados por nucleótidos formalmente desapareados,
ribozimas una imagen bastante completa de su comportamiento
a menudo altamente conservados (Figura 3). Estos últimos suelen estar
fisicoquímico, como se detalla en varios artículos excelentes,
implicados en la formación de interacciones terciarias con otras partes de la
p.ej (47–51). La revisión completa más reciente contiene una
ribozima, lo que conduce a una compactación de la
discusión detallada de los aspectos bioquímicos y de otro tipo.

Figura 4. Estrategias catalíticas de las pequeñas ribozimas nucleolíticas. Para acelerar
la auto-escisión, los motivos de ribozima emplean, en diversos grados, en línea
arreglo (), neutralización del no puente pro-RPAG (OR) y Pro-
SPAG (OS) átomos de oxígeno (), desprotonación de los 2 atacantes′ OH () y
neutralización de la carga negativa en el 5′ átomo de oxígeno () (52,53). Anuncio-
dicionalmente, el 2′ El OH puede acidificarse mediante la donación de enlaces de
hidrógeno (') o evitando interacciones inhibitorias (”). Con frecuencia, el átomo
N1 de una guanina contribuye a la estrategia, y la amina exocíclica de (a veces la
misma) guanina al principio, mientras que los grupos funcionales involucrados
en la realización de los principios son más variables. Para obtener más detalles,
consulte (54).
Estructura del ARN y, en particular, la formación del centro
catalítico que se requiere para mejorar la velocidad de la reacción
de escisión. Para ello, se han acuñado cuatro principios clásicos
(-) (Figura4): disposición en línea para el ataque nucleofílico por el
2′ OH y salida del grupo saliente (), neutralización de la carga
negativa en los dos oxígenos no puente (), desprotonación del 2
atacante′ OH () y neutralización de la carga negativa en el 5′
átomo de oxígeno (; 52,53). Un estudio reciente comparó más de
80 estructuras de alta resolución de cuatro ribozimas
endonucleolíticas pequeñas, para determinar en qué medida los
cuatro principios contribuyen a la catálisis en motivos
individuales de ARN catalítico (54). Este estudio descubrió
además dos principios adicionales, denominados "y", que
también contribuyen a la activación de los 2′ OH nucleófilo por
una guanina. En resumen, ambos conducen a una acidificación
de los 2′ OH: en el 'principio por la donación de enlaces de
hidrógeno, y en el' principio por la liberación de los 2′ OH de
interacciones inhibitorias a través de enlaces de hidrógeno
competitivos (54). Para un ataque en línea, el 180 ideal◦ arreglo de
los 2′ oxígeno, el átomo de fosfato central y los 5 salientes′
oxígeno (Figura 4) se espera que se realice solo en el estado de
transición de corta duración de la reacción, si es que lo hace. En
consecuencia, una estructura cristalina en estado fundamental
podría desviarse de esta disposición. Cuanto más cerca esté el
arreglo de 180◦ en el estado fundamental, se supone que es
mayor la contribución de la estrategia para una ribozima dada.
Esto es un ejemplo
Investigación de ácidos nucleicos, 2019, vol. 47, núm. 189485
fied por el martillo, glmS y ribozimas de pistola, que se desvían
menos de 30◦ del arreglo ideal54). Para la neutralización de
cargas negativas en los oxígenos no puente (estrategia, Figura
4), los iones metálicos divalentes o átomos de hidrógeno unidos
a átomos de oxígeno o nitrógeno están en su lugar en los
diferentes motivos de ribozimas y, a menudo, el principio emplea
intrincados enlaces de hidrógeno.
redes de ing54). La ribozima cabeza de martillo, por ejemplo,
emplea hidrógenos de una molécula de agua o 2′ -hidroxilo y
un ión metálico divalente (54). Estas interac- ciones en la
ribozima martillo aparecen menos en número en
comparación con otras ribozimas, como elglmS, Las
ribozimas twister, pistol y horquilla emplean complejas redes
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de enlaces de hidrógeno que contribuyen a la estrategia. En
estas ribozimas, las aminas exo y endocíclicas, las moléculas
de agua ordenadas o los grupos hidroxilo exocíclicos sirven
como donantes de enlaces de hidrógeno. En particular, para
elglmS ribozima, el cofactor GlcN6P (54).
Podría decirse que lo más importante para la mejora de la
velocidad catalítica general de las ribozimas nucleolíticas es el
uso de catálisis ácido-base general (55), frecuentemente
realizado por bases nucleicas dedicadas. Por ejemplo, en las
ribozimas de horquilla, retorcido y VS, elegantes análisis cinéticos
dependientes del pH de las reacciones de escisión han
identificado guanosinas específicas como base y adeninas como
ácido en la realización de los principios y principios de la catálisis (
55–61). Como una variación de este mecanismo "G / A", elglmS, El
martillo y la pistola ri- bozimas también emplean el átomo N1 de
guaninas como base general, sin embargo, todos difieren en la
naturaleza del ácido general, función que cumple el cofactor
GlcN6P, el 2′ hidroxilo y un ión metálico divalente,
respectivamente (55,62). Por tanto, el mecanismo ácido-base
general de estas ribozimas puede describirse como "G / X", o más
generalmente como "N / X", con N para nucleótido y X para una
entidad química variable. Como una variación de un mecanismo
ácido-base general “N / X”, el HDV y las ribozimas hermanas
twister usan un nucleótido para la catálisis ácido-base general: en
la ribozima HDV, una citosina actúa como el ácido general y un
metal. molécula de agua unida a iones como base general, y
también se cree que las mismas entidades químicas actúan en el
mecanismo de la ribozima hermana tornadora (63–66).
En resumen, los principios de la catálisis de ARN, como se describió
anteriormente, se comprenden bastante bien, gracias a un cuerpo
sustancial de estudios cinéticos y estructurales (resumidos en
51,54). Por el contrario, se sabe comparativamente poco sobre
las funciones biológicas de las ribozimas. Sin embargo, están
surgiendo algunos principios que se resumirán a continuación.
PAPELES BIOLÓGICOS DE LOS RIBOZIMAS QUE SE
AUTOESTIENDEN
Aunque queda mucho por aprender acerca de la importancia biológica de
las ribozimas que se auto-escinden, su abundancia y amplia distribución
sugieren que cumplen funciones importantes en la naturaleza. Algunas de
estas funciones se han descifrado, pero para muchos más ejemplos de
ribozimas, quedan por dilucidar. Hasta la fecha, se sabe que los ARN que
se autoescinden desempeñan un papel crucial en la replicación del círculo
rodante de algunas entidades circulares de ARN, como los viroides o los
ARN satélite de virus de plantas, se han encontrado como partes de
numerosos retrotransposones y, en casos aislados, se han encontrado se
ha demostrado que desempeña papeles
9486 Investigación de ácidos nucleicos, 2019, vol. 47, núm. 18
en la biogénesis del ARNm y la regulación génica. En las siguientes
subsecciones resumiremos brevemente estas funciones de ribozima.
RIBOZIMAS AUTOBROZANTES EN REPLICACIÓN DE
MOLÉCULAS CIRCULARES
Para viroides, ARN satélite de virus de plantas, ARN HDV y en
transcripciones del plásmido Varkud mitocondrial en Neu- rospora
crassa, Las ribozimas que se autoescinden juegan un papel integral
en la replicación.
Los viroides son ARN circulares que no codifican una proteína (
67,68). Utilizan la maquinaria de transcripción y procesamiento
de sus anfitriones junto con sus propios elementos de ARN para
propagarse (69). Los viroides se pueden dividir en dos familias
distintas: los Avsunviroidae, que llevan el nombre de laAvocado
SNaciones UnidasBlotch VIroiD (ASBVd), y los Pospiviroidae
nombrados después de la PAGotato Shuso Tuber VIroiD (PSTVd). Los
miembros de ambas familias se someten a una réplica del círculo
rodante. Para Pospivi- roidae, esto se realiza en el núcleo y de una
manera asimétrica que se basa, sin embargo, completamente en las
enzimas del huésped de la planta sin la participación de las ribozimas
(revisado en70). Avsunviroidae replica sus genomas de ARN
circular monocatenario en cloroplastos a través del mecanismo de
círculo rodante simétrico. Los pasos integrales de este mecanismo
son llevados a cabo por ribozimas martillo, que se han encontrado en
las hebras de ambas polaridades (71,72). En este proceso, el ARN
circular monocatenario denominado cadena (+) es transcrito por la
ARN polimerasa (Pol) dependiente del ADN del hospedador en un
ARN, denominado (-) hebra (Figura 5A). Aunque no es típico, algunas
ARN polimerasas dependientes de ADN, incluido el ARN Pol II, pueden
usar ciertas moléculas de ARN como plantillas (73–75). El mencionado
anteriormente (-) strandRNAcontiene múltiples copias de
complemento inverso de la hebra (+) que se concatenan juntas,
haciéndola 'oligomérica' o 'multimérica'. En el mul- timeric (-) hebra,
las ribozimas de cabeza de martillo pueden plegarse y activarse. Su
escisión genera unidades monoméricas, que circularizan las enzimas
del hospedador. Por ejemplo, las ligasas de ARNt de plantas podrían
catalizar la conexión de ARN con un 2′,3′ -
fosfato cíclico y 5′ -grupo hidroxilo generado por la escisión de
ribozimas (76,77); para Avsunviroidae, la isoforma cloroplas-
tica de tRNA ligasa de hecho demostró estar involucrada en
su circularización (78). La circular resultante (-) El ARN de la
hebra sirve como plantilla para la síntesis de una nueva hebra
(+) mediante pasos análogos (simétricos) de transcripción,
escisión y ligadura (revisados en 68,70).
Otros tipos de ARN circulares también usan ribozimas como parte de su
esquema de replicación de círculo rodante. RNA satelital de virus de
plantas (Figura5B), por ejemplo, puede replicarse solo en presencia de un
virus de ARN auxiliar, cuyas proteínas también realizan tareas necesarias
para el ARN satélite (68,79). Al igual que con los viroides, las ribozimas
contribuyen a la replicación al dividir las transcripciones lineales
multiméricas en monómeros. Estos monómeros se ligan de manera que
formen círculos, una reacción a menudo llevada a cabo por tRNA ligasas
citoplasmáticas (76). Sin embargo, a diferencia de las ribozimas de los
viroides, algunas ribozimas de los ARN satélite pueden, al menosin vitro,
catalizar la autoligación, además de la autofociación. Todos los ARN
satélite conocidos que utilizan un ARN catalítico durante la replicación del
círculo rodante utilizan ribozimas cabeza de martillo, y tres de estos ARN
satélite se agregan.
emplean habitualmente ribozimas en horquilla codificadas en su
hebra de polaridad negativa (15,80,81). Estos tres ARN satélite
son las únicas apariciones naturales conocidas de la ribozima en
horquilla (17). De hecho, la ribozima en horquilla es una
autoligasa de ARN eficaz (Figura2), lo que sugiere que ella, y no
una enzima proteica, también podría realizar el paso de
circularización en vivo (80,82).
Los ARN de satélite pueden utilizar la vía del círculo rodante
simétrico o asimétrico. Satélites que utilizan la replicación de
círculo rodante asimétrico, donde no se forma ningún intermedio
de ARN circular (Figura5B), emplee ribozimas de cabeza de
martillo solo en la hebra (+). Sin embargo, los satélites que
utilizan el mecanismo de círculo rodante simétrico utilizan
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ribozimas en ambos hilos (+ y-, Figura 5A). En ejemplos
conocidos, estas ribozimas pertenecen a la clase de ribozimas de
cabeza de martillo o hay una cabeza de martillo en una hebra y
una ri- bozima de horquilla en la otra (80,83,84).
Una entidad subviral estrechamente relacionada con los viroides
es el ARN del HDV. De manera similar a los ARN satélite de virus de
plantas, el ARN del HDV depende de un virus auxiliar (el virus de la
hepatitis B) para su transmisión (68). El HDVRNA se ha encontrado en
eucariotas superiores, incluidos los seres humanos, y tiene un
tamaño de genoma de aproximadamente 1.700 nucleótidos (85). El
ARN del HDV se divide en dos dominios distintos, uno de los cuales
contiene la secuencia codificante de una proteína, el antígeno delta
(Ag;86–88). La otra región genómica corresponde a un∼Secuencia
similar a un viroide de 350 nt que se pliega en una estructura
secundaria en forma de varilla para la protección contra las RNasas
celulares y contiene ribozimas autodescindibles necesarias para la
replicación en su parte terminal (88–90). El ARN del HDV se replica a
través de un mecanismo de círculo rodante simétrico catalizado por
enzimas del huésped, como una ARN polimerasa dependiente del
ADN, y progresa a través de la posterior autodescisión
cotranscripcional de las ribozimas del HDV (91–93). Los fragmentos de
ARN resultantes pueden ligarse mediante otras enzimas específicas
del huésped, que se presume que se asemejan a las ligasas de ARNt
utilizadas para este propósito en plantas (94). En el hongoNeurospora
crassa, Las ribozimas que se autoescinden son parte de un
mecanismo de círculo rodante que incluye una etapa de ADN. En el
aislamiento de VarkudNeurospora, las mitocondrias contienen un
plásmido de ADN de 881 nt (plásmido Varkud) cuyo producto de
transcripción es un ARN oligomérico que contiene ribozimas que se
autoescinden (19,95). Estas ribozimas VS realizan reacciones de
escisión y ligadura.in vitro, que son ambos necesarios para la
replicación del ARN satélite (96– 99). El transcrito oligomérico se
escinde en monómeros por la ribozima VS, que, a su vez, liga estos
ARN monoméricos para generar intermedios de ARN circulares. Se
cree que estos ARN circulares sirven como plantillas para la
transcripción inversa mediante una RT codificada en el plásmido
Varkud. Después del desplazamiento o degradación de la plantilla de
ARN de la (-) hebra de ADNc, síntesis de la cadena (+) de ADN y
ligación para generar un ADN circular cerrado presumiblemente se
produce (97).
RIBOZIMAS AUTOBOLSANTES COMO PARTE DE RETRO-
TRANSPOSONES
Hay varias clases de ribozimas que se autoescinden y que se encuentran
como partes de los retrotransposones. Un retrotransposón es un tipo de
elemento genético móvil que puede mover copias de él.
 Investigación de ácidos nucleicos, 2019, vol. 47, núm. 189487

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Figura 5. Las ribozimas autodescindibles apoyan los mecanismos de replicación del círculo rodante. (A) Mecanismo de círculo rodante simétrico en viroides de la familia
Avsunviroidae y ARN satélite de virus de plantas. El ARN de cadena circular (+) es transcrito por la ARN polimerasa dependiente de ADN en oligomérico (-) ARN de cadena. Las líneas
de puntos indican sitios de escisión que definen una sola unidad dentro del ARN oligomérico. Las unidades se separan mediante escisión de ribozimas de cabeza de martillo y se
circularizan mediante enzimas del huésped, como tRNA ligasa. La circular (-) El ARN de la hebra se utiliza para una segunda ronda de amplificación que produce el genoma de la
hebra (+). En algunos ARN satélite de virus de plantas, una horquilla en lugar de una ribozima de cabeza de martillo podría catalizar la escisión de la transcripción oligomérica de la
hebra (+), así como potencialmente la ligación del monómero lineal de la hebra (+) en un ARN circular. (B) Mecanismo de círculo rodante asimétrico en ARN satélite de virus de
plantas. Primero, la ARN de la cadena (+) es transcrita por la ARN polimerasa del hospedador en una transcripción oligomérica larga, la (-) cadena de ARN. Entonces el (-) El ARN de
hebra sirve como molde para una segunda transcripción que da como resultado una hebra oligomérica (+). Las ribozimas de cabeza de martillo, que están codificadas en la hebra (+),
escinden el transcrito oligomérico en monómeros lineales. Estas transcripciones de longitud unitaria se circularizan mediante ligadura enzimática o mediada por ribozimas.

auto a diferentes ubicaciones dentro del genoma. En este proceso, el
retrotransposón se copia primero del locus genómico por
transcripción en ARN. Luego, este intermedio de ARN se transcribe
inversamente en ADNc y se inserta nuevamente en el genoma en una
nueva ubicación. Para facilitar este proceso, los retrotransposones
suelen codificar proteínas como las transcriptasas inversas (RT) o
endonucleasas (EN;100). Aquí, discutiremos brevemente los
elementos R2 que contienen ribozimas que se autoescinden, el
retrotransposón L1Tc que se encuentra enTrypanosoma cruzi,
elementos nucleares cortos intercalados (SINE) en esquistosomas,
Penélopecomo elementos y retrozimas.
Una subclase de retrotransposones muy bien estudiada, que contiene
ribozimas similares a HDV, son los denominados elementos R2. Estos
retrotransposones de repetición terminal no larga (no LTR) se insertan
específicamente en el sitio en el ADN ribosómico (ADNr). Primero
descubierto enDrosophila melanogaster (101,102), ahora se conocen
ejemplos de estos elementos en otras especies de insectos como la polilla
de seda Bombyx mori103,104), en artrópodos, ne- matodos, aves y
tunicados (105). Los elementos R2 solo pueden integrarse en una posición
dentro de los genes de ARNr 28S, definidos por características de
secuencia en esta ubicación (Figura6A). Esta re
La rigidez en la ubicación genómica de los elementos R2 los hizo
relativamente fáciles de estudiar (105).
Los elementos R2 están compuestos por un marco de lectura
abierto (ORF), que codifica la proteína R2 y está flanqueado por 5′
y 3′ regiones no traducidas (UTR, Figura 6B). La proteína R2 es una
proteína de múltiples dominios que alberga dominios de unión al
ADN, un dominio de transcriptasa inversa y un dominio de
endonucleasa (Figura6C; (106–109). La proteína R2 y sus UTR pueden
lograr la retrotransposición, aunque es probable que también estén
involucrados factores adicionales del huésped. Como parte del
elemento R2, la ribozima similar a HDV parece ser importante para
varios aspectos de la retrotransposición. Primero, como el elemento
R2 de longitud completa se cotranscribe con el rRNA 28S por la RNA
polimerasa I (110), la ribozima, que está presente en la primera ∼184
nt de R2 (111,112), escinde esta transcripción y, por tanto, la separa
del ARNr 28S. En segundo lugar, para permitir la traducción de la
transcripción de la proteína R2 descubierta, se cree que la ribozima
similar al HDV funciona como un sitio de entrada ribosómico interno
(IRES, Figura6D; 113-116). En tercer lugar, la proteína R2 puede unirse
a ambas UTR de su transcripción, lo que facilita el proceso de
integración (117,118). En el 5′ UTR,
9488 Investigación de ácidos nucleicos, 2019, vol. 47, núm. 18
Figura 6. Varios retrotransposones contienen ribozimas que se autoescinden. (A-
D) El elemento R2 en Bombyx mori. (A) Se muestra la organización de una unidad de
ADNr con un elemento R2 insertado en un sitio específico dentro del ADNr 28S. Los
espaciadores transcritos externos (ETS) y los espaciadores transcritos internos (ITS1 e
ITS2) que se encuentran en el ARNr precursor se representan como recuadros de color
gris claro. (B) Transcripción del elemento R2 enB. mori produce un ARN que consiste en
la ribozima similar a HDV en sus 5′ UTR, el marco de lectura abierto (ORF) para la
proteína R2 y un 3′ UTR. (C) Una vista ampliada del ORF de R2 ilustra una composición
(simplificada) de dominios de proteínas, que incluyen motivos de unión de ácido
nucleico con dedos de zinc y similares a Myb, el dominio de transcriptasa inversa (RT) y
el dominio de endonucleasa ( ES). Las líneas de puntos designan regiones sin traducir.
(D) La traducción del marco de lectura abierto genera la proteína R2. Es probable que el
inicio de la traducción se produzca a través de una estructura similar a IRES de los 5′
UTR. Las proteínas R2 pueden unirse a las 5′ y 3′ final del ARN del elemento R2. (MI)
Representación esquemática de la composición simplificada de retrotransposones L1Tc
de Trypanosoma cruzi. El elemento está flanqueado por duplicaciones de sitios diana
(TSD) de generalmente 12 pb y codifica una proteína con un dominio de endonucleasa
apurínico / apirimidínico (AP EN), un dominio de transcriptasa inversa (RT) y ARNasa H y
una unión al ADN dominio. Los primeros 77 nt de L1Tc albergan una ribozima HDV
(HDV). (F) Representación esquemática de la composición de Penélopeelementos
similares (PLE). Los PLE ocurren como repeticiones en tándem o copias múltiples en las
que un marco de lectura abierto (ORF) está flanqueado porPenélope repeticiones
terminales largas (PLTR). El ORF codifica una proteína con un dominio RT y EN. Los PLTR
contienen una ribozima de cabeza de martillo (HHR) y se ha demostrado que también
contienen un intrón en algunos PLE. (GRAMO) Representación esquemática de
pequeños retrotransposones similares a elementos nucleares intercalados en
Esquistosoma a menudo se encuentran en secuencias repetitivas. Consisten en un
promotor seguido de una ribozima cabeza de martillo (HHR). Todos los promotores
podrían iniciar la transcripción. (H) Representación esquemática de la composición de
retrozimas. Las retrozimas están flanqueadas por duplicaciones de sitios diana (TSD) y
LTR, que contienen ribozimas de cabeza de martillo (HHR). La región central no
contiene un marco de lectura abierto y está flanqueada por elementos del sitio de
unión del cebador (PBS) y del tracto de poli-purina (PPT) necesarios para el cebado de la
síntesis de ADN a partir del elemento ARN.
la proteína R2 se une a un pseudonudo que es parte de una secuencia
extendida dentro de la ribozima HDV conservada (111,119). Por tanto,
la unión a la proteína R2 apoya la integración del genoma del
retrotransposón mediante un mecanismo independiente de la
autoescisión. Por último, un subproducto del procesamiento mediado
por ribozimas de la co-transcripción 28S es la propagación de varios
parásitos no autónomos de R2, los denominados SIDE (elementos
cortos eliminados internamente). Estos elementos R2 truncados han
perdido su ORF, pero pueden replicarse de forma no autónoma
utilizando las proteínas R2 proporcionadasen trans por elementos R2
completos (120).
Además de los retrotransposones que se insertan de manera
específica en el sitio en el genoma del hospedador, existen otras
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ribozimas que se autoescinden en asociación con retroelementos que
se insertan con poca especificidad y se pueden encontrar
esencialmente en cualquier parte del genoma. EnTrypanosoma cruzi
el retrotransposón L1Tc (Figura 6E) ocurre en ubicaciones genómicas
dispares, a menudo cerca del ADN repetitivo, y forma repeticiones en
tándem (121). L1Tc es un tipo de elemento nuclear intercalado largo
(LINE). Como todos los LINE, L1Tc lleva todos los elementos genéticos
necesarios para su transposición y, como tal, se denomina
"autónomo". En sus 5′ UTR, L1Tc contiene una ribozima similar a HDV,
que es activa en la escisión co-transcripcional como dice (122). Así,
también en este ejemplo, la ribozima puede desencadenar la
liberación del elemento transponible, en este caso a partir de largas
transcripciones policistrónicas, que son comunes en los tripanosomas
(122). En eucariotas, un 5′ gorra y 3′ Las colas de poli (A) son
normalmente necesarias para un inicio eficaz de la traducción. En
ciertos casos en los que estas características esenciales están
ausentes, es probable que las ribozimas similares a HDV apoyen el
inicio de la traducción. Como en el caso de los retrotransposones R2,
se ha propuesto que las ribozimas similares al HDV pueden funcionar
como IRES (122). In vitro investigaciones y en vivo Los ensayos de
traducción revelaron eficiencias de traducción similares o superiores
a las del control positivo IRES del virus de la hepatitis C (114). Por lo
tanto, parece probable que la ribozima de tipo HDV en los elementos
L1Tc y R2 actúe de manera similar a un IRES, presumiblemente
uniendo la maquinaria de traducción y permitiendo el inicio de la
traducción.
En las búsquedas computacionales basadas en estructuras
secundarias antes mencionadas, se encontró que las ribozimas
similares al HDV eran de naturaleza generalizada (35). Entre los
ejemplos descubiertos, se encontraron varias ribozimas similares a
HDV en estrecha proximidad a genes que codifican proteínas
similares a RT, y estas proteínas son típicas de los retrotransposones.
Además, se encontraron muchas regiones genómicas en las que
cientos de copias intergénicas de ribozimas similares a HDV estaban
ubicadas entre secuencias conservadas aguas abajo y diferentes
secuencias aguas arriba (35). En estos casos, las regiones aguas abajo
podrían reflejar elementos de retrotransposón conservados, mientras
que las diferentes regiones aguas arriba son consistentes con
diferentes sitios de integración. Por tanto, estos ejemplos de
ribozimas podrían ser parte de retrotransposones.
En la misma búsqueda computacional, se identificaron
ejemplos adicionales, que también contienen ribozimas similares
a HDV y pertenecen a los denominados retrotransposones y
elementos similares a retrotransposones (RTE) de baggins. Estos
elementos no llevan sus propios promotores, pero se transcriben
porque ocurren en intrones o inmediatamente después de los
retrotransposones LTR (114,123). Algunos LINE y SINE no
autónomos también hacen uso de martillo o

Ribozimas similares a HDV, y estos son conocidos en una diversa
variedad de metazoos (114,124). En todos estos casos, es probable
que las ribozimas que se autoescinden funcionen para liberar el
elemento genético móvil de su co-transcripción, como en los
ejemplos descritos anteriormente.
Los retrotransposones se pueden agrupar en diferentes subclases
que se distinguen por la presencia de LTR que generalmente sirven
como promotores transcripcionales (125), y / o su capacidad para
codificar transcriptasas inversas. Una fam- ily de retrotransposons
que no se ajusta exactamente a estas dis- tinciones y, por lo tanto,
forma su propia subclase, es la de
Penélopeelementos similares (PLE; 126,127). Se han identificado
elementos similares a penélopes en diferentes filos de
eucariotas. Están muy extendidos en metazoos, se pueden
encontrar en vertebrados, pero no en genomas de mamíferos y
su distribución incluye genomas de hongos, plantas y protistas (
126,128,129).
Los PLE codifican las enzimas transcriptasa inversa y endonucleasa y
llevan Penélopecomo LTR (PLTR) en sus extremos (Figura 6F; 130). Los PLE
son de aproximadamente 3 kb en promedio y los PLTR siempre contienen
ribozimas de cabeza de martillo, como se mostró recientemente (131). Los
PLE a menudo se encuentran adyacentes entre sí en una disposición "en
tándem", ya que tienden a insertarse en copias de PLE preexistentes o
adyacentes a ellas. Este tandemar- rangement probablemente sea
necesario para que el elemento se exprese (132). Los PLE normalmente
contienen promotores transcripcionales en sus PLTR. A partir de este
promotor, los PLE descendentes dentro de una disposición en tándem
(Figura6F) se puede transcribir, como lo confirman los estudios de
elementos PLE en tándem que demuestran que el sitio de inicio de la
transcripción del PLE descendente se encuentra en el PLTR de su socio
ascendente (129).
Además, la disposición en tándem de los PLE también parece ser
necesaria para la escisión eficaz de las ribozimas. Las ribozimas de
cabeza de martillo en los PLE tienen un bucle palindrómico,
extremadamente corto en el tallo III y son en su mayoría de
estructura secundaria de tipo I, donde los 5′ y 3′ extremo de la ri-
bozima se unen en el tallo I (Figura 3A). Las ribozimas de cabeza de
martillo con estructuras de vástago corto III se han planteado
previamente como hipótesis termodinámicamente inestables (133) y
el análisis posterior mostró que es probable que estos ARN no se
escindan como monómeros, sino que forman dímeros (131,133,134).
Por lo tanto, la distribución frecuente en tándem del PLE podría
ayudar a los pares de ribozimas de cabeza de martillo adyacentes a
formar dímeros para que puedan auto-escindirse.
Como in vitro Las tasas de auto-escisión de las ribozimas de cabeza de
martillo de PLE son muy bajas, incluso como dímeros, es plausible que
estos ARN se basen además en otros factores, como las chaperonas de
ARN, para aumentar la velocidad de escisión. en vivo (131). La escisión de
la transcripción de PLE por la ribozima generaría extremos de ARN que
podrían ligarse, ya sea por la función de ligación intrínseca de la ribozima
(Figura2) o por ligasas proteináceas presentes en las células (como se
mencionó anteriormente para la replicación de ARN circulares). Los ARN
circulares resultantes podrían servir como plantilla para un paso de
amplificación similar a un círculo rodante, similar a los que se muestran en
la Figura5. Las transcripciones oligoméricas, que no han sido escindidas
por la ribozima para formar monómeros, pueden ser utilizadas por las
enzimas PLE RT y EN para apoyar la inserción genómica del
retrotransposón (135). Esto conduciría automáticamente a una secuencia
de varios PLE adyacentes, que es de hecho la forma en que se observan a
menudo en el genoma. Tal arquitectura repetida permitiría
Investigación de ácidos nucleicos, 2019, vol. 47, núm. 189489
retrotransposición de baja eficiencia, porque un PLE corriente abajo
puede ser transcrito por el promotor en el PLE corriente arriba (126).
Otros elementos que utilizan ribozimas de cabeza de martillo son
el subtipo de retrotransposones de tipo SINE que se encuentran en
Schis- tosoma mansoni y organismos relacionados (124,136). Estos
retrotransposones se encuentran a menudo como parte de
secuencias repetitivas y parecen ser transcritos por la ARN polimerasa.
III. In vitro Los ensayos de escisión han demostrado que la ribozima
de cabeza de martillo es capaz de liberar copias SINE de
transcripciones multiméricas mediante escisión. en cis o trans124).
Una vez liberado, el ARN se copia en un ADN mediante transcriptasa
inversa, y este ADN se integra en otras partes del genoma del
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hospedador. Sin embargo, como el promotor de la ARN polimerasa III
se encuentra solo en los 3′ final de las transcripciones multiméricas
escindidas, las copias individuales de los SINE pierden su capacidad
de propagarse (Figura 6GRAMO; 124). Por lo tanto, los SINE a menudo
ocurren en repeticiones en tándem de al menos dos elementos,
donde los 5′ -la mayoría de los elementos transcriben los siguientes
SINE (124). Como una variación del tema, las transcripciones de ADN
satélite en diferentes especies de tritón (137,138) se auto-escinden
por su ribozima de cabeza de martillo incrustada, pero estas
transcripciones parecen ser generadas por la ARN polimerasa II (137).
En las plantas, los elementos transponibles identificados recientemente
denominados retrozimas contienen ribozimas de cabeza de martillo. Las
retrozimas se encuentran principalmente en eudicots, con algunos ejemplos en
helechos, monocotiledóneas y algas. Estos aproximadamente de 1 a
Los elementos de 1,5 kb de longitud están delimitados por
duplicaciones de sitios de destino (TSD) de 4 pb y LTR de
aproximadamente 350 pb que albergan cada una una ribozima de
cabeza de martillo (Figura 6H; 139). La región central del elemento
tiene una longitud variable de alrededor de 600 a 1000 pb y no parece
codificar una proteína. Si bien se cree que las retrozimas se replican a
través de la amplificación del círculo rodante (Figura5), requieren
proteínas expresadas a partir de elementos autónomos para insertar
nuevas copias en el genoma. Su región central está flanqueada por
dos dominios conservados, el sitio de unión del cebador (PBS) y un
tracto de poli-purina (PPT), que también son típicos de los
retrotransposones de repetición terminal larga Ty3-gypsy (139). Estas
regiones son necesarias para la movilización de retrotransposones
LTR, ya que sirven para cebar la síntesis de ADN a partir de la
transcripción de ARN lineal (125,140,141).
En resumen, las ribozimas que se autoescinden en los
retrotransposones permiten la propagación a través de la autoescisión y la
autoligación. Sin embargo, al estudiar las funciones de las ribozimas que
se autoescinden, debemos considerar posibles actividades adicionales que
estos ARN catalíticos pueden lograr,p.ej funcionando como un IRES o socio
de interacción de proteínas.
RIBOZIMAS AUTOLESCANTES EN LA REGULACIÓN GÉNICA
EUCARIÓTICA Y LA BIOGÉNESIS DE ARNm
Se ha implicado que varias ribozimas autodescindibles desempeñan
funciones en la regulación génica y la biogénesis del ARNm.
Ribozimas similares a HDV en genes CPEB3 en mamíferos (33) y
ribozimas de cabeza de martillo en amniotas (39,142) se encuentran
cada uno en intrones. Esta ubicación genómica sugiere una posible
función de la ribozima en el procesamiento previo al ARNm y / o
empalme alternativo, aunque aún no se han presentado pruebas
experimentales definitivas. Otra posibilidad de participación de las
ribozimas en la biogénesis del ARNm incluye una anomalía inusual
9490 Investigación de ácidos nucleicos, 2019, vol. 47, núm. 18

ribozima merhead que se describió en algunos mamíferos lectina tipo PANORAMA

C (Clec2) y genes similares a Clec (143). La estructura de cabeza de
Si bien los principios de la catálisis de ribozimas se comprenden de
martillo en este ARN está separada por una inserción de varios
manera comparable, la función biológica de la mayoría de los ARN
cientos de nucleótidos. La ribozima solo está activa cuando estas
catalíticos codificados genómicamente queda por descifrar. El uso de
regiones flanqueantes se unen, lo que les permite plegarse en la
bioinformática en los últimos años ha aumentado significativamente
estructura de la ribozima.In vitro, Se observó la división para una
el número de familias de ribozimas y ejemplos de miembros nuevos y
ribozima de cabeza de martillo bipartita. Curiosamente, el sitio de
antiguos de las mismas. La mayoría de estos, sin embargo, son
escisión de la ribozima se encuentra exactamente entre la
funcionalmente huérfanos, y solo las funciones hipotéticas de tales
terminación de la traducción y la señal de poliadenilación dentro de
motivos se han discutido en el contexto de las ribozimas de cabeza de
los 3′ UTR. Esto significa que tras la escisión, la señal de
martillo codificadas genómicamente (149). Un aspecto que no ha
poliadenilación se elimina de los 3′ final del ARNm, lo que conduce a
estado en el centro de atención de la investigación de ribozimas es la
una reducción en la expresión de proteínas en vivo (143). El
formación ubicua de complejos de ARN-proteína (RNP) en los
descubrimiento y caracterización de este inusual ejemplo de ribozima

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ha impulsado la búsqueda detrans-
escindir ribozimas144).
INBACTERIAS DE BIOLOGÍA DE RIBOZIMA AUTOLESCANTE
El reciente descubrimiento de nuevas clases de ribozimas que se
autoescinden mediante el análisis de secuencia comparativo se basa en la
observación de que, en las bacterias, las ribozimas que se autoescinden a
menudo se encuentran muy cerca unas de otras o de ciertos tipos de
genes (ver la sección de descubrimiento de ribozimas ). Esta observación,
sin embargo, no solo proporciona los medios para descubrir más
ribozimas que se auto-escinden, sino que también abre la posibilidad de
descifrar sus funciones biológicas en las bacterias, que hasta ahora son en
gran medida elusivas.
Hasta la fecha, el único ejemplo bien entendido de la función de la
ribozima autoescindible bacteriana es el mencionado anteriormente. glmS
clase de ribozima14). Aquí, el hecho de que este ARN solo se
encuentre en los 5′ UTR del glmS El ARNm sugirió
inmediatamente un papel en la regulación de genes similar al de
los r-boswitches. Distinto a la mayoría de esos motivos (145), sin
embargo, el metabolito específico GlcN6P no induce un cambio
conformacional, pero está directamente involucrado en la auto-
escisión del ARNm, como se detalla anteriormente. Por lo tanto,
la escisión inducida por GlcN6P delglmS ARNm seguido de la
degradación por ARNasas celulares (22) proporciona los medios
para la regulación por retroalimentación negativa en muchas
bacterias Gram-positivas y algunas Gram-negativas (146). Una
ribozima similar a HDV descubierta enFaecalibacterium
prausnitzii se encuentra aguas arriba de la glmM gen que
codifica la fosfoglucosamina mutasa. Esta ubicación sugiere una
posible participación en la regulación de genes dependientes de
metabolitos (147) como se ha probado en el caso de glmS
ribozimas autodescindibles14).
Además de glmS ribozima, una función biológica para algunas
bacterias martillo (41) y ejemplos de ribozimas tornado (148) se ha
sugerido en el procesamiento de mR-NA. Estas ribozimas tienen el
potencial de influir en la expresión génica en los 3′ UTR como lo
ilustran las construcciones de reporter que fueron diseñadas para
contener ribozimas twister en sus 3′ UTR (148). También se ha
sugerido que las ribozimas autodescindibles pueden procesar
transcripciones policistrónicas y que estos eventos de procesamiento
podrían conducir a transcripciones con diferentes estabilidades o
eficiencias de traducción (41,148), pero se necesita trabajo adicional
para definir concretamente el propósito específico de estas ribozimas.
Debido a su ubicación genómica cerca de los genes de los fagos,
también es probable que estas funciones de las ribozimas puedan ser
importantes tanto en los bacteriófagos como en las bacterias o sus
interacciones (23,27).
sistemas celulares, y en particular para los intrones del grupo II y la
ARNasa P, la importancia funcional de las respectivas proteínas que
interactúan. sobre la catálisis de ARN está bien documentado (p. ej. (
150,151). Aunque se han informado RNP para algunas ribozimas
nucleolíticas, o se ha informado una contribución positiva de
proteínas a su catálisis,
p.ej (152-158) o hipotetizado (27), se sabe poco acerca de la
naturaleza de la (s) proteína (s) que interactúan endógenamente,
ni su influencia general en la función de las ribozimas. en vivo.
En los últimos años, se han establecido varios enfoques
experimentales imparciales que permiten la identificación de RNP
de sistemas celulares (159-162). Dado que prácticamente todas
las moléculas de ARN en los sistemas celulares interactúan con
las proteínas, proponemos que la aplicación de tales métodos a
las ribozimas podría conducir a la identificación de sus
compañeros de interacción proteicos. Estas proteínas endógenas
que interactúan con las ribozimas (EPIR) podrían unirse a su ARN
catalítico de forma específica o no específica. En cualquier caso,
su naturaleza y caracterizaciónen vivo o in vitro podría arrojar luz
sobre la pregunta de larga data (137) de la función biológica de
las ribozimas codificadas genómicamente.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos al Dr. Benedikt Beckmann por sus útiles
discusiones y a los Dr. Timothy J. Wilson, Monica Hagedorn y
Claudia Gerlich por sus útiles comentarios sobre el manuscrito.
FONDOS
Fundación Alemana de Investigación (DFG) [LU1889 / 4-1 to
CEW, CH3459 / 10-1 a CH y WE6322 / 1-1 a ZW]; Tönjes-Vagt-
Stiftung [TVSXXXIV a CH]. Financiamiento para el cargo de
acceso abierto: DFG y LeipzigUniversity dentro del programa
de Open Access Publishing.
Declaracion de conflicto de interes. Ninguno declarado.
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