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Identification of microorganisms in persistent/secondary endodontic

infections with respect to clinical and radiographic findings: bacterial


culture and molecular detection

Nazanin Zargar1, Mahmoud Amin Marashi2, Hengameh Ashraf3, Rene Hakopian1*, Peyman Beigi4

Este estudio pretende identificar los microorganismos presentes en infecciones de dientes


con tratamientos de conducto previos, en pacientes iránies, empleando métodos de cultivo y
biología molecular usando análisis de secuencia del gen rDNA 16S.

Las infecciones secundarias o persistentes en dientes con antecedente de tratamiento de


conducto terminado, están directamente relacionados con el fracaso del tratamiento por
diferentes factores:

-Sellado coronal inadecuado.


- Falla en la preparación química y mecánica del conducto radicular.
-Limitaciones durante el tratamiento, como difícil acceso para instrumentación, morfología
atípica o instrumentos insuficientes.
- Poca calidad del material obturador.

Existen diferentes microorganismos presentes en la infección secundaria por fracaso del


tratamiento endodóntico, algunos de estos microorganismos son: Bacterias, hongos y virus,
que para estudiarlos se usaron métodos de cultivo y secuenciación Rdna 16s.

Materiales y métodos

Estudiaron 30 pacientes sintomáticos con infección persistente del conducto radicular o


secundaria a previo tratamiento del conducto. Se evaluó la calidad del material de
obturación y la lesión periapical.
Las muestras se prepararon de una forma similar por el clínico, antes de recolectar la
muestra, con peróxido de hidrógeno (30%) se desinfectaron los dientes, seguido del
hipoclorito de sodio al 3% y se neutralizó con tiosulfato de sodio al 5%. Se recolectaron las
siguientes muestras que se enviaron a dos laboratorios de microbiología:
Paso 1.
- gutapercha se dispuso en tioglicolato.
-Se ingresó una lima n°20 en el conducto, se separó con cortapelos la parte activa, y se
dispuso en el mismo medio.
- Se insertó la punta de papel a longitud y se dispuso en el mismo medio.
Paso 2.
- Se ingresó una lima n°25 en el conducto, se separó con cortapelos la parte activa, y se
dispuso en el mismo medio.
- Se insertó la punta de papel a longitud y se dispuso en el mismo medio.

Pasos de laboratorio

Especies cultivables: En 2 placa de agar Brucella


- Una aerobio y otra para anaerobio.
- Aerobio en el agar y anaerobio con paquete de gas, se incubaron a 37°C, durante 48
a 72 horas.
- Después de la detección primaria de cada colonia, se aisló un bucle de cada colonia
y se utilizó para la extracción de ADN.
Especies no cultivables:
-Se examinaron varias especies su presencia en las muestras, se identificó el gen
específico para el cebador de cada especie.

Secuenciación del rDNA 16s


Después de realizar reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se cortan con enzimas
endonucleasas (TaqI and HaeIII) para tener patrones adecuados para secuenciación. Se
clasificaron y se enviaron a secuenciar. PCR para especies cultivables se utilizaron 27F y
1492R. Para las especies no cultivables se usaron cebadores específicos. Estas secuencias
se analizaron en un analizador genético (ABI Prism 3100). Los productos amplificados se
separaron por electroforesis en gel de agarosa teñido con bromuro de agarosa. El ADN se
extrajo de las bandas en gel usando un kit de extracción de gel y luego fue secuenciado.

Análisis estadístico: Los datos se analizaron en un software. Frecuencia y porcentaje de


lesiones AP según tamaño.

Resultados
15 pacientes tenían lesiones Rx menores de 5mm y 15 lesiones Rx mayores de 5mm.
En este estudio se observaron 13 especies bacterianas de 11 géneros diferentes, una cepa
de virus y una cepa de hongos.

En pacientes con lesiones periapicales menores de 5mm, E. faecalis fue el más prevalente
con 80%. Pero en pacientes con lesiones mayores a 5mm Dialister invisus, Streptococcus
salivarius fueron los más prevalentes con 53.3% y E. Faecalis 46.7%.
En pacientes sintomáticos Tannerella Forsythia fue la bacteria más encontrada entre este
grupo.
Atopobium parvulum se encontró por primera vez en lesiones secundarias/persistentes.
Candida albicans en 10 casos con 33.33% con mayor prevalencia en dientes con lesiones
menores a 5mm y en dientes asintomáticos.
El VHS-1 fue más prevalente en dientes con lesiones menores de 5mm con 40%.

Discusión

Al utilizar cultivos microbianos y método molecular en paralelo se permitió estudiar


especies cultivables y no cultivables de una misma muestra. Observando especies no
cultivables como Dialister invisus, Atopobium parvulum y el virus HSV-1.

En este estudio Atopobium parvulum se encontró por primera vez en infecciones


endodónticas persistentes.

El microorganismo más prevalente fue E.faecalis con 63.3%, en infecciones endodónticas


secundarias. Este microorganismo puede sobrevivir en dientes tratados con endodoncia y
puede sobrevivir a procedimientos de desinfección intracanal y los medicamentos
intracanal. El segundo microorganismo más prevalente fue Dialister invisus con un 53-3%
y el tercero la Streptococcus salivarius con una prevalencia de 50%.

En este estudio se observa que existe una prevalencia de bacterias Gram-positiva en todas
las muestras lo que puede ser un factor que afecte al fracaso del tratamiento.

Conclusión

Este estudio mostró la importancia de realizar estudios que combinen métodos de biología
molecular y métodos de cultivo microbiano, porque son complementarios entre sí. Este
estudio se centró en pacientes Iraníes, por lo que es necesario realizar un estudio en cada
país para observar la microbiota de cada zona y así diseñar protocolos que impacten en los
pacientes locales.

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