Manual de Microbiolog A Ambiental2017

MANUAL DE
MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL
[Subtítulo del plan de negocio]
[Subtítulo del plan de negocio]
Microbiología Ambiental
Autores:
Cd. Obregón, Sonora. Junio 2016

Tabla de contenido
Prólogo ………………………………………………………………………….4
Recomendaciones para el estudiante…………………………………………..5
Práctica 1. Preparación de medios de cultivo y técnicas de esterilización.. .... 6
Práctica 2. Técnicas de cultivo microbiano ..................................................... 10
Práctica 3. Caracterización macroscópica y microscópica de microorganismos
(tinción diferencial y uso del microscopio) ..................................................... 15
Práctica 4. Aislamiento de microorganismos por el método de diluciones
seriadas y conteo microbiano ...........................................................................24
Práctica 5. Preparación de medio para solubilización de fosfatos de
microorganismos aisalados del suelo ..............................................................29
Práctica 6. Curva de crecimiento ....................................................................32
Práctica 7. Impacto de condiciones de estrés abiótico sobre
microorganismos ..............................................................................................37
Práctica 8. Preparación de medio para producción de sideróforos de
microorganismos aislados del suelo ................................................................ 41
Práctica 9. Caracterización molecular de microorganismos ...........................46
Práctica 10. Análisis bioinformática de secuencias de origen microbiano .....49
Índice de figuras
Figura 1. Cultivo puro y cultivo mixto .............................................................................. 6
Figura 2. Envoltura de material de vidrio para esterilizar en autoclave……………..7
Figura 3. Preparación de medios de cultivo.. .................................................................... 4
Figura 4. Autoclave ............................................................................................................... 8
Figura 5. Vertido de agar solido en caja Petri ................................................................... 8
Figura 6. Aislamiento de microorganismos por método de estría cruzada en placa .11
Figura 7. Siembra de medios líquidos .............................................................................11
Figura 8. Morfología microscópica de bacterias ............................................................15
Figura 9. Morfología microscópica de algunos hongos y levaduras ............................16
Figura 10. Tinción de Gram ..............................................................................................17
Figura 11. Microscopio óptico compuesto ......................................................................18
Figura 12. Morfología y aspecto de colonias microbianas ............................................18
Figura 13. Prepraración y fijación de frotis .....................................................................19
Figura 14. Preparacion de tinción de gram......................................................................20
Figura 15. Método de diluciones seriadas de microorganismos y extensión en
placa 25
Figura 17. Técnica de dilución y cuenta en placa ...........................................................26
Figura 16. Conteo en placa ................................................................................................26
Figura 17. Medio Pikovskaya.............................................................................................30
Figura 18. Halos de solubilización producidos por dos cepas bacterianas .................31
Figura 19. Curva de crecimiento bacteriano....................................................................33
Figura 20. Cámara de Neubauer. .....................................................................................33
Figura 21. Recuento de 5 cuadros grandes de cámara de Neubauer ...........................34
Figura 22. Conteo de un cuadro grande de cámara de Neubauer ................................34
Figura 23. Siembra por picadura para pruebas de estrés ...............................................38
Figura 245. Esterilización por acrodisco y jeringa ..........................................................44
Figura 25. Pruebas de producción de sideróforos en bacterias en medio CAS .........45
Figura 26. Reacción en cadena de la polimerasa .............................................................47
Figura 27. Pellet...................................................................................................................48
Figura 28. Ejemplo de Electroferograma y sus componentes ...............................50
Figura 29. Interpretación de electroferogramas ................................................... 51
Figura 30. Plataforma NCBI .............................................................................. 51
Índice de Cuadros
Cuadro 1. Resultado de crecimiento de cepas ...............................................................12
Cuadro 2. Morfología colonial de cultivos microbianos en AN Y PD .......................12
Cuadro 3. Descripción de cultivos en tubos con CN y AN .. ......................................13
Cuadro 4. Descripción macroscópica y microscópica de cultivos bacterianos .........21
Cuadro 5. Descripción morfológica de hongos filamentosos .....................................22
Cuadro 6. Resultado de mediciones del crecimiento de E. coli en cultivo por lote....35
Prólogo
MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL - 4
Recomendaciones para el estudiante
Reglas para el laboratorio
1. Uso de bata obligatorio, bien abotonada la cual deberá quitarse antes de abandonar el
laboratorio.
2. No sacar del laboratorio ningún equipo, medio de cultivo o microorganismos.
3. Trabajar siempre en una mesa limpia, con el material necesario de trabajo.
4. Prohibido introducir e ingerir cualquier tipo de alimentos en el laboratorio.
5. Deberá lavarse minuciosamente las manos y evitar tocarse la cara cuando esté
trabajando en el laboratorio.
6. No pipetear con la boca, utilizar perillas.
7. No se acepta ningún tipo de visita.
Procedimientos de sanidad
 Antes de cada práctica el alumno deberá sanitizar sus mesas y utilizar su material
esterilizado con anterioridad.
 El mechero debe de estar aislado de cualquier material ajeno al especificado por la
práctica.
 Siempre hay que asegurarse de que el material utilizado quede esterilizado y limpio.
 Al término de cada sesión limpiar y sanitizar materiales y mesa de trabajo.
Requerimientos
 Uso estricto de bata y zapato cerrado.

 Diagrama de flujo de la práctica y cuestionario.
 Material preparado con anterioridad.
Práctica 1. Preparación de medios de cultivo y
técnicas de esterilización
Objetivo
o Que el alumno conozca los principios generales de la preparación y técnicas de

esterilización de diversos materiales y medios de cultivo de uso común en
microbiología. Conocer el efecto de las condiciones de asepsia en el control de
la contaminación microbiana en el laboratorio.
Información general
En microbiología, la esterilización se define como la destrucción o remoción de cualquier
forma de vida. Un objeto que esté libre de cualquier organismo viviente, se dice que está
estéril. La esterilización es uno de los mecanismos utilizados para el control de los
microorganismos, existen otros métodos de control que sólo matan o inhiben una parte de la
población microbiana como son: desinfección, pasteurización, quimioterapia y asepsia
(Santana y Poncio, 2011).
La esterilización es muy importante en los laboratorios

de microbiología porque la mayoría de los experimentos
son realizados con cultivos puros o axénicos (cultivos
que solamente tienen un tipo de microorganismo) o con
cultivos mixtos o consorcios (cultivos constituidos
por más de un tipo de microorganismo) (Figura 1) por lo
que es necesario primero esterilizar los materiales y Figura 1. Cultivo puro (izquierda)
medios de cultivo (Santana y Poncio, 2011). y cultivo mixto (derecho)
Existen diversos métodos de esterilización para la gran variedad de materiales, medios de

cultivo y sustancias que pueden ser esterilizados, los métodos más empleados en los
laboratorios son los métodos físicos como calor seco, calor húmedo, luz ultravioleta y
filtración. La velocidad con la cual los microorganismos mueren cuando son expuestos a
temperatura elevadas es función de la naturaleza del medio en el cual ocurre el calentamiento
(pH, concentración de sales y tipo de nutrientes), la longitud del tiempo de exposición y la
temperatura de calentamiento. Por otro lado, el crecimiento microbiano sólo es posible si las
condiciones físicas (temperatura de incubación y la cantidad de oxígeno presente) y químicas
(composición del medio de cultivo, pH, etc.) son apropiadas (Garcia y Picazo, 2000).
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes

que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Puesto que
la diversidad metabólica de los microorganismos es enorme, la variedad de medios de cultivo
es también muy grande.
Se utilizan distintos tipos de medios de cultivo, los cuales pueden clasificarse de la siguiente
forma (Santana y Poncio, 2011):
1. En base a su composición química pueden ser: sintéticos o definidos (cuando se

conoce la composición química cualitativa y cuantitativa exacta de todos los
componentes) y complejos (cuando no se conoce la composición química cualitativa
y cuantitativa exacta de alguno de los componentes).
2. En base a la presencia de factores de crecimiento, (nutrientes, minerales, etc,) pueden

ser: enriquecidos, los cuales incorporan una serie de factores que resultan
indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes y mínimos,
aquellos que contiene la mínima cantidad de nutrientes posible que permite el
crecimiento de una especie.
3. Por su función pueden ser: selectivos (para el desarrollo de un grupo o tipo de

microorganismos) y diferenciales (para distinguir tipos de microorganismos).
4. Por su consistencia pueden ser: líquidos (llamados caldos) con los nutrientes
disueltos en agua; sólidos, a los cuales se les adiciona un agente solidificante como
el agar a una concentración de 1.5% p/v (otro agente solidificante es la sílica gel); y
semisólidos, a los cuales se les adiciona agar en una menor concentración.
Materiales:
o
- 9 tubos de ensayo con tapa-rosca - Agar nutritivo
- 3 cajas Petri de vidrio - Caldo Nutritivo
- 1 gradilla - Autoclave
- 1 mechero - Masking tape
- 1 chispa - Algodón
- 3 pipeta de10 mL - Papel Aluminio
- 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL - Papel kraft
- 1 matraz Erlenmeyer de 100 mL - Sanitas
Procedimiento
Preparación de material de vidrio
1. Lavar en forma respectiva el material de vidrio y enjuagar con
abundante agua corriente.
2. Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada.
Dejar escurrir el material sobre una toalla o papel.
3. Una vez seco, envuelva el material como lo muestra la
Figura 2, coloque cinta testigo si cuenta con ella. Figura 2. Envoltura de material vidrio
para esterilizar en autoclave
Preparación de medios de cultivo
1. Pesar el medio deshidratado y rehidratarlo con agua destilada en un matraz Erlenmeyer
(cantidades según fabricante). Utilizando el matraz de 250 ml para el Agar nutritivo y el
matraz de 100 mL para el caldo nutritivo.
2. Agitar el matraz vigorosamente.
3. Calentar el medio con agitación hasta que se vuelva transparente (Figura 3).
4. Vaciar con una pipeta 5 mL de medio en seis tubos de rosca con Agar
Nutritivo. Enjuagar de inmediato la pipeta para evitar que se solidifique el
agar. Finalmente, con otra pipeta agregar 5 mL de caldo nutritivo a los tres
tubos restantes. Etiquetar adecuadamente cada uno de los tubos
5. Tapar los tubos con sus respectivas roscas sin cerrar completamente
y cubrir con papel de aluminio. Figura 3. Preparación de
6. Tapar el matraz con un tapón de algodón y cubrir con papel de medio de cultivo
aluminio.
Esterilización
1. Comprobar el nivel del agua.
2. Colocar en su interior el material a esterilizar.
3. Atornillar la tapa, apretar los tornillos por parejas diametralmente opuestas de forma que
la tapa encaje perfectamente.
4. Abrir la válvula de vapor y encender la fuente de calor.
5. Una vez que salga el vapor por la válvula, se espera al menos 5 minutos para expulsar
todo el aire y cerrar la válvula.
6. Vigilar el manómetro y la válvula de seguridad. Cuando se alcanza la presión requerida,
de 15 lb/pul2 (121 C) durante 15 minutos. Disminuir la intensidad de calor.
7. Apagar la autoclave y dejar que la presión baje al valor de “0”. Quitar la válvula de
seguridad y con la ayuda de guantes de asbesto o una jerga húmeda abrir
cuidadosamente la puerta.
Los medios de cultivo se esterilizan en la AUTOCLAVE, el cual hace

o uso del calor húmedo (Figura 4). La autoclave es un aparato que
permite elevar la presión y la temperatura con lo que se consigue un
aumento en la temperatura de ebullición del agua. Normalmente, se
lleva la presión a 1 atmósfera (por encima de la ambiental) lo que
corresponde a una temperatura interior de 121ºC, manteniéndolo
estas condiciones durante 15 minutos.
Figura 4- Autoclave
Vertido de medio en cajas Petri y solidificación

1. Cerrar herméticamente los 9 tubos; posteriormente colocar tres de los tubos con agar
nutritivo en una superficie inclinada de tal forma que el medio se solidifique a una distancia
aproximada de 1 a 2 cm de la boca del tubo. Los seis tubos restantes, colocarlos en una
gradilla en forma vertical y dejarlos enfriar-solidificar.
2. Dejar que el agar nutritivo contenido en el matraz que se han sacado de la autoclave se
enfríen a una temperatura de 40 a 50°C, que coincide con la posibilidad de sostener el
matraz en la palma de la mano sin sentir un calor excesivo.
3. El agar nutritivo será vaciado en las cajas Petri
(aprox. 25 a 30 ml por caja) en zona aséptica cerca
del mechero o en campana de flujo laminar (Figura
5).
4. Dejar que solidifiquen los medios (por lo menos 30
minutos).
Figura 5. Vertido de agar solido

en caja Petri
Prueba de la esterilidad de materiales.

1. Abrir una de las cajas, un tubo con Agar nutritivo inclinado, un tubo con agar nutritivo y
un tubo con caldo nutritivo por un minuto en el laboratorio y éstos se etiquetarán como
“aire”.
2. Repetir el procedimiento anterior, abriendo tanto la caja como los tubos por 30 segundos
cerca del mechero y se etiquetarán como “área aséptica”.
3. La tercera caja y los tubos restantes se conservará sin abrir y se etiquetarán como
“control”.
4. Colocar los tubos y las cajas Petri en una incubadora ajustada a 28°C durante 24-48
horas. Las cajas Petri se colocarán con la tapa hacia abajo y los tubos en una gradilla.
5. Revisar los tubos y cajas Petri para detectar la presencia de contaminantes, por la
aparición de turbidez, nata superficial.
Cuestionario
o 1. ¿Qué significa esterilización?

2. ¿Mencione en qué casos se utiliza el calor seco y el calor húmedo para la
esterilización?
3. Definir ¿qué es el punto térmico mortal?
4. ¿Qué es la esterilización por tindalización?
5. ¿Por qué es importante un buen lavado del material de vidrio antes de
esterilizarlo?
6. ¿Por qué se recomienda que al final del lavado de material de vidrio se utilice
agua destilada?
7. Indique cuando menos 4 métodos de esterilización y en qué casos los
emplearía.
8. ¿Cuándo se emplean soluciones ácidas o básicas para la limpieza de material
de vidrio?
9. ¿Por qué deben taparse con algodón los tubos, matraces y pipetas y por qué
deben envolverse o cubrir con papel cuando este material va a ser esterilizado?
Bibliografía
 Santana, C. L. y Poncio, A., M.; 2011. MANUAL DE PRÁCTICAS DE

MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez Instituto
de Ciencias Biomédicas Departamento de Ciencias Químico-Biológicas Programa
de Biología.
 Garcia, J. A.; Picazo, J., J. (2000). Microbiología Médica. Ediciones Harcourt, S.A.
Madrid España.
Práctica 2. Técnicas de cultivo microbiano
Objetivo
o Que el alumno aplique diferentes técnicas de siembra y aislamiento de cultivos

de bacterias, hongos y levaduras en medios sólidos. Comprobar la utilidad que
tienen los medios de cultivos de uso general, diferenciales y selectivos.
El cultivo de microorganismos es una actividad que requiere del conocimiento de técnicas de
siembra o inoculación y de aislamiento para transferirlos de un medio a otro, o mantener su
crecimiento y actividad. Es indispensable para realizar diversos estudios morfológicos, de
identificación, bioquímicos, de patogenicidad y ecológicos, entre otros (Aquihuatl, et al., 2012).
La inoculación de medios para cultivo es un procedimiento fundamental e importante en toda

investigación microbiológica, es por eso que se debe tener cuidado con esta técnica para evitar
la contaminación de los cultivos; las medidas de precaución empleadas para prevenir la
contaminación comprenden el procedimiento denominado técnica aséptica (Martínez, 2009).
Existen diferentes técnicas de siembra: por suspensión de la muestra en medios líquidos;

extensión de diluciones de un cultivo en superficie de medios en caja de Petri; por estría en caja
de Petri y tubos con medios solidificados en forma inclinada; o picadura en tubos con medios
sólidos o semisólidos. Con la aplicación de cada técnica se obtiene información de importancia
para el estudio básico o aplicado de los microorganismos de interés (Aquihuatl, et al., 2012).
Materiales:
o
- 5 Cajas Petri con agar nutritivo(AN) - Asa bacteriológica
- 5 cajas Petri con agar papa - Asa micológica
dextrosa (PDA) - Mechero
- 5 tubos con caldo nutritivo (CN) - Chispa
- 5 tubos con caldo dextrosa de papa - Microorganismos
(PDB)
Procedimiento
Técnica de estría cruzada (Figura 6)
1. Dividir las cajas Petri con AN por la parte de atrás en cuatro cuadrantes. Utilizar una de
las cajas como control de contaminación.
2. Esterilizar el asa con calor en el mechero.
3. Dejar enfriar el asa y tomar la muestra de una colonia.
4. Inocular la muestra haciendo 4 o 5 estrías simples muy juntas de lado a lado sobre el
primer cuadrante de la caja, cerrar la caja. Flamear el asa de inoculación y hacer girar la
caja Petri un cuarto de vuelta.
5. Abrir nuevamente la caja y con el asa de siembra esterilizada y fría, tocar la superficie del
de estrías recién hechas en un punto alejado del inicio. Hacer un segundo grupo de
estrías como en el caso anterior. Realizar el mismo procedimiento en el tercer cuadrante
y en el último cuadrante, sin flamear el asa de siembra hará una estría más abierta
(simple).
6. Incubar las cajas con la base hacia arriba a 28°C durante 24-48 horas.
Figura 6. Aislamiento de bacterias por estría cruzada en placa.
Técnica por picadura

1. Esterilizar el asa micológica con calor en el mechero.
2. Dejar enfriar el asa y tomar la muestra raspando la colonia del hongo.
3. Inocular la muestra picando el centro del medio de cultivo de las cajas con agar papa
dextrosa (PDA). Utilizar una de las cajas como control de contaminación.
4. Incubar las cajas con la base hacia arriba a 28°C durante 24-48 horas
5. .
Siembra en tubos en caldo y agar nutritivo (Figura 7)

1. Transferir con el asa bacteriológica, previamente esterilizada y fría, una pequeña
muestra de una colonia a un tubo con caldo nutritivo, agitando en el medio sin
tocar las paredes. Utilizar uno de los tubos como control de contaminación.
2. .
3. Transferir con el asa micológica, previamente esterilizada y fría, una muestra de
una colonia a un tubo con caldo dextrosa de papa (PDB) agitando en
el medio sin tocar las paredes. Utilizar uno de los tubos como control Figura 7. Siembras
de contaminación. de medios líquidos
4. Incubar los tubos a 28°C durante 24-48 hrs.
Resultados
Haga el estudio de las colonias sembradas en la superficie en medio sólido anotando: su forma,
tamaño, elevación, estructura, bordes, color, consistencia, opacidad, modificación del medio,
extensión, crecimiento en la superficie.
Estudie y anote las características de cultivo de las cepas sembradas en medio líquido, anotando
el grado de crecimiento, turbidez, sedimento, crecimiento en superficie y otras características.
A. Reportar en el Cuadro 1, sus resultados de siembra de las cepas en cada medio de

cultivo.
B. Describir la morfología colonial representativa de cada cultivo microbiano de acuerdo
con los criterios indicados en los cuadros 2.
Cuadro 1. Resultados de crecimiento de cepas. (-) No hay crecimiento; (+) Hay crecimiento
Medio de cultivo Cepa 1 Cepa 2

Caja con AN
Tubos con CN
Cepa 3 Cepa 4
Caja con PDA
Tubos con PDB
Cuadro 2. Morfología colonial de cultivos microbianos en cajas con AN y PDA
Cepa Cepa 1: Cepa 2: Cepa 3: Cepa 4:
Forma
Color
Tamaño (mm)
Borde
Elevación
Aspecto:
Consistencia:
Cuadro 3. Descripción de cultivos en tubos con CN y PDB
Cepa 1: Cepa 2: Cepa 3: Cepa 4:
Forma de película: Sí
No
Opacidad: Ligera(L),
Media(M), Nula(N)
Sedimento:
Compacto(C),
Grumoso(G), Viscoso
(V)
Grado de
crecimiento: Nulo (N)
Bajo (B), Medio (M),
Alto (A)
Forma
Extensión
Crecimiento en la
superficie: Si No
Color
Opacidad: Ligera(L),
Media(M), Nula(N)
Cuestionario
o 1. Describa algunos métodos de siembra en medios líquidos y sólidos

2. ¿Por qué es importante el pH en un medio de cultivo?
3. ¿Cuál es el efecto de la temperatura en el desarrollo de los
microorganismos?
4. Compare el desarrollo bacteriano en un medio de cultivo sólido y uno
líquido
5. Mencione 5 medios de cultivo para el desarrollo bacteriano e indicando
su contenido nutritivo
6. Mencione 3 medios de cultivo para hongos y levaduras y su
composición química
7. En un medio líquido ¿cómo espera que sea el crecimiento de un
hongo?
Bibliografía
 Aquiahuatl, M., Volke, T., Shirai, K., Ramírez, F. y Salazar, M. 2012. Manual de
prácticas de laboratorio de Microbiología general. Universidad Autónoma
Metropolitana.
 Martínez, G., Pacheco, M., Vargas B. y Barba, R. 2009. Guía de aprendizaje.
Técnico Laboratorista Químico. Secretaria de Educación Pública.
 Félix, A. 1996. Manual de Laboratorio de Microbiología. Instituto Tecnológico de
Sonora.
Práctica 3. Caracterización macroscópica y
microscópica de microorganismos (tinción
diferencial y uso del microscopio)
 Aprender las técnicas de preparación de frotis, fijación y tinción más

o
utilizadas en el estudio microscópico de cultivos microbianos.
 Conocer el manejo del microscopio óptico para la observación de
microorganismos
 Diferenciar entre dos grupos principales de bacterias: Gram-positivas y
Gram-negativas, y entender la base teórica y química de la tinción Gram.
 Describir las características morfológicas macroscópicas y
microscópicas.
El microscopio es una de las herramientas más utilizadas en el estudio de los microorganismos,
ya que proporciona la amplificación necesaria para poder observar a los organismos que no
pueden ser observados a simple vista. Conocer y entender cómo funciona este instrumento es
de vital importancia para todo trabajo en el laboratorio de Microbiología. Además de la ampliación
de la imagen, en microscopía, se consideran dos factores más: el contraste y la resolución. Los
objetos deben poseer un cierto grado de contraste con su medio circundante para poder ser
percibidos a través del microscopio. Por ello es que la mayoría de los organismos necesitan ser
previamente teñidos para poder distinguirlos del medio o para contrastar o realzar de forma
específica, distintas características morfológicas o estructurales. (Manacorda et al., 2007).
La forma de las bacterias al microscopio está

determinada por la rigidez de su pared celular.
Básicamente, se diferencian según su forma (Figura 8)
en cocos (esféricas u ovaladas), bacilos (cilíndrica o de
bastones; rectos o curvos) y espirilos (espiral) (Pírez, M.
y Mota, M. 2006).
Figura 8. Morfología microscópica de bacterias
Las levaduras son células de forma esférica u oval, mientras que los hongos filamentosos
(mohos) tienen una estructura vegetativa característica denominada hifa (Figura 9). El conjunto
de hifas ramificadas constituye el micelio. Las hifas de algunos hongos presentan tabiques
transversales o septos, aunque en el caso de los hongos que pertenecen al grupo Zygomycota,
las hifas no presentan estos septos y se conocen como hifas cenocíticas (Aquiahuatl et al., 2012).
Figura 9. Morfología microscópica de algunos hongos y levaduras
A menudo los microorganismos pueden ser teñidos de manera satisfactoria por tinción simple,
en la cual se usa sólo un agente de tinción. Las preparaciones más simples se realizan sobre
preparaciones pre-secadas. Sobre un portaobjetos con una suspensión seca de
microorganismos, se derrama una pequeña cantidad de una solución diluida del colorante y se
mantiene el contacto durante uno o dos minutos; se lava varias veces con agua y se seca.
Colorantes básicos como el cristal violeta, el azul de metileno y la carbolfucsina son
frecuentemente usados para determinar el tamaño, forma y arreglo de las bacterias (Madigan, et
al., 2000, Sosa, 2007).
Se denominan tinciones diferenciales aquellas que no
tiñen de manera homogénea a todos los tipos de células.
La más importante tinción diferencial utilizada en
microbiología se denomina, tinción de Gram llamada así
en honor al Dr. Hans Christian Gram. Este método divide
las bacterias en dos grandes grupos, las Gram-
negativas y las Gram-positivas (Figura 10). Esto es Figura 10. Tinción de Gram;
esencial para la clasificación y diferenciación de Gram-positiva (izquierda) y Gram-negativa
microorganismos. La reacción a la tinción de Gram está (derecha).
basada en la diferencia en la composición química de
la pared celular bacteriana.
Para observar las características microscópicas de los microrganismos una vez realizada
cualquiera de estas tinciones es necesario conocer bien el manejo del microscopio. El
microscopio compuesto (Figura 11) dispone de dos o más lentes de aumento. El microscopio se
divide en dos partes: el sistema óptico y sistema mecánico.
Sistema mecánico
 Pie: es el soporte del microscopio.

 Soporte. Es la pieza fija en la que sólo la platina y el condensador tienen un cierto
movimiento. Sus principales partes son:
 Base. Normalmente alberga la fuente de iluminación, en determinados modelos se
incorpora además, un sistema porta filtros con varios filtros y un diafragma de campo
luminoso.
 Brazo. Soporta todo el sistema óptico, el cabezal porta oculares y el revólver porta
objetivos. En él se dispone también un sistema de anclaje de la platina (movimiento de
enfocado de la preparación).
 Platina. Es la pieza donde se coloca la preparación microscópica para su observación.
 El Macrométrico y el Micrométrico. Ambos permiten enfocar la preparación. El primero
se emplea para un enfoque rápido cuando se trabaja con objetivo de menor aumento
(x10), mientras que el segundo permite fijar el enfoque cuando se utilizan los objetivos de
mayor aumento (x40, x100).
Sistema Óptico
 Ocular: lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo.
 Objetivo: lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta.
 Condensador: lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.
 Diafragma o iris: regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
 Foco: dirige los rayos luminosos hacia el condensador
Figura 11. Microscopio óptico compuesto
La evaluación de las características macroscópicas de las colonias habitualmente se lleva a cabo

por medio de observación visual del crecimiento en la superficie de las placas de agar (Bailón.
L., González, R., y Cervantes, A. 2003). El tamaño, forma y aspecto de las colonias obtenidas
por esta técnica suele ser bastante constante y precisa para cada género y/o especie, hecho que
se puede utilizar como característica diferencial. Para ello debemos considerar los siguientes
puntos: tamaño, forma, superficie, consistencia, transparencia y coloración (Figura 12).
Forma Elevación Borde
Figura 12. Morfología y aspecto de colonias microbianas.
.
o Materiales:
- 1 piseta - Lugol
- 1 mechero - Safranina
- 1 chispa - Cristal Violeta
- 1 puente - Alcohol-acetona
- 1 asa - Aceite de inmersión
- 4 portaobjetos - Microscopio óptico
- Incubadora - Lactofenol
Procedimiento
Realización de frotis (Figura 13)
1. Lavar perfectamente los portaobjetos y secarlos con cuidado.
2. Encender el mechero y esterilizar el asa en la flama hasta que se ponga al rojo vivo. Dejar
enfriar el asa para evitar la quema y destrucción de los microorganismos. Si los frotis son
de cultivos sólidos, se colocará en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada.
3. Acercar la caja de Petri con el cultivo o el tubo, quitar el tapón del tubo, flamear la boca e
introducir el asa para tomar la muestra. Colocar la muestra en el centro del portaobjetos,
extenderla suavemente en área circular de más o menos 2 cm de diámetro y esterilizar el
asa. Dejar secar el frotis al aire.
4. En el caso de cultivos líquidos, se toma la muestra del tubo: de manera directa y se realiza
el mismo procedimiento antes descrito.
Fijación de frotis (Figura 13)

5. Los frotis de cultivos sólidos se fijarán con calor, pasando el portaobjetos rápidamente 2-
3 veces por la flama del mechero.
6. Los frotis de medios líquidos se fijarán colocando dos gotas de etanol absoluto, que se
dejarán secar al aire (precaución: hacer esto en zona alejada del mechero).
Figura 13. Preparación y fijación de frotis
Nota:
Las extensiones deberán ser finas y uniformes para permitir el paso de la luz a través
de ellas y facilitar su observación
Tinción de Gram (Figura 14)

1. Cubrir el frotis con dos gotas de cristal violeta dejar actuar el colorante de 30 segundos a
un minuto, después lavar cuidadosamente el frotis con agua destilada para eliminar el
exceso de colorante.
2. Eliminar el exceso de agua y cubrir la preparación con Lugol, dejar actuar este agente
por 30 segundos.
3. Escurra el Lugol, lavar cuidadosamente con agua, cubra la preparación con alcohol-
acetona de 30 a 60 segundos, lavar con agua de la llave.
4. Aplicar dos gotas de safranina por un minuto y lave con agua de la llave y dejar secar al
aire.
Figura 14. Preparación de tinción de Gram
Observación al microscopio
1. Limpiar con precaución los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.
2. Ajustar el haz de luz en el centro del campo de observación.
3. Colocar los portaobjetos en la platina y localizar la preparación con el objetivo de 10X,
después pasar al objetivo de 40X. Para la observación con el objetivo de 100X colocar
previamente una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación.
4. Al finalizar las observaciones, limpiar el objetivo con papel seda para eliminar el exceso
de aceite y evitar incrustaciones que dañan estos sistemas.
Observación microscópica de hongos filamentosos

1. Colocar una gota de azul de lactofenol en el centro de un portaobjetos limpio.
2. Cortar una tira de 4-5 cm de cinta adhesiva transparente; doblar la cinta en “U” tomándola
por los extremos con el adhesivo hacia afuera.
3. Abrir la caja Petri cerca del mechero y presionar suavemente la cinta adhesiva sobre la
periferia de la colonia.
4. Colocar suavemente la cinta con la muestra sobre la gota de azul de lactofenol, evitando
la formación de burbujas para no alterar las estructuras. La cinta funciona como
cubreobjetos, no es necesario colocar uno.
5. Dejar reposar durante 3-5 minutos y hacer observaciones en el microscopio con los
objetivos de 10X y 40X. Localizar y observar hifas y las estructuras especializadas.
Nota:
El objetivo de inmersión, no debe tocar la preparación pero sí la gota de
aceite.
Una vez que ya ha puesto aceite de inmersión sobre la preparación ya no puede

volverse a colocar los objetivos de 10x y 40xsobre ese campo. Por lo tanto, si
desea enfocar otro campo, debe retirar el objetivo de inmersión girando el
revólver hacia el objetivo de menor aumento (x10), seleccionando otro campo y
empezando a enfocar desde éste último.
Resultados
Reportar las observaciones macroscópicas y microscópicas de las cepas en los cuadros 4 y 5.
Comparar las observaciones realizadas con las de la literatura.
Cuadro 4. Descripción macroscópica y microscópica de cultivos bacterianos.
Características Cepa 1:
Cepa 2:
1 2
Descripción
macroscópica
(colonias)
Color
Tamaño
Forma
Elevación
Borde
Descripción
microscópica
Aumento
10x,,40x,100x
Tipo de Gram
Positiva o
negativa
Forma:
cocos, bacilos,
etc.
Agrupamiento
de las células
Tamaño
Cuadro 5. Descripción morfológica de hongos filamentosos
Características Cepa 1:
Cepa 2:
1 2
Descripción
macroscópica
(colonias)
Color
Tamaño
Forma
Elevación
Borde
Superficie
Descripción
microscópica
Aumento
10x,,40x,100x
Septos
Si / No
Estructura de
reprodución
Tipo de
esporas
Clasificación
Cuestionario
o 1. Explicar las diferencias entre una tinción simple y una diferencial

2. ¿Cuál es la función que desempeña el Lugol en esta coloración?
3. Escribir el nombre científico (Género y especie), de 5 bacterias Gram
positivas y 5 Gram negativas.
4. Explicar ¿Por qué algunos microorganismos Gram positivos en un
cultivo joven pueden volverse Gram negativos cuando envejecen?
Bibliografía

de Biología.
 Madigan, M., T., Martinkop, J., M., Parker J. 2000. Brock, biología de los
microorganismos. 8va edición. Prentice hall.
Metropolitana
 Pírez, M. y Mota, M. 2006. Morfología y Estructura Bacteriana. Instituto de Higiene.
Universidad de Medicina de Montevideo. Montevideo, Argentina. 23-42p.
 Bailón, L., González, R. y Cervantes, A. 2003. Atlas de Pruebas Bioquímicas para
Identificar Bacterias. Universidad Nacional Autónoma de México.
Práctica 4. Aislamiento de microorganismos por el
método de diluciones seriadas y conteo de
población microbiana
Objetivo
o  Que el alumno desarrolle las habilidades para identificar y aislar los

principales microorganismos presentes en el suelo.
 Conocer el método de conteo en placa.
 Calcular las UFC de una muestra de suelo.
El suelo es un ecosistema que contiene una gran variedad de poblaciones microbianas cuyos
miembros representan muchos tipos fisiológicos. Las características químicas, físicas y
biológicas de un suelo particular, así como la presencia de crecimiento de plantas influirán en el
número y actividades de sus diversos componentes microbianos. La comunidad microbiana en
suelos es importante por su relación con la fertilidad del suelo y con los ciclos biogeoquímicos
de los elementos, además del uso potencial de los miembros específicos para aplicaciones
ambientales e industriales. Por lo que existe la necesidad de conocer, enumerar y aislar los
miembros principales y menores de la comunidad microbiana en suelos.
La forma de cuantificar células viables más utilizada en microbiología es la de recuento en placa

con medios de cultivo específicos para la población de interés. Consiste en inocular un volumen
determinado de cultivo o muestra sobre un medio de cultivo sólido adecuado para el crecimiento
de colonias el crecimiento de colonias. Cada una de estas se deriva de una célula aislada; es
decir, una unidad formadora de colonia (UFC).
El método de dilución seriada es la forma más utilizada en microbiología para cuantificar células
viables. Por el gran número de microrganismos encontrado en suelos, una pequeña muestra de
suelo es diluida seriadamente en agua, posteriormente ésta será inoculada y esparcidas en cajas
Petri con medio de cultivo (Figura 15).
Esta técnica aplicada en muestras complejas dará una estimación aproximada del número total
de microorganismos, dependiendo del medio de cultivo utilizado, ya que no hay un medio y
condiciones de incubación que favorezcan el crecimiento de todos los microorganismos.
También pueden presentarse problemas relacionados con falta de homogeneidad de las
diluciones y en la inoculación de las muestras, por lo que se pueden obtener bajos valores si es
que las células no se separan bien y valores elevados si la toma de las muestras se hacen del
fondo del tubo donde se han concentrado por gravedad los microorganismos.
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
9 mL
medio
cultivo
-1 1/100 1/1000 1/10000 1/100000 1/1000000 1/10000000

1/10 -2 -3 -4 -5 -6 -7
1x10 1x10 1x10 1x10 1x10 1x10
Método de dilución seriada

Tomar 0.1 mL de cada muestra
Colonias de
superficie
La muestra se pipetea sobre la La muestra se extiende

uniformemente sobre la Incubar Resultado típico de
superficie del agar (0.1 mL) siembra por extensión
superficie del agar usando un asa
acodada de vidrio estéril
Método de extensión en placa
Materiales:
o - 7 Cajas Petri con agar nutritivo - 1 Matraz Erlenmeyer de 125ml
- 7 cajas Petri con agar dextrosa de - Mechero
papa - Asa acodada
- Perilla
- 12 Pipetas de 1 ml (estéril)
- Gradilla
- 6 Tubos con 9 ml de agua - Suelo
destilada (estéril)
Procedimiento
Nota:
Antes de comenzar con la práctica recuerda desinfectar la mesa de trabajo y esterilizar
el material ya mencionado.
Es muy importante mantenerse lo más cerca posible del mechero al momento de realizar
las diluciones y la inoculación.
Diluciones seriadas
1. Pesar 10 gramos de la muestra de suelo y añadirlos a 90 ml de agua destilada ya
esterilizada en el matraz, agitar vigorosamente, etiquetar como 1x10-1.
2. Antes de que el suelo se sedimente tomar 1 ml de la suspensión con una pipeta estéril y
transferir al primer tubo con 9 ml de agua destilada, agitar y etiquetar como 1x10-2.
3. Repetir este paso cuatro veces más, cada vez con 1 ml de la suspensión previa con una
nueva pipeta a otro tubo con 9 ml de agua destilada y seguir etiquetando hasta 1x10-7
(Figura 15).
Inoculación por el método de extensión en placa
1. Etiquetar las 6 cajas Petri desde 1x10-2 hasta 1x10-7; agar nutritivo y PDA respectivamente
2. Tomar el primer tubo de 1x10-2 y tomar 0.1 ml de la suspensión con una nueva pipeta
estéril y depositar en la respectiva caja Petri. Distribuir cuidadosamente el inoculo en toda
la superficie del medio cerca del mechero hasta notar que el líquido ha desaparecido con
el asa acodada que previamente se sumergió en alcohol, se pasó a la flama del mechero
y se dejó enfriar (Figura 15).
3. Repetir este paso con las 5 cajas restantes, dejar una caja de PDA y AN como control de
contaminación.
4. Incubar las 6 cajas Petri de 24 a 48 horas a 28°C aproximadamente.
Conteo en placa
1. Contar solo aquellas cajas (diluciones) que contengan de 30 a 300 colonias (Figura 16).
2. Si la inoculación fue por duplicado o triplicado, se calcula el número promedio de colonias
por dilución.
3. Con la siguiente ecuación calcular las UFC.
1 1
𝑁𝐶 ∗ ∗
𝑈𝐹𝐶/𝑔. 𝑠. 𝑠. = 𝐹𝐷 𝑉
𝑃 ∗ 𝐹𝐻
% 𝐻𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑
𝐹𝐻 = 1 −
100
Donde:
UFC/g.s.s. = Unidades formadoras de colonias / g de suelo seco.
NC = Numero de colonias en una caja
FD = Factor de dilución que corresponde a la dilución de donde se tomó la muestra con
la que se inocula la caja.
V = Volumen inoculado en la caja = 0.1 mL
P = Peso de la muestra húmeda = 10 g
FH = Factor de corrección de humedad
4. Determinar la diversidad microbiana, en base a la morfología macroscópica de las

colonias (ejemplo 5 colonias rosas, 2 colonias blancas etc).
5. Conservar a 4° C, caja Petri correspondiente a la dilución serial empleada para
determinar la población total y diversidad microbiana, ya que estos
microorganismos serán utilizados en las prácticas posteriores.
a) b) c)
Figura 16. Conteo en placa.
Ejemplo:
Se quiere conocer la población microbiana de una muestra de suelo. Por lo que se
realizaron diluciones seriadas, pesando 10 g de suelo húmedo (humedad de 10%), y
sembrando 0.25 ml de cada una de ellas en cajas de Petri conteniendo Agar Nutritivo
como medio de cultivo. La caja a) corresponde a la dilución 10-3 y se encuentran 314
colonias microbianas, la caja b) corresponde a la dilución 10-4 y contiene 71 colonias, y
la caja c) corresponde a la dilución10-5 y se formaron 20 colonias. Por lo tanto la única
caja que se puede tomar en cuenta para la estimación de la población de
microorganismos en el suelo es la caja b obteniendo 3.15𝑥105 UFC/g de suelo seco.
𝑈𝐹𝐶 1 1
71 ∗ −4 ∗
𝑈𝐹𝐶/𝑔. 𝑠. 𝑠. = 𝑚𝐿 10 0.25 𝑚𝐿 = 315555.5556 = 3.15𝑥105 𝑈𝐹𝐶/𝑔. 𝑠. 𝑠.
10
10 ∗ (1 − )
100
Cuestionario
o 1. ¿Qué tipos de conteo celular existen y cuáles son los más utilizados?
2. Menciona dos ejemplos de aplicaciones en donde se utilice cada una
de las técnicas realizadas.
3. Investiga qué tipo de microorganismos se encuentran usualmente en el
suelo y compara con tus resultados obtenidos en la práctica.
4. ¿Qué condiciones ambientales afectarán el crecimiento microbiano en
el suelo?
5. Explique cuáles la importancia de realizar análisis estadísticos de los
resultados en este tipo de métodos de cuantificación de
microorganismos.
6. Explique la importancia de considerar el factor de dilución en el cálculo
de UFC/mL
Bibliografía
 L. Pepper, Charles P. Gerba, Terry Gentry and Raina M. Maier. (2009).

Environmental Sample Collection and Processing. En Environmental
Microbiology(174,175,176,177). Tucson, Arizona: ELSEVIER.
 Fernandez, L., Rojas, N., Roldán, T., Ramírez, M., Zegarra, H., Hernández R.,
Reyes, R., Flores, D. y Arce J. (2006). Manual de técnicas de análisis de suelos
aplicadas a la remediación de sitios contaminados. Mexico, D.F.
Metropolitana.
Metropolitana
 Aquiahuatl, M. y Perez, M. 2004. Manual de prácticas de laboratorio de
Microbiología general. Universidad Autónoma Metropolitana
Práctica 5. Preparación de medios para
solubilización de fosfatos de microorganismos
aislados de suelo
Objetivo
o Que el alumno identifique los microorganismos capaces de solubilizar fosfatos

aislados de una muestra de suelo, esto mediante la preparación e inoculación
de un medio diferencial (medio Pikovskaya).
El fósforo es un elemento esencial para la vida: las plantas lo necesitan para crecer y desarrollar
su potencial genético y forma base de gran número de compuestos, de los cuales los más
importantes son los fosfatos. (Salazar, 2005).
Una insuficiencia de fósforo en el suelo puede influir en el retraso de madurez y el desarrollo de

la planta, disminuyendo el rendimiento de la cosecha, por esta razón, los microorganismos
solubilizadores de fosfatos desarrollan un papel fundamental en cuanto la movilización de este
elemento; además, presentan ventajas frente a fertilizantes químicos pues colaboran con la
preservación del medio ambiente, ya que no implican sustancias tóxicas que afecten el sistema,
generando de esta manera una agricultura sostenible (Chen et al., 2005).
Los microorganismos solubilizadores de fosfato son un grupo funcional de PGPM

(Microorganismos Promotores del Crecimiento Vegetal) que incluyen no sólo bacterias, sino
hongos y actinomicetos con la capacidad de solubilizar fosfatos minerales que han sido fijados
en los suelos y que no pueden ser utilizados por las plantas en su nutrición; por ello su rol
ecológico es esencial (Beltrán, 2014).
o
Materiales:
- Cajas Petri - Espátula
- Matraz Erlenmeyer de 500 mL - Balanza
- Potenciómetro - Mechero
- Autoclave - Asa bacteriológica
Reactivos:
o
- 350 mL de agua destilada - 2.5 g de Ca3(PO4)2
- 10 g de (NH4)2SO4 - 0.25 g de extracto de
- 4 g de NaCl levadura
- 2 g de MgSO4 ∙7H2O - 0.250 g de Azul de
- 4 g de KCl Bromofenol
- 0.04 g de MnSO4 ∙H2O - Etanol al 20%
- 0.04 g de FeSO4∙7H2O - Agar
- 5 g de glucosa
Procedimiento
Nota:
Antes de utilizar los materiales de laboratorio y los medios de cultivo preparados a partir
de ingredientes o de preparados comerciales, deben ser envasados, esterilizados y
protegidos adecuadamente para conservar la esterilidad durante su uso y
almacenamiento, lo cual garantiza que se trabajará exclusivamente con los
microorganismos deseados.
Preparación de Medio Pikovskaya para Solubilización de Fosfatos.

1. Colocar 350 mL de agua destilada a un matraz de 1 Lts.
2. Agregar 12.5 mL del “Stock sales de Pikovskaya” 40x.
Preparación de 500 mL de “Stock sales de Pikovskaya” 40x:

o
Agregar los siguientes reactivos en 500 mL de agua destilada
Reactivos: Cantidad:
(NH4)2SO4 10 g,
NaCl 4g
MgSO4.7H2O 2g
KCl 4g
MnSO4.H2O 0.04 g
FeSO4.7H2O 0.04 g
3. Agregar en agitación 5 g de Glucosa, 2.5 g de Ca3(PO4)2 y 0.25 g de extracto de

levadura.
4. Medir pH y ajustar a 7.0
5. Agregar 7.5 g de Agar
6. Calentar en agitación hasta que el medio esté casi completamente disuelto y a punto de
hervir.
7. Agregar 5 mL de solución “Stock Azul de Bromofenol 100x” y homogenizar.
Preparación de “Stock Azul de Bromofenol” 100x:

o
Reactivos: Cantidad:
Azul de Bromofenol 0.250 g
Etanol al 20% Aforar a 100 mL
8. Aforar a 500 mL
9. Esterilizar en autoclave a 121 °C, 15 lb de presión durante
15 min.
10. Vaciar en cajas Petri en zona aséptica cerca del mechero o
en campana de flujo laminar.
11. Dejar solidificar y cerrar las cajas hasta que el medio esté
sólido y a temperatura ambiente (Figura 17).
Figura 17. Medio Pikovskaya
Inoculación de microorganismos
1. Dividir la caja Petri en cuatro partes por el lado posterior (base).

2. Transferir con el asa bacteriológica, previamente esterilizada y fría, una pequeña muestra
de una colonia aislada del suelo en la práctica anterior en un cuarto del medio. Repetir lo
mismo para las demás colonias.
3. Dejar incubar a 35°C durante 24-48 horas.
Resultados
El medio PVK contiene fosfato tricálcico
como única fuente de P, sustancia
altamente insoluble, lo cual permite la
selección directa de los microorganismos
con capacidad solubilizadora. La
solubilización de fosfato se detecta por la
presencia de un halo de solubilización
Figura 19. Halos de solubilización producidos por
transparente alrededor de las colonias.
dos cepas bacterianas (Patiño, C. 2010).
El halo es la medida en que ocurrió la
solubilización, el cual constituye el indicador de la actividad (Figura 18).
Cuestionario
o 7. Explique la importancia de la solubilización de fosfatos

8. ¿Por qué el fósforo es muy insoluble?
9. ¿Qué mecanismos utilizan los microorganismos para solubilizar este
elemento?
Bibliografía
 Chen, Y., Rekha, P., Arun, A., Shen, F., Lai, W. y Young, C. 2006. Phosphate
solubilizing bacteria from subtropical soil and their tricalcium phosphate solubilizing
abilities Applied Soil Ecolofy 34: 33-41.
 Salazar, J. 2005. El fósforo en los sistemas ganaderos de leche. Agronomía
Mesoamericana. 16:231-238.
 Beltrán, M. 2014. La solubilización de fosfatos como estrategia microbiana para
promover el crecimiento vegetal. Corpoica Cienc. Tecnol. Agropecu. 15(1): 101-113.
 Laboratorio del Recurso Microbiano, Protocolo: Solubilización de Fosfatos.
 Patiño, C. 2010. Solubilización de Fosfatos por Poblaciones Bacterianas Aisladas
de un suelo del Valle de Cauca. Estudio de Biodiveridad y Eficiencia. Universidad
Nacional de Colombia
Práctica 6. Curva de crecimiento
Objetivo
o  Conocer la técnica de cuantificación directa por cámara de Neubauer e

indirecta.
 Conocer las fases de la curva de crecimiento de un microorganismo.
La cinética decrecimiento microbiano es una de las actividades más utilizadas en microbiología
y algunas especialidades, es muy importante conocer las diferentes mecanismos de crecimiento
así como la cuantificación. El crecimiento se define como un incremento en el número de células
de una población microbiana o crecimiento celular.
El crecimiento y viabilidad de los microorganismos está determinado por varios factores

nutricionales y ambientales (T, pH, oxigeno) los cuales son esenciales en las 4 etapas de
desarrollo de los microorganismos, estas consisten en fase de latencia, exponencial,
estacionaria y de muerte.
Fase de latencia: Cuando los microorganismos son introducidos en medios de cultivo frescos,
usualmente, no inmediatamente, ocurre en incremento de células. Este intervalo puede ser breve
o extenso, dependiendo en la historia del cultivo y en las condiciones de crecimiento. Si un cultivo
de crecimiento exponencial es transferido al mismo medio bajo las mismas condiciones de
crecimiento, una adaptación no ocurre y crecimiento exponencial comienza inmediatamente.
Fase exponencial: durante esta fase de crecimiento cada célula se divide para formar dos
células, las cuales cada una se divide en otras dos células y así sucesivamente, por un breve o
largo periodo, dependiendo en las fuentes disponibles y otros factores. Las células en crecimiento
exponencial usualmente están en su estado más saludable. Por lo tanto, células en fase
exponencial media están frecuentemente usadas para estudios de enzimas u otros componentes.
Fase estacionaria: en un cultivo discontinuo, como un tubo o un matraz, el crecimiento de la

población eventualmente cesa y la curva de crecimiento se convierte horizontal. Esta fase
estacionaria usualmente es alcanzada por bacterias a un nivel de población alrededor de 109
células por ml. Otros microorganismos normalmente no alcanzan dicha densidad de población.
Fase de muerte: Si la incubación continúa después que una población alcanza la fase
estacionaria, las células pueden permanecer vivas y continuar metabolizando, pero
eventualmente morirán. Cuando esto ocurre, la población entra a la fase de muerte del ciclo de
crecimiento. En algunos casos la muerte es acompañada de lisis celular.
Figura 19. Curva de crecimiento bacteriano
Las fases de crecimiento son reflexiones de eventos en una población de células, no en células
individuales.
o Materiales:
- 10 pipetas de 1mL estériles - 1 Matraz con 20 mL de cultivo
- 6 tubos con 9 mL de Agua bacteriano
destilada esteril - Mechero
- Microscopio
- 2 Matraces Erlenmeyer de 250 mL
- Camara de Neubauer
con 100 mL de caldo nutritivo
Procedimiento
Conteo en cámara de Neubauer
1. La cámara de Neubauer debe de estar completamente
limpia, se coloca el cubre objetos.
2. Se toma una alícuota con una pipeta Pasteur de punta
fina y se deposita una gota entre la cámara y el
cubreobjetos. Se trata de dejar que el líquido penetre
entre la cámara y el cubreobjetos desde el lateral, por
capilaridad (Figura 20).
Figura 20. Cámara de
3. En caso de que aparezcan burbujas, el cubreobjetos se
Neubauer.
haya movido o algo no haya salido bien, repetir la
operación
4. Dejar reposar por 5 minutos, colocar la cámara en la platina del microscopio y buscar el
primer cuadro donde vaya a realizarse el recuento.
5. Hacer la cuantificación de células con el objetivo seco fuerte (40x) contando el número
de células que se encuentran en los 5 cuadros grandes que se muestran en la figura 21.
6. Si las células tocan los límites de los cuadros, deberán contarse solamente aquellas que
toquen la parte superior y el lado derecho del cuadro. Si las células tocan la parte inferior
o el lado derecho no se cuenta. Esté método reduce las posibilidades de contar la misma
célula dos veces (Figura 22).
Figura 21. Figura 22.

Recuento de 5 cuadros Conteo de un cuadro
grandes de cámara de grande de cámara de
Neubauer Neubauer.
7. Se aplica la fórmula de cálculo de concentración celular
Número de células
Concentración =
Volumen (en ml)
El número de células es la suma de todas las células contadas en todos los cuadros.
El volumen es el volumen total de todos los cuadros donde se ha realizado hecho el recuento.
Como el volumen de 1 cuadro grande es:
0,1 cm x 0,1 cm = 0,01 cm2 de superficie

0,01 cm2 * 0,1 mm (profundidad) = 0,01 cm2 * 0,01 cm = 0,0001 cm3 = 0,0001 ml
La fórmula para recuento con cuadros grandes en cámara de Neubauer es
Número de células x 10 000

Concentración =
Numero de cuadros
8. En el caso de que el número de células sea muy grande, la suspensión deberá diluirse y
se hará la corrección como sigue:
Número de células x 10 000
Concentración =
Numero de cuadros x dilución
Cinética de crecimiento
1. Inocular en condiciones estériles un matraz de 250 mL con 100 mL de medio de cultivo

(caldo nutritivo) con 10 ml de muestra E. coli.
2. Homogenizar cuidadosamente agitando el matraz e inmediatamente tomar una muestra y
colocar en la cámara de Neubauer, para realizar el conteo (t=0), de la misma manera se
tomaran muestras a las 0.5, 1, 2, 3, 4 y 6 horas.
3. Colocar el cultivo en baño maría con agitación (150 rpm) a 35 °C.
Resultados
1. Clocar los resultados del conteo en la tabla y graficarlos.
Cuadro 6. Resultado de mediciones del crecimiento de E. coli en un cultivo por lote
Tiempo de Cuenta en la cámara

muestreo (h) de Neubauer (número
de células totales/mL)
0.5
Cuestionario
1. ¿Qué tipos de conteo celular existen y cuáles son los más utilizados?
o
2. Menciona dos ejemplos de aplicaciones en donde se utilice cada una de las
técnicas de cuantificación.
3. Define el crecimiento microbiano y que ocurre en cada una de las etapas de
desarrollo.
4. Qué condiciones ambientales causarán una disminución o eliminación en la fase
la en la curva de crecimiento ¿Qué condiciones la incrementan?
Bibliografía
Metropolitana.
 L. Pepper, Charles P. Gerba, Terry Gentry and Raina M. Maier. (2009).
Environmental Sample Collection and Processing. En Environmental Microbiology
(174,175,176,177). Tucson, Arizona: ELSEVIER.
Práctica 7. Impacto de condiciones de estrés
abiótico sobre microorganismos
Objetivo
o  Adquirir conocimientos sobre el estrés abiótico en microorganismos, con un

énfasis particular en tres tipos de estrés (térmico, fungicida y salino), estudiando
a la vez las reacciones que estos presenten al estar sometidos a estos distintos
tipos de estrés.
Entre los aspectos más limitantes para las poblaciones microbianas figuran los factores abióticos,
que son aquellos que determinan el espacio físico en el que estos se desarrollan. El agua, la
temperatura, la luz, la salinidad, el pH y los nutrientes del suelo constituyen estos
importantes factores que limitan la superficie de tierra y las especies que pueden desarrollarse
en cada región. Estos factores son tan básicos para el desarrollo de los microorganismos que su
ausencia, exceso y/o variaciones respecto al nivel óptimo (como es el caso de la falta y el exceso
de agua por sequías e inundaciones o los cambios de temperatura) pueden causar graves
alteraciones en su crecimiento y reproducción, es decir un estrés que, al estar causado por los
factores ambientales, denominamos “estrés abiótico”.
El estrés se identifica como una desviación significativa de las condiciones óptimas para la vida.
Dichas condiciones ocasionan cambios en todo los niveles funcionales de los organismos. Desde
un punto de vista biológico, el estrés tiene una connotación más amplia, refiriéndose a los
cambios ambientales que alteran al estado fisiológico de los microorganismos (Larcher, 1995).
Se define la resistencia al estrés como la capacidad de un organismo para resistir, evitar y
escapar a los estímulos ambientales negativos o poder permanecer bajo un estado particular de
estrés sin que su fenotipo se vea modificado de manera significativa.
En esta práctica los microorganismos serán sometidos a distintas pruebas de estrés abiótico.
Las pruebas se realizaran utilizando específicamente tres tipos de estrés: térmico, salino y al
fungicida, con el fin de monitorear y estudiar las reacciones de cada una de las cepas
previamente aisladas.
o Materiales:
- Mechero - Gasas y algodón
- Báscula - Masking tape
- Espátula - 1 Pipeta de 10 mL
- Perilla
- 2 Matraz Erlenmeyer de 500mL
- Guantes
- 20 Cajas Petri
Reactivos:
o
- Agar nutritivo - Sal de mesa
- Fungicida
Procedimiento
Estrés Fungicida.
1. Preparar Agar Nutritivo de la manera convencional. La cantidad de Agar Nutritivo será en
base a la cantidad de cajas Petri a utilizar.
2. Esterilizar el Agar Nutritivo SIN FUNGICIDA.
3. Una vez concluido el ciclo de la autoclave, dejar enfriar el Agar
Nutritivo hasta que este sea manejable.
NOTA. Es importante que no se enfrié demasiado, ya que de lo
contrario al agregar el fungicida la mezcla no se homogenizara.
4. La concentración de fungicida utilizada es de 5.4 gr/L de Agar
Nutritivo.
5. Adaptar la dosis de fungicida a la cantidad de Agar Nutritivo que se
utilizara.
6. Con una pipeta medir la dosis de fungicida adaptada y agregar al Figura 23. Siembra por
Agar Nutritivo previamente esterilizado, todo esto en condiciones picadura para pruebas de
totalmente asépticas. estrés
NOTA. Si el Agar Nutritivo ya no está lo suficientemente caliente es
necesario calentarlo un poco antes de aplicar el fungicida.
7. Homogeneizar perfectamente la mezcla de Agar Nutritivo con fungicida.
8. De inmediato comenzar a vaciar el medio en las cajas Petri, todo en condiciones
totalmente asépticas.
9. Dejar solidificar perfectamente las cajas de medio con fungicida.
10. Dejar incubar las cajas durante 24 horas a 28 °C para comprobar su esterilidad.
NOTA. Este paso podría ser opcional.
 Es importante que tomes las medidas de seguridad que se indican en la botella del
fungicida al pie de la letra, ya que este es altamente tóxico y es necesario manejarlo
con precaución.
 El Agar Nutritivo debe ser esterilizado antes de aplicar el fungicida ya que este podría
liberar algunos gases altamente tóxicos o bien, reducir su eficacia.
11. Una vez concluida la prueba de esterilidad pasar a inocular por picadura simple (Figura.
22) cada uno de los microorganismos que serán sometidos al estrés.
12. Dejar incubar las cajas inoculadas durante 7 días 28 °C.
NOTA. Monitorear el crecimiento de los microorganismos cada dos días.
13. Transcurridos los 7 días identificar los microorganismos que presentaron crecimiento y/o
alguna característica particular (cambio de color en el medio, cambio de color de la
colonia, degradación de algún tipo en el medio, etc.).
14. Inocular una caja de Agar Nutritivo con los microorganismos que fueron sometidos al
estrés, incubarla a 28 °C durante el mismo periodo de tiempo para utilizarla como un
control de crecimiento.
Estrés Salino.
1. Preparar Agar Nutritivo de la manera convencional, la cantidad será en base a las cajas
Petri a utilizar.
2. La concentración de Cloruro de Sodio utilizada es de 30% equivalente a 40.8 dS/m.
3. Adaptar la dosis de Cloruro de Sodio a la cantidad de Agar Nutritivo que se utilizara.
4. Aplicar la dosis adaptada de Cloruro de Sodio al Agar Nutritivo y homogeneizar
perfectamente la mezcla.
5. Esterilizar el medio salino.
6. Una vez concluido el ciclo de la autoclave, dejar enfriar el medio salino hasta que este
sea manejable.
7. Comenzar a vaciar el medio en las cajas Petri, todo en condiciones totalmente asépticas.
8. Dejar solidificar perfectamente las cajas de medio salino.
11. Dejar incubar las cajas inoculadas durante 7 días A 28 °C.
Estrés Térmico.
1. Preparar Agar Nutritivo de manera convencional, la cantidad será en base a las cajas
Petri a utilizar.
2. Esterilizar el medio de Agar Nutritivo.
3. Una vez concluido el ciclo de la autoclave, dejar enfriar el medio hasta que este sea
manejable.
4. Comenzar a vaciar el medio en las cajas Petri, todo en condiciones totalmente
asépticas.
5. Dejar solidificar perfectamente las cajas de medio.
8. Dejar incubar las cajas inoculadas durante 7 días a una temperatura de 32 °C.
 Intentar inocular la misma cantidad de biomasa en el control y en a prueba de estrés

para que pueda ser comparable.
Cuestionario
o 1. Menciona 6 factores abióticos

2. ¿Qué es estrés abiótico?
3. ¿Por qué es importante conocer el impacto de los factores abióticos en los
microorganismos?
4. ¿Qué actividades humanas alteran drásticamente las condiciones abióticas de
los ecosistemas?
5. Mencionas 3 consecuencias que repercutirían en los ecosistemas si las
poblaciones microbianas fueran afectadas por los cambios drásticos de
salinidad, temperatura o pesticidas.
6. ¿Consideras que es bueno que un microorganismo presente una resistencia
considerable al estrés abiótico? ¿Por qué?
Bibliografía

de Biología.
Madrid España.
 Garcia, M. M ; 2016. Assessment of abiotic stress on microorganisms isolated from
the Yaqui Valley
 Alvarez P, Garcia S 2012. Selección y evaluación de microorganismos
solubilizadores de fosfatos en suelos calcáreos del Valle del Mantaro.
http://repositorio. educacionsuperior.gob.ec/bitstream/28000/260/1/T-SENESCYT-
0029(1).pdf (accessed 26 July 2016).
 Ashour EK, Al-Najar H. 2012. The Impact of Climate Change and Soil Salinity in
irrigation Water Demand in the Gaza Strip. Earth Science & Climatic Change. 3:2.
 Channabasava, Laskhman HC and Jorquera MA. 2015. Effects of fungicides on
association of arbuscular mycorrhiza fungus Rhizophangus fasciculatus and growth
of Proso millet (Panicum miliaceum L.).Journal of Soil Science and Plant Nutrition.
15(1): 35-45.
Práctica 8. Preparación de medio para producción
de sideróforos de microorganismos aislados del suelo
Objetivo
o  Conocer el fundamento de la preparación del medio para producción de

siderófos(cómo es que se lleva a cabo la reacción en el medio) y la elaboración del
medio.
 Evaluar la producción de sideróforos de cada uno de los microorganismos aislados
y hacer una comparación entre los resultados positivos, para así ubicar a los
mayores productores
El hierro es un elemento vital requerido por todos los organismos vivos por muchos procesos
celulares como la cadena transportadora de electrones y como un cofactor para muchas
enzimas. Los microorganismos que crecen bajo condiciones aeróbicas necesitan hierro para una
variedad de funciones incluyendo la reducción de oxígeno para la síntesis de ATP, para la
formación de hemo y otros propósitos esenciales.
La atmósfera del planeta ha causado que la superficie de hierro se haya oxidado a polímero
oxhidróxido insoluble y reducido el nivel de hierro libre, por lo tanto algunos microorganismos
adoptaron una manera para la adquisición de hierro produciendo una molécula quelante de
hierro. Los sideróforos son compuestos quelantes de hierro con bajo peso molecular (< 10 KD)
sintetizados por muchas bacterias Pseudomonas, Azotobacter, Bacillus, Enterobacter, Serratia,
Azospirillum y Rhizobium, en grandes cantidades bajo condiciones limitadas de hierro. El
sideróforo forma complejos con hierro libre y lo transporta a la célula por la membrana receptora
de moléculas, estas moléculas son codificadas por cinco genes en operón el cual es apagado
cuando suficiente hierro ha sido tomado por la célula.
Algunas bacterias producen uno o más sideróforos los cuales pueden ser utilizados por otros
microorganismos para el hierro u otros metales de adquisición. Esta propiedad de los sideróforos
incrementa su aplicación, además los sideróforos han estado relacionados con mecanismos de
virulencia en microorganismos patógenos en animales y plantas. Adicionalmente tienen
aplicaciones en campos clínicos, agrícolas y ambientales. Actualmente casi 500 sideróforos son
reportados de microorganismos seleccionados. Se nota una variación en la estructura de los
sideróforos de una especie a otra. Los principales tipos de sideróforos son conocidos como
hidroxamato, catecolato y carboxilato.
Procedimiento
Etapa 1. Preparación de la solución 1, solución 2, solución 3 y
solución 4 para medio cas.
NOTA. Es muy importante que las cantidades de esta solución sean SUMAMENTE
EXACTAS, de lo contraro no se dará la reacción en el medio.
SOLUCIÓN 1
Materiales:
 72.8 mg de HDTMA
 60.5 mg de CAS
 1 ml de HCl 0.1 M
 27 mg de FeCl3
 Agua destilada
1. Preparar:
a. 72.8 mg de HDTMA en 40 ml de agua destilada.
b. 60.5 mg de CAS en 50 ml de agua destilada.
c. 1 ml de HCl 0.1 M en 9 ml de agua destilada.
2. Agregar los 27 mg de FeCl3 a la mezcla de HCl + Agua destilada.
3. Agregar a la mezcla anterior (FeCl3 – HCl + Agua destilada) la mezcla de CAS + Agua
destilada.
4. Agregar LENTAMENTE Y AGITANDO esta nueva mezcla (FeCl3 – HCl + CAS) a la
mezcla de HDTMA + Agua destilada.
5. Esterilizar la mezcla final (SOLUCIÓN 1) en autoclave (15 min. a 121 ° C).
NOTA. Todos los reactivos de la Solución 1 deben ser preparados en fresco

(justo antes de usar).
SOLUCIÓN 2
Materiales:
 30.24 g de PIPES
 75 ml de “Stock de Sales Sideróforos Solución 2”
 15 g de Agar-Agar.
1. Preparar el Stock de Sales antes de comenzar con el procedimiento de la solución 2

(Cuadro 6).
Cuadro 6. Preparación de “Stock Sales Sideróforos” Sln.2 750 mL

Reactivo Cantidad
KH2PO4 3g
NaCl 5g
NH4Cl 10 g
H2O Aforar a 750 mL
2. Diluir 75 ml de “Stock Sales Sideróforos Sln. 2” en 675 ml de Agua destilada.

3. Agregar 30.24 g de PIPES a esta mezcla (Stock de Sales + Agua destilada).
4. Ajustar pH a 6.8
NOTA. El ajuste de pH debe ser EXACTO para que pueda darse la reacción del medio.
5. Agregar 15 g de Agar y aforar a 800 ml.
6. Calentar en agitación y esterilizar en autoclave (15 min. a 121°C).
SOLUCIÓN 3
Materiales:
 493 mg de MgSO4 7H2O

 2 g de Manitol
 7 ml de “Stock Sideróforos Solución 3”
 2 g de glucosa
1. Preparar el Stock de Sales antes de comenzar con el procedimiento de la solución 3

(Cuadro 7).
Cuadro 7. Preparación de “Stock Sales Sideróforos” Sln.3 750 mL

Reactivo Cantidad
CaCl2 550 mg
MnSO4 H2O 59 mg
H3BO3 70 mg
ZnSO4 7H2O 60 mg
Na2MoO4 2H2O 50 mg
CuSO4 5H2O (de solución CuSO4
3.5 mL
1000x)
H2O 346.5 mL
2. Diluir 7 ml de “Stock Sales Sideróforos Sln. 3” en 63 ml de Agua destilada.

3. Agregar los 493 mg de MgSO4 7H2O a la mezcla (Stock de Sales + Agua destilada).
4. Agregar 2 g de Manitol.
5. Agregar 2 g de Glucosa.
6. Homogeneizar perfectamente y esterilizar en autoclave (15 min. a 121°C).
SOLUCIÓN 4
Materiales:
 3 g de “Casamino-acids”
1. Disolver 3g de “Casamino-acids” en 30 mL de H2Od.
NOTA. No esterilizar esta solución.
Etapa 2. Preparación de medio CAS
1. Bajo condiciones estériles agregar la Solución 3 (70 mL) a la

Solución 2 (800 mL).
2. Posteriormente, agregar la Solución 4 (30 mL de “Casamino-
acids”) esterilizando por filtración utilizando un acrodisco y una
jeringa estéril (Figura 24). Figura 24. Esterilización por
acrodisco y jeringa.
3. Por último, agregar la Solución 1 (100 mL), mezclando cuidadosamente para evitar la
formación de burbujas.
4. Vaciar en cajas Petri y dejar solidificar (hasta que estén a temperatura ambiente) evitando
condensación en las tapas.
5. Inocular por picadura las cepas correspondientes, incubar 28°C durante 7 días.
Considerando como positivo donde se observó una zona clara alrededor de la colonia
(Figura 25)
 Es necesario que las soluciones no se enfríen demasiado. Dejarlas enfriar hasta que
lleguen a una temperatura manejable (la temperatura más alta que puedas tolerar).
 La Solución 4 debe ser filtrada lentamente para asegurar de que la filtración sea
efectiva.
 Es sumamente importante que la etapa 2 de la preparación del medio se realice lo más
rápido posible, ya que este medio comienza a solidificarse rápidamente y una vez
solidificado no puede ser calentado nuevamente.
Figura 25. Pruebas de producción de sideróforos en bacterias en medio CAS.
Cuestionario
o 1. ¿De dónde vienen las siglas CAS?

2. ¿Cuál es la reacción positiva a producción de sideróforos en este medio?
3. ¿Por qué se lleva a cabo la reacción en este medio (cuál es el fundamento de la
reacción)?
4. ¿Por qué la Solución 4 no puede ser esterilizada en la autoclave?
6. ¿Consideras que es bueno que un microorganismo produzca gran cantidad de
sideróforos? ¿Por qué?
Bibliografía

de Biología.
Madrid España.
 Ali SS, Vidhale NN. 2013. Bacterial Siderophore and their Application: A review.
International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 2(12):303-312
Práctica 9. Caracterización molecular de
microorganismos
Objetivo
o  Que el alumno realice la técnica de PCR en bacterias y hongos, y

compare las técnicas clásicas de caracterización con las técnicas
moleculares.
Los microorganismos juegan un rol muy importante para el humano dado que son benéficos para
su salud o economía (vg. Probióticos, fijadores de nitrógeno, promotores de crecimiento vegetal,
etc.) o bien patógenos para el humano, animales y plantas económicamente importantes. Dado
lo anterior se han desarrollado una serie de metodologías para poder diferenciar un
microorganismo de otro, y para poderlos identificar.
Estas metodologías se han basado tradicionalmente en la observación macro o microscópica del

microorganismo, del desarrollo del microorganismo en un medio de cultivo especifico, de la
tinción producida al aplicar algunos colorantes. Estas metodologías son buenas en algunos
casos pero deficientes en otros, por lo que en las últimas tres décadas se han desarrollado
técnicas moleculares de detección e identificación de microorganismos las cuales se basan en
el análisis de los ácidos nucleicos extraídos de los microorganismos en forma directa o bien de
una muestra conteniendo el microorganismo en cuestión (Rodríguez, et al. 2009).
Un ejemplo es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esta es la técnica más utilizada

para la detección de microorganismos, se basa principalmente en realizar millones de copias de
un segmento de ADN específico. En esta técnica la cadena doble de ADN es separada en dos
cadenas sencillas sometiéndola a temperaturas mayores a 92 °C, después se hibridiza en
dos pequeños segmentos de ADN complementarios, uno a una cadena y el otro a la otra. Estos
pequeños segmentos son llamados iniciadores, una vez que los iniciadores están unidos a las
cadenas complementarias se adiciona a la reacción una ADN polimerasa la cual va a formar la
nueva cadena tomando como bases la cadena sencilla y uno de los extremos del iniciador.
Después de este primer ciclo, si se partió de una sola cadena doble de ADN se tendrían dos
cadenas dobles. Esta amplificación se incrementa en forma geométrica a medida que se repite
el número de ciclos, así después de dos ciclos tendríamos cuatro cadenas dobles de ADN, y
después de tres, ocho y así sucesivamente, después de treinta ciclos tendríamos una gran
cantidad de ADN amplificado para ser visualizado a simple vista (Rodríguez et al. 2009) (Figura
26).
Figura 26. Reacción en cadena de la polimerasa
Materiales:
o
- 3 tubos Eppendorff de 1.5 mL - Vortex
- 1 micropipeta de 1000 uL - Termociclador
- Puntas previamente esterilizadas - Centrifugadora
Reactivos:
o
- Buffer de extracción - Agua MQ
- Buffer de reacción - Primer F
- Cloroformo - Primer R
- Isopropanol - Taq Polimerasa
- Etanol al 70%
Procedimiento
Extracción de ADN Hongos y Bacterias (Raeder & Broda, 1985 modificado)
1. Colocar 100 mg de biomasa en un tubo eppendorff de 1.5 mL
2. Agregar 500 µL de buffer de extracción (200 mMol Tris HCl pH 8.0, 250 mM NaCl, 25
mMol EDTA, 0.5% SDS).
3. Re suspender el pellet celular, mezclando bien en vortex durante 5 min.
4. Añadir 350 µL de fenol (4 °C) y mezclar bien en vortex a velocidad máxima durante 30
segundos.
5. Añadir 150 µL de cloroformo y mezclar bien en vortex a velocidad máxima durante 30
segundos.
6. La suspensión obtenida se centrifuga durante 30 min a 13000 rpm a 4°C.
7. Tomar la fase acuosa y transferirla a un tubo eppendorff de 1.5 mL.
8. Agregar 1 volumen de cloroformo y mezclar en vortex durante 30 s.
9. Posteriormente, la mezcla se centrifuga por 10 min a 13, 000 rpm
10. La fase acuosa (400 µL aprox.) se transfiere a un tubo eppendorff
de 1.5 mL y se agregan 0.6 volúmenes de isopropanol (500 µL
aprox).
11. Homogenizar la mezcla por inversión (10 veces) y centrifugar por 5
min a 13, 000 rpm.
12. Descartar el sobrenadante.
13. Lavar el pellet obtenido con 500 µL de etanol al 70%, re- Figura 27.
suspender el pellet con pequeños golpecitos con el dedo. Pellet se refiere a pequeñas
Centrifugar a 13 000 g por 2 min a 4°C. Descartar el porciones de material aglomerado
sobrenadante. Repetir este paso 2 veces. o comprimido (biomasa).
14. Secar el pellet celular y re-suspender en 40-70 µL de H2O MQ
15. Guardar a -20 °C.
Amplificación de gen 16 S ribosomal de bacteria mediante PCR
1. Agregar los siguientes reactivos en un tubo eppendorff de 1.5 mL (mix de reacción)
Reactivo 1 Reacción
Buffer de reacción 4 µL
Primer F 0.4 µL
Primer R 0.4 µL
Taq polimerasa (MyTaq Bioline) 0.2 µL
ADN 2 µL
H2O MQ 13 µL
Volumen final 20 µL
2. Programa de amplificación:
Paso Temperatura/Tiempo No. Ciclos

Desnaturalización inicial 95 °C / 2 min 1
Desnaturalización 94 °C / 1 min
Alineamiento 55 °C / 1 min 35
Elongación 72 °C / 2 min
Elongación final 72 °C / 6 min 1
Mantenimiento 15 °C ∞ 1
ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLÉICOS EN GEL DE AGAROSA
1. Preparar gel de agarosa-TAE 1%

a. Pesar 0.3 g de agarosa y diluir en 30 mL de Buffer de corrida TAE 1X
b. Fundir en placa de calentamiento
c. Preparar cámara de electroforesis y portagel
d. Una vez enfriado, agregar 0.75 µL de intercalante Gelred, mezclar
e. Verter sobre portagel, colocar los peines, evitar formación de burbujas,
esperar a que polimerice (color blanquecino)
2. Remover los peines y sellos del portagel, pasar el portagel a la cámara de
electroforesis (el buffer de corrida TAE 1X, debe de cubrir totalmente el gel)
3. Tomar 5 µL de ADN y mezclar con 1 µL de buffer de carga
4. Cargar las muestras en el gel de electroforesis
5. Tapar la cámara de electroforesis
6. Correr las muestras de ADN a 80 V durante 30 min.
7. Visualizar los fragmentos de ADN en fotodocumentador.
8. Interpretar resultados
Bibliografía
 Rodríguez-Herrera, R., Aguilar-González, C.N., Ayala-Labarrios, L. A., Rocha-

Revilla, J. C., Padilla-García, V. y Espinosa-Hernández, T. C. 2009. Detección de
Microorganismos mediante Métodos Moleculares. Acta Química Mexicana
[Internet]. 1(1). Available from:
http://www.postgradoeinvestigacion.uadec.mx/AQM/AQMmicroorganismos.html
Práctica 10. Análisis bioinformática de secuencias
de origen microbiano
Objetivo
o  Conocer los conceptos básicos de Bioinformática.

 Utilizar las tecnologías bioinformáticas que más se utilicen para el
análisis de secuencias de ADN.
 Aprender a realizar técnicas básicas de identificación molecular de
microorganismos desde un análisis de secuencias/edición, comparación
de la secuencia y alineamiento múltiple.
 Conocer el procedimiento para la realización de un árbol filogenético.
Las enormes cantidades de datos biológicos y crecientes demandas de la investigación

biológica moderna exigen cada vez más la sofisticación y computación potente de las
tecnologías de la información (TI). Se puededefinir la Bioinformática como la aplicación de
tecnología informática para la gestión y el análisis de datos biológicos. Las tareas más
importantes en la bioinformática son entender las correlaciones, las estructuras y los patrones
en los datos biológicos. La información y el conocimiento de estas disciplinas se pueden
utilizar de modo inteligente para aplicaciones que cubran el descubrimiento de fármacos,
análisis del genoma y control biológico; esto implica el uso de tecnologías informáticas y
métodos estadísticos para manejar y analizar un gran volumen de datos biológicos sobre el
DNA, el RNA y las secuencias de proteínas, estructuras de las proteínas, los perfiles de
expresión genética y las interacciones de la proteína.
La bioinformática abarca el desarrollo de bases de datos para almacenar y recuperar datos

biológicos, los algoritmos para analizar y determinar las relaciones de datos biológicos, y las
herramientas estadísticas para identificar e interpretar el conjunto datos. El objetivo de la
bioinformática es presentar una representación completa de un organismo, para lo cual es
necesario un avance computacional que prediga sistemas de gran complejidad, tales como
los procesos de interacción celular de todo el organismo. En consecuencia, existe una
necesidad obvia de suministrar a los estudiantes de bio-ciencias de ciertas habilidades
bioinformáticas genéricas que les permitan adquirir competencias básicas en el tema. Por esta
razón, se diseñó esta práctica de laboratorio. Para que los estudiantes pudieran relacionarse
con el concepto básico de la bioinformática y con las técnicas básicas de identificación
molecular de microorganismos.
Antes de iniciar la práctica se revisaran algunos conceptos fundamentales en el proceso de

la identificación molecular de microorganismos.
ELECTROFEROGRAMA
Un electroferograma es el gráfico que arroja el secuenciador después de analizar la
electroforesis (Figura 28).
Secuencia de bases Calidad de la base
Señal de cada nucleótido
Figura 28. Ejemplo de Electroferograma y sus componentes
Interpretación de electroferogramas
Éste, muestra el orden de las bases a partir de curvas de Secuenciación de fragmentos de

ADN 241 fluorescencia, una por cada base, y se puede visualizar en programas como FinchTV,
Chromas y BioEdit que se obtienen de manera gratuita en internet. Es importante revisar los
electroferogramas antes de continuar con los análisis de la muestra debido a que brindandan
mucha información, incluyendo la calidad de la PCR y por ende la confiabilidad de los datos
obtenidos (Figura 29).
Figura 29. Interpretación de electroferogramas. A) Secuencia buena calidad; B) Contaminación de

otra secuencia de DNA, C) Secuencia de baja calidad, baja señal
BASES DE DATOS BIOLOGICAS
Las bases de datos más relevantes en biología incluyen pares de bases de nucleótidos,
proteínas, estructura de proteínas, genomas, expresión genética, taxonomía, metabolismo,
factores de transcripción, etc.
Entre las principales bases de datos de secuencias de nucleótidos se encuentran: NCBI,
EMBL, DDBJ, etc.
En esta práctica se utilizará la base de datos de NCBI(Figura 30):
Figura 30. Plataforma NCBI
El NCBI ofrece además algunas herramientas bioinformáticas para el análisis de secuencias

de DNA, RNA y proteínas, siendo BLAST una de las más usadas. NCBI alberga genoma
secuenciado en GenBank, y un índice de los artículos biomédicos de investigación en PubMed
Central y PubMed, así como otra información relevante a la biotecnología.
FORMATO DE SCUENCIAS
Secuencia en texto plano
Los más comunes utilizan algún tipo de fichero de texto. Si únicamente se guardará la
secuencia, se puede crear un fichero de texto y simplemente escribir la secuencia. El fichero
sólo puede contener caracteres IUPAC para secuencia y espacios, los números no están
permitidos. Este formato tiene algunas limitaciones, no puede haber más que una secuencia
dentro del fichero y no puede incluirse el nombre de la secuencia dentro del fichero.
Formato FASTA
La secuencia comienza con un nombre y una descripción. Esta línea se distingue porque
siempre comienza con el signo ‘>’. A continuación sigue la secuencia propiamente dicha con
el formato en texto plano. Pueden incluirse varias secuencias en un mismo fichero. Es un
formato muy utilizado.
Ejemplo.
>nombre_secuencia2 descripción
ACAAGATGCCATTGTCCCCCGGCCTCCTGCTGCTGCTGCTCTCCGGGGCCACGGCCAC
CGCTGCCCTGCCCCTGGAGGGTGGCCCCACCGGCCGAGACAGCGAGCATATGCAGGA
AGCGGCAGGA
BUSQUEDA DE SECUENCIAS EN BASES DE DATOS
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)

BLAST se utiliza habitualmente para comparar una secuencia dada contra toda una base de
datos de millones de secuencias. Producen alineamientos locales entre cada pareja de
secuencias, utilizando un algoritmo muy rápido basado en palabras (word, k-tuple o kmers).
Además generan un valor se significación estadística para cada alineamiento.
E-value
Una vez obtenido el alineamiento hay que preguntarse si es significativo. El alineamiento
obtenido entre dos secuencias seleccionadas al azar.
¿Cuál es la probabilidad de que un alineamiento con una puntuación (score) similar se
obtenga por azar entre dos secuencias no relacionadas?
El e-value (Expect) es un parámetro que describe el número de hit que se puede esperar que
ocurran por casualidad cuando se busca una base de datos de un tamaño determinado.
Disminuye exponencialmente a medida que la puntuación de (S, Score) de los match aumenta.
En esencia, el valor E describe el ruido de fondo aleatorio. Por ejemplo, un valor de E de 1
asignado a un hit puede ser interpretado en el sentido de que, en una base de datos del
tamaño actual se podría esperar ver 1 match con un resultado parecido, simplemente por azar.
Cuanto menor sea el valor E, o cuanto más cerca está a cero, más significativo es el match.
Sin embargo, tenga en cuenta que las alineaciones cortos prácticamente idénticos tienen
valores relativamente altos E. Esto es porque el cálculo del valor E tiene en cuenta la longitud
de la secuencia de consulta. Estos altos valores de E tiene sentido porque las secuencias más
cortas tienen una mayor probabilidad de ocurrir en la base de datos por pura casualidad.
ANALISIS DE SECUENCIAS
Normalmente dos secuencias tienen una alta similitud porque comparten un ancestro común.
A diferencia de la similitud, la homología no es un término cuantitativo, dos secuencias o son
homólogas, derivan del mismo ancestro, o no lo son.
La acumulación de mutaciones en el ADN a lo largo del tiempo es la causa de que las
secuencias de un mismo gen en dos especies distintas no sean idénticas. Cuanto más tiempo
pase desde el último antecesor común más diferente serán las secuencias.
En las secuencias, además de sustituciones de un residuo por otro pueden darse inserciones
o deleciones.
Alineamiento de secuencias
Para poder cuantificar el grado de similitud de dos secuencias lo primero que hay que hacer
es alinearlas.
• Asegurarse de que dos secuencias son similares y cuantificar su similitud.

• Encontrar dominios funcionales.
• Comparar un gen y su producto.
• Buscar posiciones homólogas en las secuencias.
• Una sustitución es un cambio de un residuo por otro.
• Cuando falta una base decimos que hay un gap.
• Un gap puede corresponder tanto a una deleción como a una inserción.
• Pueden existir diferentes alineamientos dependiendo del número de gaps que
permitamos introducir.
Sin alinear Alineadas
El alineamiento con mejor puntuación debería ser el más razonable desde un punto de vista
biológico, el que alinea más posiciones homólogas. Para comparar distintos alineamientos
entre sí se pueden asignar puntuaciones.
Ejemplos de sistemas de puntuación:
• Número de letras que coinciden

• Porcentaje de identidad, número de coincidencias cada cien posiciones.
• Porcentaje de similitud, tiene en cuenta la similitud fisicoquímica de los diferentes
aminoácidos.
En la práctica se suelen utilizar sistemas de puntuación más complejos que también tienen en
cuenta los gaps. Se suelen incluir dos penalizaciones para los gaps, una para abrir el gap y
otra para extenderlo. Este último suele ser menos costoso.
De entre todos los alineamientos posibles el óptimo es el que presenta una máxima
puntuación para el sistema de puntuación dado.
Procedimiento
o Para la realización de esta práctica será necesario que tu computadora tenga acceso a
internet.
Análisis de secuencias/edición
1. Para poder realizar el análisis de tu electroferograma será necesario que descargues

el programa gratuito “FinchTV”.
2. Abre el programa FinchTV y carga el electroferograma que proporcione tu facilitador.
3. La siguiente parte es la edición. Esta depende mucho del criterio de cada persona,
pero el objetivo principal de dicha edición es revisar cada una de las bases para así
detectar errores y poder corregirlos o eliminarlos.
4. Generalmente todos los electroferogramas tienden a tener una mala calidad en las
primeras bases, es por esto que se recomienda eliminarlas.
5. Seleccionar la secuencia nucleotídica de baja calidad, generalmente son los extremos.
6. click derecho y seleccionar la opción “Delete”.
7. De inmediato notaras que las bases han sido eliminadas y podrás continuar con el
procedimiento.
8. Ahora debes revisar base por base la calidad de los picos de la señal. Debes cuidar
detalles como: que el pico de la señal este definido, que el pico más alto de la señal
coincida con la base indicada, en caso de que dos señales se mezclen, verificar que
el color de la señal coincida con el de la base, etc.
9. Si se presenta el caso en el que el pico de la señal no está bien definido, es necesario
eliminar la base por completo. Ejemplo:
10. Debes seleccionar el pico incompleto como se muestra en la figura.
11. Debes seleccionar la base del pico incompleto para así poder eliminarla con el botón
“Delete” de tu computadora.
12. Si se presenta el caso en el que dos señales se mezclan, debes asegurarte de que la
base que está inscrita en la secuencia coincide con la señal más alta. Ejemplo:
13. En la imagen se muestra como dos señales se mezclan, en ese caso debes asegurarte
de que la base coincide con la señal más alta, en este caso “T”.
14. En el ejemplo anterior la base y la onda más alta coincidían, pero si se da el caso
contrario, es necesario seleccionar la base y cambiarla por la base correspondiente
al pico más alto de la onda.
15. Debes corregir por lo menos 550 pb para poder utilizar tu secuencia.
16. Una vez que analizaste toda tu secuencia debes proceder a guardarla como formato
FASTA.
17. Debes guardar este archivo en un lugar donde puedas localizarlo fácilmente.
Comparación de la secuencia
1. Para realizar esta sección del procedimiento será necesario conectarse a la página
web: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide
2. El siguiente paso es realizar un BLAST de tu secuencia. Para esto debes seleccionar
la opción de BLAST en la página de NCBI.
3. Después selecciona la opción de “Nucleotide BLAST”.
4. Al seleccionar esta opción te arrojara la siguiente ventana
5. Aquí deberás cargar tu secuencia previamente editada y en formato FASTA.
6. Una vez que selecciones y cargues tu archivo deberás oprimir la opción BLAST que
se encuentra en la parte de abajo de la página para que finalmente el programa
arroje las secuencias de la base de datos comparadas con la tuya y te muestre el
porcentaje de similitud entre ellas.
7. En pocos segundos el programa arrojara los resultados del BLAST de tu secuencia.
8. En el ejemplo anterior podemos identificar rápidamente la especie del microrganismo
al que se le extrajo la muestra de DNA, ya que la secuencia presenta porcentajes de
compatibilidad del 100% con otra secuencia de la base de datos.
Alineamiento múltiple de secuencias
1. Descargar el programa gratuito “Mega 6.06”

2. Abrir el programa Mega 6.06
3. Align, edit/built alignment
4. Create a new alignment, ok
5. Are you building a DNA or Protein sequence alignment? Seleccionar DNA
6. Se despliega una nueva ventana
7. Abrir pestaña edit, insert sequence from file
8. Seleccionar el archivo three domains.txt, abrir
9. En la pestaña alignment, seleccionar align by ClustalW
10. Exportar el alineamiento: Data, export alignment, FASTA format. Asignarle el
nombre deseado.
Construcción de árbol filogenético
1. Abrir el programa Mega

2. Abrir la pestaña File
3. Open a file/session, seleccionar el alineamiento Tres dominios 2.fas
4. Aparece una ventana Analyze or Align File?, seleccionar Analyze
5. Aparece la ventana Input Data, seleccionar Nucleotide sequence, después
OK
6. Aparece una ventana Protein –coding nucleotide sequence data? No
7. Abrir la pestaña Phylogeny, Construct/Test Neighborn-Joining tree
8. Aparece ventana use the active file? Yes
9. Aparece una nueva ventana sobre los parametros del analisis, se dejan los
parámetros default, seleccionar compute
10. Se generará el árbol filogenético
Cuestionario
1. ¿Por qué es necesario realizar la edición del electroferograma?

o
2. ¿Qué es el BLAST?
3. Menciona las 3 bases de datos biológicas más utilizadas.
4. ¿Por qué es necesario realizar un árbol filogenético?
5. ¿Qué información nos muestra un árbol filogenético?
6. ¿Cuál es el gen que suele amplificarse en bacterias y cuál es el que se amplifica
en hongos?
7. Menciona porque generalmente se amplifican estos genes.
Bibliografía
 Rodicio, M. Rosario; (2004). Identificación bacteriana mediante secuenciación del ARNr

16S: fundamento, metodología y aplicaciones en microbiología clínica
 Garcia, J. A.; Picazo, J., J. (2000). Microbiología Médica. Ediciones Harcourt, S.A. Madrid
España.
 Márquez, V, Laura Margarita; (2008). Secuenciación de fragmentos de ADN.
 Busqueda de datos NCBI,
http://www.bbm1.ucm.es/public_html/public_html//teach/biol/web05/documentos/ncbi.pdf
 Curso de Bioinformatica. Aplicaciones en la Agricultura; Tema 7. Analisis de secuencias
de ADN. Programa para diseño de primers para PCR.
 Bioinformatics at COMAV; Bases de datos biológicas.
 Dra. Parra C. Fannie Isela; (2016). Análisis de secuencias.

Manual de Microbiolog A Ambiental2017

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Manual de Microbiolog A Ambiental2017

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

MANUAL DE

[Subtítulo del plan de negocio]

Cd. Obregón, Sonora. Junio 2016

 Uso estricto de bata y zapato cerrado.

o Que el alumno conozca los principios generales de la preparación y técnicas de

La esterilización es muy importante en los laboratorios

Existen diversos métodos de esterilización para la gran variedad de materiales, medios de

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes

1. En base a su composición química pueden ser: sintéticos o definidos (cuando se

2. En base a la presencia de factores de crecimiento, (nutrientes, minerales, etc,) pueden

3. Por su función pueden ser: selectivos (para el desarrollo de un grupo o tipo de

Los medios de cultivo se esterilizan en la AUTOCLAVE, el cual hace

Vertido de medio en cajas Petri y solidificación

Figura 5. Vertido de agar solido

Prueba de la esterilidad de materiales.

o 1. ¿Qué significa esterilización?

 Santana, C. L. y Poncio, A., M.; 2011. MANUAL DE PRÁCTICAS DE

o Que el alumno aplique diferentes técnicas de siembra y aislamiento de cultivos

La inoculación de medios para cultivo es un procedimiento fundamental e importante en toda

Existen diferentes técnicas de siembra: por suspensión de la muestra en medios líquidos;

Figura 6. Aislamiento de bacterias por estría cruzada en placa.

Técnica por picadura

Siembra en tubos en caldo y agar nutritivo (Figura 7)

A. Reportar en el Cuadro 1, sus resultados de siembra de las cepas en cada medio de

Medio de cultivo Cepa 1 Cepa 2

Tubos con PDB

Cuadro 2. Morfología colonial de cultivos microbianos en cajas con AN y PDA

Cepa Cepa 1: Cepa 2: Cepa 3: Cepa 4:

Cuadro 3. Descripción de cultivos en tubos con CN y PDB

o 1. Describa algunos métodos de siembra en medios líquidos y sólidos

 Aprender las técnicas de preparación de frotis, fijación y tinción más

La forma de las bacterias al microscopio está

Figura 8. Morfología microscópica de bacterias

 Pie: es el soporte del microscopio.

La evaluación de las características macroscópicas de las colonias habitualmente se lleva a cabo

Forma Elevación Borde

Figura 12. Morfología y aspecto de colonias microbianas.

Fijación de frotis (Figura 13)

Figura 13. Preparación y fijación de frotis

Tinción de Gram (Figura 14)

Figura 14. Preparación de tinción de Gram

Observación microscópica de hongos filamentosos

Una vez que ya ha puesto aceite de inmersión sobre la preparación ya no puede

Cuadro 4. Descripción macroscópica y microscópica de cultivos bacterianos.

Cuadro 5. Descripción morfológica de hongos filamentosos

o 1. Explicar las diferencias entre una tinción simple y una diferencial

 Santana, C. L. y Poncio, A., M.; 2011. MANUAL DE PRÁCTICAS DE

o  Que el alumno desarrolle las habilidades para identificar y aislar los

La forma de cuantificar células viables más utilizada en microbiología es la de recuento en placa

-1 1/100 1/1000 1/10000 1/100000 1/1000000 1/10000000

Método de dilución seriada

La muestra se pipetea sobre la La muestra se extiende

Método de extensión en placa

4. Determinar la diversidad microbiana, en base a la morfología macroscópica de las

 L. Pepper, Charles P. Gerba, Terry Gentry and Raina M. Maier. (2009).

o Que el alumno identifique los microorganismos capaces de solubilizar fosfatos

Una insuficiencia de fósforo en el suelo puede influir en el retraso de madurez y el desarrollo de

Los microorganismos solubilizadores de fosfato son un grupo funcional de PGPM

Preparación de Medio Pikovskaya para Solubilización de Fosfatos.

Preparación de 500 mL de “Stock sales de Pikovskaya” 40x:

3. Agregar en agitación 5 g de Glucosa, 2.5 g de Ca3(PO4)2 y 0.25 g de extracto de

Preparación de “Stock Azul de Bromofenol” 100x:

1. Dividir la caja Petri en cuatro partes por el lado posterior (base).