Agentes causantes de la fermentación alcohólica.

Levaduras
En la fermentación alcohólica, además de los microorganismos, juegan un papel
importante las enzimas, sin éstas no es posible la realización de tan compleja operación.
Son, por decirlo así, el complemento de la actividad celular fermentativa. Además de los
microorganismos y de las enzimas se requiere que en el medio sobre el cual actúan se den
unas condiciones especiales para que el proceso llegue a completarse: pH, potencial de
óxido-reducción, temperatura, concentración de los nutrientes en el sustrato, entre otros.
Ahora, los microorganismos que ocuparán nuestra atención son las levaduras.

Levaduras

Fermentos, son organismos unicelulares, agrupadas en la subdivisión de las talofitas,

formadas por los hongos ascomicetos, de formas esférica y elipsoidal, se encuentran
ampliamente difundidas en la superficie terrestre, especialmente en viñedos, frutales y
huertos. Su tamaño puede oscilar entre 1-5 micras de anchura y de 1-10 micras de longitud
en las formas ovoidales, con un diámetro de 5 micras en las esféricas. Las células de las
levaduras son, en general, de mayor tamaño que las de las bacterias (figura 1).

1. Estructura

Citología

La estructura de las levaduras varía según las especies. La mayor parte de la información
corresponde a la Saccharomyces cerevislae, aunque se están incorporando los
resultados de los estudios sobre otras especies. En la célula distinguimos las siguientes
partes:

Cápsulas

Algunas especies tienen un recubrimiento exterior, la sustancia capsular, compuesta por

polisacáridos, incluyendo heteropolisacáridos.

Pared celular

Cuando las células son jóvenes la pared celular es fina, a medida que la célula envejece la
pared celular se engruesa. El espesor de la pared celular es la séptima parte de su
diámetro. Los constituyentes son dos polisacáridos: glucano (unidades de D-glucosa) está
en Un 30-40%, y el manan (Unidades de D-manosa) en un 30%. Este último no se
encuentra en todas las especies (Schizosaccharomyces, Nadsonia, Rhodotorula). Las
proteínas se encuentran en todas las especies, aunque en proporciones variables. Lípidos
entre 8,5 a 13, 5%. La quitina no se encuentra en todas las especies, siendo su
concentración promedio alrededor de un 2%. La glucosina está en pequeñas cantidades.

La membrana citoplasmática

Las tres capas que la componen tienen un grosor de 8 micras. Desempeña la misma
función que en los organismos celulados, la de servir como barrera osmótica. En su
composición se incluyen lípidos, proteínas y polisacáridos.

Protoplasma
Contiene citoplasma en estado semilíquido. En el citoplasma se encuentran numerosas
enzimas.

FIGURA 1
 Esquema de una célula
RE: retículo endoplasmatico; F: filamento; G: célula de Golgi; L: gotas de grasa; MMt:
mitocondrias; N: núcleo; Mn: membrana nuclear; Nn: nucleolo; V: vacuola; Vp: gránulos de
polimetafosfato, W: pared celular; Pl: membrana celular; Pi: punto de invaginación de la
membrana; Ws: cicatriz de gemación

Núcleo

Definido por una membrana nuclear semipermeable, funcional en el metabolismo y la

reproducción. Durante la división celular permanece intacta y, en la gemación, una parte va
a la célula hija y la otra permanece en la célula madre. Aquí se encuentra el ácido nucleico
en combinación con una proteína.

Mitocondrias

Se presentan como organelos rodeados de dos membranas con diámetros entre 0,3 y 1,0
micra y longitudes mayores de 3,0 micras. Se componen de lipoproteinas, ARN y ADN
(diferente del ADN nuclear) en pequeñas cantidades. Aquí se encuentran las enzimas
respiratorias.

Vacuolas

Ubicadas en el citoplasma. En la fase adulta se componen de metafosfatos, poilfosfatos o

lípidos, enzimas hidrolíticas (proteasa, ribobonucleasa y estearasas). Funcionan como
depósitos para reserva de energía.

Reproducción

Se pueden reproducir por gemación, fisión y esporulación. La primera y la tercera son las
más frecuentes, siendo la segunda una forma de reproducción de muy pocas especies. En
la reproducción por gemación, la membrana celular de la célula adulta sufre un
estrangulamiento, a partir de la cual nace una nueva célula. A través de esta forma de
reproducción se pueden conformar cadenas, en ellas cada célula hija antes de separarse
produce yemas, o sea, nuevas células (figura 2).

En la fisión, la célula, esférica u ovalada, sufre un esponjamiento o alargamiento, el núcleo

se divide dando origen a dos células nuevas. Esta forma de reproducción es propia del
género Schlzosaccharomyces.
 FIGURA 2
Reproducción por gemación

El mecanismo de reproducción por gemación no garantiza la perpetuidad de las especies.

En la reproducción por esporulación, dos células de una misma o de distintas colonias al
fusionarse desaparece la membrana que las separa quedando una célula de mayor
tamaño. El nuevo núcleo se fracciona en corpúsculos, cada uno de los cuales se rodea d
una nueva membrana. Todo el conjunto queda guardado en la antigua membrana
formando un saco; de ahí su nombre de asca. Bajo esta forma es como la especie resiste
las condiciones adversas (figura 3).

FIGURA 3
Reproducción por esporas

Las esporas son las que se encuentran en las superficies de los frutos. En el caso de las
uvas están adheridas por una sustancia cerosa llamada pruina. Por eso el estrujado
constituye una etapa importante por cuanto su objetivo primordial es poner en contacto las
esporas con la parte interna del fruto para iniciar el proceso fermentativo.

2. Especies de levaduras

Hemos dicho que las levaduras se encuentran esparcidas por todo el planeta, desde las
profundidades de los océanos hasta las capas superiores de la atmósfera. En campo
abierto (viñedos, frutales, huertos) se encuentran en forma de esporas en las superficies de
los frutos. Este tipo de levadura se conoce con el nombre de levadura silvestre por lo que
corresponde a una especie no cultivada.
La característica de ella es el tipo superficial de fermentación que produce. En tanto que
existe otra especie cultivada, seleccionada que realiza su actividad fermentativa en el
fondo de los recipientes, a ella se la distingue de una manera diferente. A las silvestres se
les ha asignado el nombre Saccharomyces cerevisae, mientras que a la segunda
Saccharomyces carisbergensis. Otros tipos de levaduras que describiremos son la S.
elipsoideus, S. pastorianus, S. oviformis, Tórula, Kloeckera, Brettanomyces.

Todas presentan un particular interés de acuerdo con el producto que se va a obtener. Por
ejemplo, en la producción de la cerveza interesa trabajar con un tipo especial de levadura,
la Saccharomyces carisbergensis. Entre más seleccionada sea la levadura garantizará
un producto de mejores cualidades. No ocurre lo mismo con la producción de vino y otras
bebidas derivadas en donde pueden participar más de una especie de levadura, unas
como iniciantes del proceso, otras como finalizadoras del mismo.

Las especies de levaduras más investigadas han sido cerevisiae, carisbergensis y

elipsoideus; sobre las otras especies se están realizando importantes estudios aún no
reportados.

Saccharomyces carisbergensis (Saccharomyces uvarum)

El método del cultivo puro fue desarrollado por Emil Christían Hansen, de los laboratorios
Carlsberg (Dinamarca), con el objeto de buscarle una solución a los problemas
presentados en la elaboración de cervezas cuando intervenían células procedentes de
cepas diferentes. Hansen demostró que el producto final podía ser de mejores calidades si
en su proceso se empleaban células da una misma especie. Así se llegó al descubrimiento
de la levadura Saccharomyces carisbergensis como la levadura auténticamente
cervecera.

Estas levaduras son ascosporógenas el tamaño varía entre 6-10 micras de diámetro. Su
forma es ovalada siendo la levadura de fermentación de fondo más ovalada que la de
superficie. En la medida que la célula envejece, se forman mayores cantidades de
vacuolas en el protoplasma.

Su composición química es de un 75% de humedad y 25% materia seca. De ésta 90-95%

es materia orgánica distribuida así:
 Carbohidratos, 45% aproximadamente (hemicelulosa. glicógeno gomas)
 Materia nitrogenada 50% aproximadamente (90% proteínas 1 0% productos
degradación de proteínas como péptidos y aminoácidos)
 Grasa, 1 .5 - 3.0% (reserva)
 Vitaminas, 0.5% (Complejo B)
 Trazas de unas pocas enzimas, pero muy activas.

P, K, Mg, Ca, Si, Fe, 5 (trazas), constituye la materia inorgánica.

Se nutre de proteínas, glicógeno, gomas, hemicelulosa, etc. a partir de azúcares y de

sustancias nitrogenadas. De ese proceso metabólico celular resulta su crecimiento
propagación, fermentación con ayuda de las enzimas y desprendimiento de calor como se
puede observar en la siguiente reacción:

De las 27 kcal generadas 3 kcal las utiliza para su crecimiento y 24 kcal las libera como tal.
En el proceso de l fermentación, esto es cuando la célula está trabajando, su fase de
crecimiento se restringe.

Una forma de diferenciar la levadura de fondo de la de superficie es por medio del test de
Bau. Este consiste en la fermentación completa del trisacárido rafinosa en un disacárido
(fructosa y melibiasa) gracias a la acción de la enzima melibiasa. Esta enzima aparece en
las de fondo, pero no en las de superficie.
La reacción es la siguiente:

Saccharomyces pastorianus

Células ovaladas, en forma de salchicha. Su actividad fermentativa es de fondo. No es

conveniente en la industria cervecera. Es resistente a altas concentraciones de alcohol y
anhídrido sulfuroso.

Tórulas

Levaduras asporógenas, de formas esférica u oval. De distintos colores. Se reproducen por

gemación. Su presencia en las cervezas causa turbidez. No son Saccharomyces. Su
actividad alcoholizante es escasa. En el proceso de la elaboración del vino son iniciadoras
quedando eliminadas luego por la creciente concentración de alcohol y por su sensibilidad
al SO2. Están en gran cantidad en los mostos procedentes de uvas, atacadas de
podredumbre (Botrytis).

Brettanomyces

Son asporógenas. Producen acidez. Células ovales, esféricas o alargadas. Se desarrollan

lentamente formando cadenas de células. Desprenden olor a extractos de malta. En
algunas cervezas europeas se siembran en maduración para obtener condiciones
especiales de sabor y aroma por su fermentación tardía.

Kloeckera apiculatis

Células en forma de limón. Son asporógenas (levaduras falsas); comunes en flores, frutas
y suelo. Muy activas al inicio de la fermentación. Poseen poder fermentativo y oxidativo.
Suelen ser eliminadas en la medida que la concentración de alcohol aumenta. Son
perjudiciales para los vinos, en los que determinan sabores anormales y producen acidez.

Saccharomyces elipsoideus.

Es la auténtica levadura del vino. De gran tamaño (de 7 a 10 micras). Alto poder
alcohógeno y transformativo. Domina todo el proceso de la fermentación hasta cuando es
sustituida por la Sachharomyces oviformis, de un mayor poder alcoholizante. Ambas
presentan gran resistencia al SO2.

3. Las enzimas en la actividad alcoholizante de las levaduras

La palabra enzima fue tomada del término griego que significa en levadura. En la actividad
alcoholizante de las levaduras, estas sustancias juegan un papel especial; tanta es su
importancia, que se puede asegurar que las levaduras no realizan su actividad fermentativa
sin el concurso de las enzimas. Las condiciones bajo las cuales debe trabajar la enzima
afecta de igual manera a la colonia de microorganismos. Esas condiciones que determinan
la actividad enzimatica son: concentraciones de sustrato y de la enzima, temperatura y pH.

Definición.

En su asignatura de Química General tuvo la oportunidad de comprender el término

catalizador. En ese momento usted entendió el concepto como sustancias que Intervienen
en una reacción sin sufrir alteración. Pues bien, en ese sentido queda especificado acá el
término enzima.

Las enzimas son sustancias orgánicas segregadas por

los organismos vivos que actúan en los procesos
fermentativos sin que sufran alteración.

En esa definición queda establecido que las enzimas son parte integrante de la misma
célula. Esta elabora dos clases de enzimas: las exaenzimas, que actúan en la parte
externa a la célula (en el sustrato) y que tienen como función principal desdoblar las
sustancias en materia asimilable para ellas; y las endoenzimas, que actúan en su interior
encargándose de sintetizar el material celular y efectuar reacciones catabólicas, de las
cuales se desprende energía empleando parte de ella para su crecimiento.

La actividad de las enzimas es muy específica, esto es, cada enzima actúa sobre una
sustancia particular logrando su transformación.

Las coenzimas son Compuestos orgánicos que ayudan a la actividad de las enzimas. Las
enzimas que requieren coenzimas son Inactivas sin ellas. Si la parte coenzimática es un
compuesto inorgánico entonces se llama cofactor. Ejemplos: las amilasas requieren ion
cloruro, la carboxilasa requiere co-carboxilasa, etc.

Las levaduras para cumplir su cometido segregan un tipo especial de enzimas llamadas
diastasas, las principales son:
La cimasa, es el conjunto de enzimas y coenzimas que hacen posible la transformación de
la glucosa en etanol, CO2 y calorías:

En esta reacción, que aparentemente se ve sencilla, intervienen 51 enzimas y 3 sistemas

coenzimáticas. Según el ciclo de Embden - Meyerhof la descomposición de la glucosa se
realiza en 14 pasos sucesivos.

Otras enzimas integrantes de la cimasa, son:

La carboxilasa y su coenzima la co-carboxilasa, responsables de descomponer el ácido
pirúvico en acetaldehido y CO2:

La deshidrasa, o alcoholasa, que convierte el acetaldehído en etanol al proporcionarle

hidrógeno:
  La proteasa que hidroliza los prótidos a aminoácidos.
 La fosfatasa, que actúa Sobre compuestos fosfóricos
 La invertasa, que hidroliza la sacarosa a una molécula de glucosa y otra de
fructuosa.

Azúcar invertido

Los mecanismos de las reacciones enzimáticas no se tienen completamente definidos. En

general se pueden representar de la siguiente manera:

En la reacción (1): β tiempo de combinación entre E y S para dar ES ∞, velocidad de

disociación del complejo para dar E y S.

En la reacción (2): k velocidad de conversión de ES a P.

v , constante de velocidad reversible específica

Como toda reacción química, la producción de P se puede ver afectada por la modificación
en las condiciones de temperatura concentraciones y pH. Por ejemplo, si hay suficiente
sustrato entonces se va a favorecer la producción de ES. Si en la reacción (2) se retira P,
el equilibrio tiende a restablecerse hacia la derecha con una mayor concentración de E; si
ésta se encuentra en exceso puede afectar la reacción (1).