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ESTANDARIZACIÓN Y VALIDACIÓN DE LA PRUEBA DE PCR ANIDADA PARA

EL DIAGNÓSTICO DE ESPECIES DEL GÉNERO XYLEBORUS (COLEOPTERA:


CURCULIONIDAE: SCOLYTINAE)

Presentado por:

Lina Paola Marín Rosales - 118535


Dayana Pardo Muñoz - 118554
Nataly Johana Portillo Trochez -118548
Carolina Rios Gutierrez -118557

Karina López López (phD)


Curso de biología celular y molecular 2021-1

Universidad Nacional De Colombia


Facultad De Ciencias Agropecuarias
Ingeniería Agronómica
Palmira
2021
Estandarización y validación de la prueba de PCR anidada para el diagnóstico de
especies del género xyleborus (Coleoptera:Curculionidae:Scolytinae)

Algunos de los cultivos de interés económico en México se encuentran altamente afectados


por diferentes plagas de las que hace parte el complejo de escarabajos ambrosiales del género
Xyleborus (Coleoptera:Curculionidae:Scolytinae), estos se caracterizan por vivir en simbiosis
con especies fungívoros, siendo los principales causantes del daño en la planta.
Generalmente, el diagnóstico tradicional por caracteres morfológicos de esta especie resulta
complejo debido a la gran similitud que estos presentan, por lo que se busca el desarrollo de
técnicas moleculares que permitan determinar con rapidez y sensibilidad la identidad de
dichos organismos, debido a lo anterior, se buscó estandarizar y validar la técnica de
PCR-anidada para la detección de estas especies.

Para el presente estudio se utilizaron individuos donados por la Colección Entomológica Del
Centro Nacional De Referencia Fitosanitaria (CNRF) y del colegio de postgraduados, los
cuales fueron identificados previamente por caracteres taxonómicos, las muestras incluían 26
ejemplares de 7 especies diferentes del género Xyleborus preservados en seco y en etanol, de
acuerdo con su fecha de colecta. Posteriormente, se realizó una extracción de ADN de los
ejemplares mediante el uso del Kit Qiagen DNeasy® mericom Food el cual no estaba
reportado previamente su utilización en insectos, y se efectuó la verificacion de ADN por
medio de espectrofotometría. Paso a seguir, se llevó a cabo la estandarización y validación de
la PCR, el objetivo de dichos procedimientos son volver general esta técnica de laboratorio
con el fin de identificar molecularmente las especies del género Xyleborus; se realizó el tipo
de PCR anidada, permitiendo una mayor amplificación, debido al uso de 2 pares de cebadores
que buscan una secuencia externa y finalmente una región específica, efectuándose 2 rondas
de PCR. Las amplificaciones se dirigieron hacia el gen mitocondrial Citocromo Oxidasa
subunidad 1 (CO1), el cual generalmente se usa como un código de barras de ADN con el fin
de identificar especies animales debido a su alta tasa de sustitución, presentando variación de
la secuencia entre especies del mismo género, para esto, se utilizaron oligos externos
(CI-J-2183 5´-CAACATTT ATTTTTGATTTTTTGG-3´ y TL2-N-3014
5´-TCCAATGCACTAAT CTGC CATATTA-3´) e internos (J2210 5 ́-TCGCAT
ATTATTAGGCAAGA-AAGAG-3 ́ y N2739 5 ́-AGAAAT GTTGTG GGAAGA-AAG-3)
generando una primera amplificación de 1300 pb y una segunda de 500 pb de la región del
gen. En la estandarización se evaluaron dos polimerasas comerciales que actúan como
enzimas las cuales fueron Go Taq® Flexi M8295 y Go Taq® M3005 (Promega 2015), a su
vez, también se ajustaron las temperaturas de alineamiento y la concentración de los
elementos utilizados en la reacción. Por otra parte, se realizó el límite de detección, teniendo
como función determinar la cantidad mínima del ADN, se consideró el tamaño y peso de las
especies que oscilan entre 2.3 mm y 200 mg, respectivamente, no llegando al peso sugerido
por el kit comercial, existe una posibilidad de extraer ADN insuficiente para la reacción de
PCR, por lo que se presentan una serie de diluciones para ser fraccionadas en la electroforesis
con un gel de agarosa y el colorante de bromuro de etidio que bajo luz UV permite
determinar el tamaño de la banda, este procedimiento no se llevó a cabo en el individuo X
horridus debido a su mayor tamaño de 4 mm. Finalmente, se hizo un análisis molecular, para
ello, los productos de la PCR se limpiaron con el kit Wizard®SV Gel y PCR Clean-Up
System, lo cual se enviaron a secuenciar al instituto de biotecnología de la UNAM con los
oligos internos (J2210 y N2739). Dichos electroferogramas se editaron y analizaron por
medio de un alineamiento por homología utilizando el programa Clustal W.

En los resultados se obtuvo que la identificación morfológica de las especies se llevó a cabo
por medio de una clave, estos coincidieron con los individuos reportados en la literatura. En
cuanto a la extracción de ADN, el kit utilizado dio resultados favorables, aun siendo este no
específico para insectos; todas las extracciones amplificaron un fragmento aproximadamente
de 500 pb la cual corresponde a una sección de gen CO1, a pesar de que la mayoría de las
especies procesadas tenían una antigüedad de ocho años de conservación, las que presentaron
mejor rendimiento de ADN fueron las muestras que tenían menor tiempo de preservación.
Seguido de esto, se realizaron 4 ensayos con 5 repeticiones sometiendo las muestras a
diferentes enzimas, temperaturas de alineamiento y concentraciones de reactivos, con el fin
de estandarizar las condiciones de amplificación, puesto que primeramente no se obtuvo la
reproducibilidad esperada. Al evaluar lo anterior, se definieron las condiciones que
finalmente dieron como resultado una alta reproducibilidad en las amplificaciones (Ver figura
1). Respecto al análisis molecular se realizaron secuenciaciones de cada amplificación por
triplicado, las secuencias consenso (sucesión que representa los nucleótidos con mayor
frecuencia en el fragmento de ADN), fueron analizadas por homología y depositadas en el
Genbank, siendo una base de datos, depósito de secuencias de nucleótidos, posteriormente,
por medio de la aplicación BLAST que realiza una comparación con muchas secuencias a
nivel mundial, se obtuvo que para cada especie se presenta una homología de: 92% para X.
affinis, las secuencias generadas para X. spinulosus, X. horridus y X. intrusus, presentaron
baja homología contra otras especies por no haber secuencias para CO1 disponibles para
estas especies, por lo que estas serán la primeras secuencias del gen CO1 depositadas, por
último, el X. ferrugineus presenta una identidad de 79% contra la secuencia de un organismo
de la misma especie.

Se concluye, que el uso del kit DMF fue apto para la extracción de ADN de especies del
género Xyleborus con una calidad adecuada, asimismo permitiendo su amplificación por
medio de la PCR-anidada; también, se logró estandarizar, validar y optimizar la técnica de
PCR-anidada, con alta reproducibilidad la cual aportó resultados de mayor confiabilidad que
permitió una correcta identificación molecular de las especies evaluadas (Ver figura 1). Por
otra parte, se obtuvo la secuenciación parcial del CO1 para los individuos del género
estudiado. Finalmente, esta metodología constituye una alternativa complementaria a la
tradicional para el diagnóstico de especies Xyleborus.
Figura 1. Reproducibilidad de la PCR-anidada

Nota: Reproducibilidad de la PCR-anidada, de acuerdo a las condiciones previamente


estandarizadas y validadas. 1 y 12) MM 100 pb; 2-6) 1er ensayo del PCR con cinco
repeticiones; 7-11) 2do ensayo de PCR con cinco repeticiones; 13-17) 3er ensayo de PCR con
cinco repeticiones; 18-22) 4to ensayo de PCR con cinco repeticiones.
Fuente: (Sosa,et al, 2017).

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