Aseguramiento de calidad

MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

Norma ISO 17025

Bqca. QM Alicia I. Cuesta,

Consultora Internacional de la FAO
 Objetivos de la clase:

1. Preparación de medios de cultivo y reactivos.

2. Control de esterilidad de los medios de cultivo y diluyentes.

3. Evaluación de la calidad de los medios de cultivo:

Norma ISO/TS 11133-2:2000
 REQUISITO:
El laboratorio debe asegurarse que
la calidad de los medios de cultivo y reactivos sea
apropiada
para los ensayos realizados.

Este es un punto crítico!

¿Cómo se asegura su calidad?

 ¿Qué necesita un
microorganismo para crecer?
1. Medios de cultivo:
Son necesarios para el aislamiento, mantenimiento, la
reproducción y la identificación de los microorganismos.
☺Contienen sustancias nutritivas
☺pH adecuado
☺Deben estar estériles.

2. Incubación:
Depende del metabolismo del microorganismo a cultivar.
☺La atmósfera empleada.(aerobio, microaerofílico,
anaerobio)
☺Tiempo.
☺Temperatura.
 Medios de cultivos

Clasificación de medios de cultivo:

1.Según su estado físico: líquidos, semisólidos y sólidos.

2.Según su finalidad en microbiología:

)No selectivos: contienen suficientes nutrientes como para soportar
el crecimiento de gran variedad de microorganismos.

)Selectivos: permiten el crecimiento de sólo un tipo de

microorganismo.

)Enriquecido: son medios no selectivos que se le agrega sustancias

como ser sangre, suero, albúmina, etc... Para microorganismos exigentes.

)Diferenciales: son medios de cultivo que permiten establecer

diferencias entre diferentes tipos microorganismos.
 Medios de cultivo

Los requerimientos de los

medios de cultivo son
específicos de :
)la muestra que se analiza.

) de los microorganismos a
ser detectados.
 Los medios de cultivo se preparan:

1. En el laboratorio a partir de sus diferentes

componentes.
2. A partir de productos en polvo deshidratados
comerciales o
3. Pueden adquirirse medios listos para su uso.

Se puede tomar como base el documento

ISO 7218:1996(E) Microbiology of food and animal feeding
stuff-General rules for microbiological examinations para:
-La preparación y esterilización de medios.
-Tiempos de almacenamiento recomendados.
 Requisitos de los medio de cultivo
provistos por el fabricante :

9 Los lotes de medios deben estar debidamente

identificados.

9 Cada lote recibido debe ir acompañado de

evidencias del cumplimiento de las
especificaciones de calidad.
REQUISITO:
El fabricante
en el momento de la entrega
de medio de cultivo
debe proveer información
acerca de las
especificaciones de calidad,
como mínimo debe incluir lo
siguiente:
• Nombre del medio y lista de
componentes, incluido cualquier
suplemento.
• Fecha de vencimiento del medio.
• Condiciones de almacenamiento.
• Control de esterilidad.
• Control del crecimiento de los
microorganismos de interés
(target) y de los microorganismos
no deseados (no target) y criterios
de aceptabilidad.
• Controles físicos y criterios de
aceptabilidad aplicados.
• Fecha de emisión de las
especificaciones
Manejo de los medios de cultivo:

1. El laboratorio debe registrar la fecha :

9 de recepción
9 de apertura del envase.
9 de caducidad

2. El almacenamiento debe realizarse en las

condiciones apropiadas.
9 Envases: deben estar herméticamente cerrados.
(especialmente medios deshidratados)
9 No deben utilizarse medios deshidratados que
presenten apelmazamiento o un cambio de color.
 Control de calidad del agua destilada
Para la preparación de medios, soluciones y tampones,
debe utilizarse agua destilada que haya sido sometida a
controles periódicos que aseguren su calidad.

Controles periódicos:
9Requisitos del agua destilada:
-Conductividad.
- pH
- Contaminación microbiana
- Libre de sustancias bactericidas, inhibidoras o
interferentes.
-Se debe llevar un registro actualizado de los mismos.
 Procedimiento para preparación de medios
de cultivo, diluyentes y reactivos

Los medios de cultivo, soluciones y reactivos deben

prepararse, almacenarse y utilizarse de acuerdo con
un procedimiento documentado.

9En dicho procedimiento debe haber una descripción del

equipamiento necesario.
9El laboratorio debe colocar una etiqueta indicando la
identificación y otros datos en los medios de cultivo y
reactivos.
9Debe haber un registro de preparación de medios de
cultivo y reactivos.
 Almacenamiento de los
medios de cultivo y diluyentes
preparados:

Debe determinarse y verificarse

el período de validez de los medios preparados
en las condiciones de conservación especificadas.

En general los medios preparados se guardan:

9En heladera no más de tres meses
9A temperatura ambiente no más de un mes en condiciones
que impidan que su composición sea modificada.

Observar cambio del color, evaporación,

la deshidratación o el crecimiento microbiano.
 REQUISITOS
Medios preparados por el laboratorio:
Se debe verificar (siempre que sea necesario) que los
medios de cultivo y diluyentes preparados por el
laboratorio tengan las características adecuadas con
respecto a:

9Recuperación o supervivencia de los microorganismos

de interés.(Productividad)
9Inhibición o supresión de los microorganismos no
deseados.(Selectividad)
9Propiedades bioquímicas (diferenciales y diagnósticas)
9Propiedades físicas (por ejemplo, pH, volumen).
9Sea estéril.
 Medio de cultivo:
Parámetros a tener en cuenta para
obtener un buen resultado.
9Agua: recipientes dónde se almacena el agua debe ser
inerte.

9pH: la medida a 25 oC. pH +0.2. ajuste el pH con 1 M

NaOH o 1M CLH

9fundir en el agua hirviente volúmenes <500ml.

915 ml de espesor agar en placas petri 90 mm.

9Secado de placas estufa 25-55 oC (20 min.) o en flujo

laminar.

9Incubación: las pilas de platos < 6.

 Medios listos para su uso:

Todos los medios y diluyentes que se suministren en

una forma directamente utilizable o parcialmente
completa deben ser validados antes de su utilización.

Se evalúa utilizando criterios objetivos del medio

respecto a:
) la recuperación o supervivencia de los
microorganismos de interés
) la inhibición o supresión de los microorganismos no
deseados tiene que ser cuantitativa.
) los atributos (por ejemplo: Propiedades físicas y
bioquímicas).

Parte de esa validación es provista por las

especificaciones de calidad del proveedor.
 Reactivos
EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE LOS REACTIVOS:

El laboratorio debe asegurarse que

la calidad de los reactivos utilizados sea
apropiada para los ensayos realizados.

Ejemplo: Reactivos usados para revelar pruebas bioquímicas

Realizo controles positivo y negativo utilizando

microorganismos que sean trazables a colecciones de
cultivos nacionales o internacionales reconocidas.
 Control de las pérdidas de volumen
durante la esterilización:

Debe verificarse que no haya pérdidas significativas de

volumen de los diluyentes durante el proceso de
esterilización en autoclave.
Este punto es especialmente importante en métodos
cuantitativos.

El laboratorio debe tener :

)Un procedimiento documentado.

)Registro de datos obtenidos realizados en forma periódica.
El laboratorio determina el intervalo
en el que se efectúan estos controles.
 Control de las pérdidas de volumen
durante la esterilización

Para la evaluación de la pérdida de volumen de los

diluyentes:

1. Colocar un volumen fijo de diluyente en tubos de ensayo

o frascos de dilución.

2. Medir el peso o volumen antes y después del proceso

de esterilización en autoclave.

3. Con los datos obtenidos, se efectúa el cálculo y la

inferencia estadística.
 LAVADO DE MATERIAL:

Otro aspecto a tener en cuenta es el correcto

lavado del material reciclable.
El laboratorio de debe contar con un instructivo para
esta tarea.
Pasos:
☺Descontaminación material de vidrio.
☺Enjuague y se lavado con agua caliente y extran
neutro (diluido al 2%)
☺Enjuague nº de veces con agua corriente y luego un
nº de veces con agua destilada. Eliminar el detergente
☺El material se seca en estufa y se acondiciona para
ser esterilizado.
Eliminación de los reactivos:

Si bien la eliminación adecuada de los reactivos no es

un problema que afecte directamente a la calidad,

DEBE REALIZARSE DE ACUERDO CON LA

NORMATIVA VIGENTE EN MATERIA DE MEDIO
AMBIENTE, SALUD Y SEGURIDAD.

Las precauciones a tomar con suplementos conteniendo

sustancias tóxicas se especificarán claramente en cada
caso de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
 Control de esterilidad
de los medios de cultivo y diluyentes:

¿ Fue efectivo el proceso de esterilización de los medios

de cultivo y diluyentes?
PRUEBA: se incuban en estufa de cultivo.

• La temperatura y tiempo de incubación para esta prueba

se corresponden con las condiciones usadas durante el
ensayo.

• Se realiza este ensayo sobre el 1% de las placas o tubo

del comienzo y 1% de las placas o tubos del final de
verter o distribuir los medios o diluyentes.

• Este procedimiento se realiza por cada vez que se

esteriliza un lote de medio de cultivo o diluyente en
autoclave o se esteriliza por filtración.
 Datos a registrar:
REGISTRO
CONTROL DE 9 Fecha de realización del control
9 Medio de cultivo o diluyente
ESTERILIDAD DE 9 Indicación del proceso de
MEDIOS DE esterilización (Ejemplo N º
correlativo de proceso en
CULTIVO Y autoclave o filtración)
9 Tiempo de incubación (en
REACTIVOS horas)
9 Temperatura de incubación (º C)
9 Resultado
9 Conforme (SI o NO)
9 Firma del personal responsable de
la realización del control.
 Síntesis parcial
En microbiología se le da especial énfasis a la calidad de los
medios de cultivo y reactivos, tal que aquella sea apropiada
para los ensayos realizados.
La preparación y esterilización constituyen pasos críticos en el
logro de este objetivo.
El fabricante en el momento de la entrega de medio de cultivo
debe proveer información acerca de las especificaciones de
calidad.

El laboratorio debe contar con Procedimientos o Instructivos

documentados e implementado para :
)La preparación y esterilización de medios de cultivo y
diluyentes
)La preparación de reactivos
)Control de calidad del agua destilada.
) Lavado de material
)Control de las pérdidas de volumen de los diluyentes durante
la esterilización en especial para métodos cuantitativos.
EVALUACIÓN DE LA CALIDAD
DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

El objetivo es definir la:

metodología para evaluar la
PRODUCTIVIDAD y SELECTIVIDAD
de medios de cultivo utilizados
en el laboratorio de microbiología.
 PRODUCTIVIDAD:

Definición:
rendimiento, recuperación, crecimiento
de un microorganismo que se espera que desarrolle en
el medio de cultivo.
Según el medio de cultivo, se usa una cepa apropiada de
referencia target para evaluar la productividad
(ver anexo B de la norma ISO/TS 11133-2:2000)

EJEMPLO: En un medio de cultivo no selectivo como

por ejemplo el PCA se evalúa el adecuado desarrollo
de las cepas target o blanco.
En este caso se usan E. coli ATCC 25922,
S. aureus ATCC 6538 y B. subtilis ATCC 6633
 Selectividad:

Definición: la supresión del crecimiento de un

microorganismo que se espera sea inhibido en el
medio de cultivo.
Según el medio se usa una cepa apropiada de
referencia no-target para evaluar la selectividad
(ver anexo B de la norma ISO/TS 11133-2:2000)
En un medio de cultivo selectivo como por ejemplo
Caldo Lauril sulfato (LST)
se evalúa el desarrollo de las cepas target y no target.
En este caso las cepas target que se usan son
E.coli ATCC 25922, C.freundii ATCC 43864
y las cepas no target Enterococcus faecalis ATCC 29212.
Evalúa reacciones características: gas y turbidez.
En medios selectivos y/o diferenciales
hay que evaluar:

)El crecimiento de las cepas target

)Hay que prestar atención también a la apariencia,

tamaño y morfología de las colonias (especificidad)

)El crecimiento de las cepas no-target debe estar en

parte o completamente inhibido.
PARA EVALUAR CADA LOTE DE MEDIO DE CULTIVO
según Norma ISO/TS 11133-2:2000

SE PUEDE EMPLEAR LOS SIGUIENTES MÉTODOS:

a)Pruebas cuantitativas

b) Pruebas semi-cuantitativas

c) Pruebas cualitativas
EVALUACIÓN DE LA CALIDAD
DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

La elección del empleo de una u otra metodología

será considerada en cada caso en particular
según el medio a evaluar,
las capacidades y necesidades del laboratorio
ver ANEXO B norma ISO/TS 11133-2:2000.
 MEDIO DE REFERENCIA

El uso de un medio de referencia específico

es obligatorio en los métodos de cuantitativos
(ver anexo B de la norma ISO/TS 11133-2:2000)

Para las pruebas semi-cuantitativas o cualitativas,

el uso de un medio específico de referencia
o un medio de cultivo que da una “la reacción positiva"
ayuda al ínterpretar los resultados.
El medio de referencia debe ser de conocida buena calidad
(por ejemplo ser un medio listo para el uso
de calidad asegurada por el proveedor)
 Cultivo de trabajo:
(según Instructivo de cultivos de referencia)

Se prepara un cultivo en fase estacionaria

de la cepa a partir de la cepa de reserva
almacenadas en el laboratorio
en un caldo no selectivo.
(por ejemplo caldo cerebro corazón)
 Productividad:

Para evaluar la productividad de los medios de cultivo

sólido, semisólido o líquidos ya preparados esterilizados,
los mismos deben ser
inoculados con un microorganismo target apropiado o
cultivo de trabajo.
 Productividad: Pruebas cuantitativas

Para las pruebas cuantitativas la proporción de

Productividad PR es definido como sigue:

PR = Ns /No

donde
Ns: es el recuento total de colonias obtenido en el medio
de cultivo a probar (obtenido de uno o más placas)
No: es el recuento total de colonias obtenido en el medio
de cultivo de referencia definido obtenido de uno o más
placas que debe ser › 100 ufc.
 Productividad: Pruebas cuantitativas
CRITERIO DE CONFORMIDAD:
Anexo B de la norma ISO/TS 11133-2:2000.

Allí figuran:
) Los microorganismos
)Tiempo y temperatura de incubación
)Criterios
)Medio de referencia que debe usarse según el medio
a evaluar.
) PR debe ser mayor o igual a un valor límite para que
el medio de cultivo sea conforme.

En general para que los medios no selectivos como

el PCA sea conforme, el PR debe ser › a 0,7.
 Productividad:
Pruebas cuantitativas
Ejemplo
Se desea evaluar la productividad del PCA.
El medio de referencia usado es agar tripticasa soya (TSA)
1) Ns ( dil -6):140 ufc
No ( dil -6): :170 ufc
PR = Ns /No
PR= 0,8 esto quiere decir que el medio testeado es conforme

2) Ns ( dil -6):100 ufc

No ( dil -6): 230 ufc
PR = Ns /No
PR= 0,4 esto quiere decir que el medio testeado
no es conforme en cuanto a su productividad.
 Productividad: Pruebas semi-cuantitativas
en medios de cultivos sólidos

• Se inocula en forma de estrías

diluciones del cultivo con ansa
calibrada de acuerdo a la figura
o modelo.
• Las placas inoculadas se
incuban a temperatura y tiempo
que depende del medio de
cultivo evaluado y se observa
el crecimiento.
• Se evalúa la productividad del
medio teniendo en cuenta el
valor de cada estría con
crecimiento.
 Productividad : Pruebas cualitativas

Se llevarán a cabo visualmente asignando un score de

crecimiento.
Score para medios sólidos:
• 0 no hubo crecimiento
• 1 hubo crecimiento débil
• 2 hubo buen crecimiento.
Score para medios líquidos:
• 0 no hubo turbidez
• 1 hubo turbidez muy tenue
• 2 hubo buena turbidez
 Selectividad:

Para llevar a cabo la prueba de la selectividad,

el medio de cultivo selectivo a evaluar y un medio de la
referencia se inoculan con un microorganismo y nivel
apropiado.

Se emplea una suspensión del microorganismo

de no-target que contiene 104cfu a 106cfu por ml se
inocula en la placa o en el tubo de medio.
 Certificado de control de calidad
de un no selectivo medio de cultivo
Certificado
de
control de
calidad
de un
selectivo
medio de
cultivo
Certificado de control de calidad
de un selectivo medio de cultivo
 La información a registrar es:
9 Medio de cultivo evaluado.
9 Nº ID o Nº lote de medio evaluado.
9 Fecha de realización del análisis.
REGISTRO 9 Cepa usada (Género y especie del
EVALUACION microorganismo y tipo y Nº de
DE MEDIOS colección).
9 Medio de referencia usado para evaluar
DE CULTIVO la productividad.
9 Medio de referencia usado para evaluar
la Selectividad.
9 Resultado de productividad (unidades).
9 Resultado de selectividad (unidades).
9 Medio de cultivo conforme (SI/NO)
9 Personal responsable.
 Aseguramiento de calidad de
los medios de cultivo
Posibles problemas

Anormalidad Posible causa

Falla en la 9Sobrecalientamiento del medio durante la preparación
solidificación 9Peso incorrecto del agar
9Agar mal disuelto o incompleta mezcla de los ingredientes
del medio
sólido
pH incorrecto 9Pobre calidad del agua.
9Pobre calidad del medio deshidratado.
9pH medido incorrectamente.
9Contaminación externa con químicos.
9Sobrecalientamiento del medio durante la preparación

Color anormal 9Sobrecalientamiento del medio durante la preparación

9pH incorrecto
9Contaminación externa.
9Pobre calidad del agua o del medio deshidratado.
 Aseguramiento de calidad de
los medios de cultivo
Posibles problemas

Anormalidad Posible causa

Formación de 9Sobrecalientamiento del medio durante la preparación
precipitado 9pH medido incorrectamente
9Pobre calidad del agua.
9Pobre calidad del medio deshidratado.
Medio inhibitorio/ 9Pobre calidad del agua.
Productividad 9Formulación inadecuada Ej.ingredientes y suplementos mal
pesados.
baja 9Sobrecalientamiento del medio durante la preparación
9Pobre calidad del medio deshidratado
Selectividad 9Sobrecalientamiento del medio durante la preparación
pobre 9pH incorrecto.
9Formulación inadecuada.
9Pobre calidad del medio deshidratado.
9Suplementos agregados incorrectamente Ej: con el medio
demasiado caliente o en alta proporción.
 Síntesis parcial

Los medios de cultivos sólidos, semisólidos y líquidos

empleados para la realizar el ensayo deben ser
evaluados en cuanto a su productividad, selectividad y
reacciones características.
Para ello se han desarrollado pruebas cuantitativas,
semi-cuantitativas y cualitativas.
Las recomendaciones internacionales de organismos de
acreditación se basan en la Norma ISO/TS 11133-
2:2000.
Es importante el uso de cultivos de referencia con
adecuada trazabilidad.
 Síntesis final

Un punto crítico a tener en cuenta a la hora de

implementar y la ISO 17025 y acreditar el laboratorio es la
preparación, esterilización y evaluación de la calidad de los
medios de cultivo empleados para realizar el ensayo.
Las recomendaciones internacionales de organismos de
acreditación se basan en la Norma ISO/TS 11133-1:2000 y
ISO/TS 11133-2:2000.
Esto implica una revisión de las prácticas cotidianas
realizadas por el laboratorio y a su vez la seguridad que
los medios usados son adecuados a la finalidad prevista.