Dia Positi Vas

Curso: Fundamentos del
HPLC y sus aplicaciones en

biología molecular!
Michelle C. Chirinos-Arias!
Clase 1
Fundamentos de la
cromatografía líquida de
alta performance!
¿Qué es Cromatografía?
Es una técnica de separación (tal como la destilación u
otras técnicas similares). Que separa múltiples tipos de
Analitos. Su objetivo es Separar y Cuantificar un
compuesto de una mezcla.
Componente
de interés
analítico en la
muestra
La Cromatografía, es un método físico de separación donde el soluto se

distribuye entre dos fases: Fase Móvil y la Fase Estacionaria.
Según UIPAC se define a la cromatografía como:
Escribir en colores
Clasificación de la cromatografía
Fundamentos de la
cromatografía
líquida
Cromatografía Líquida
  La cromatografía líquida, es aquella en la cual la fase

móvil se encuentra en estado líquido. En la cual se
puede separar cualquier compuesto orgánico, inclusive
iones. (con respecto a cromatografía de gases).
Cromatografía líquida de alta resolución
HPLC
  Cromatografía de alta presión es decir se aplica el
flujo a presión (entre 1500 a 2200 psi)
  La longitud de la columna es entre 4 y 25 cm

  El tamaño de partícula es entre 3 y 50 micras.
  Requiere de equipo sofisticado.
Fase móvil
Fundamentos de la Cromatografía Líquida
FASE MOVIL
Es un líquido (solvente orgánico o agua), el cual puede estar

Puro o en Mezcla). Para que un solvente pueda usarse como
fase móvil (o parte de ella), debe de presentar características
especiales:
•  Transparencia UV y Cut Off
•  Miscibilidad
•  Viscosidad Absorbancia
•  Pureza
•  Estabilidad
•  Fuerza de Elución
•  Seguridad
Cut Off
•  Compresibilidad
•  Índice de Refracción
•  Costo
Principales Solventes y sus Propiedades
Fuerza Indi. de Número de Pto. de

Solventes HPLC Peso Densid. Viscosidad Pol. del UV Cut Off Moment. Pto de Punto de
Eluyente Refracción Miscib. Ignición
Propiedades Mol. (20 C) (cP) Solvente (nm) Dipolar Congel. (°C) Ebull. (°C)
(NP) (20 °C) D<15=Misc (°C)
1,2-Dicloroetano 98.96 1.2521 0.78 0.44 3.5 1.442 230 - -35.7 83 13
2,2,4-Trimetilpentano
114.23 0.6919 0.47 0.01 0.1 1.389 200 29 - -107.4 99 -12
(= Iso Octano)
Acido Acético 1.1 6 1.37 235 118

Acetona 58.08 0.79 0.32 0.56 5.1 1.359 330 15, 17 2.88 -94.7 56 -18
Acetonitrilo 41.05 0.7822 0.34 0.65 5.8 1.344 210 11,17 3.92 -43.8 82 6
Disulfuro de Carbono 0.34 0.15 0.3 1.626 380 46
Tetracloruro de Carbono 0.9 0.18 1.6 1.457 265 77
Clorobenceno 0.8 0.3 2.7 1.525 21 132
Cloroformo 119.38 1.4891 0.57 0.4 4.1 1.443 245 19 1.04 -63.5 61 N/A
Ciclohexano 84.16 0.7786 0.9 0.04 -0.2 1.427 200 28 - 6.7 81 -17
Ciclopentano 0.42 0.05 -0.2 1.406 200 -103.5 49 -20
Diclorometano
84.93 1.3256 0.41 0.42 3.1 1.424 240 20 1.6 -94.9 40 N/A
(= Cloruro de Metileno)
Eter Dietilico 74.12 0.7136 0.24 0.38 2.8 1.352 220 23 1.15 -116.3 34 -45
Dimetilformamida 73.09 0.9487 0.8 0.64 6.4 1.43 275 12 3.82 -60.4 153 58
Dimetilsulfoxido 78.13 1.1004 2 0.75 7.2 1.479 275 9 3.96 18.5 189 95
Dioxano
Etanol 46.07 0.7892 1.08 0.88 4.3 1.361 220 12 1.69 -114.5 78 12
Acetato de Etilo 88.11 0.9006 0.45 0.58 4.4 1.372 260 19 1.78 -83.6 77 -4
Fluoroalcanos -0.25 <-2 1.25

Principales Solventes y sus Propiedades
Indice de Número de Punto de Punto de

Solventes HPLC Peso Densidad Viscosidad Fuerza Polaridad del UV Cut Off Momento Punto de
Refracción Miscibilidad Congelam. Ignición
Propiedades Molecular (20 °C) (cP) Eluyente (NP) Solvente (nm) Dipolar Ebull. (°C)
(20 °C) D<15=Misc (°C) (°C)
Heptano 100.2 0.6838 0.4 0.01 0.2 1.388 195 29 0 -90.6 98 -4
Hexano 86.18 0.6593 0.29 0.01 0.1 1.375 190 29 - -95.3 69 -23
Metanol 32.04 0.791 0.54 0.95 5.1 1.328 210 12 1.7 -97.7 65 10
Metil Etil Cetona (MEC) 72.11 0.8049 0.38 0.51 4.7 1.376 330 17 2.78 -86.7 80 -7
m-Xileno 106.17 0.8644 0.62 0.26 2.5 1.497 290 - 139.1 139 25
Acetato de n-Butilo 0.73 0.4 4 1.394 254 22 126
n-Butil Eter 0.64 0.25 2.1 1.397 220

Nitrometano 0.67 0.64 6 1.38 380 101
N-Metil Pirolidona 1.67 0.7 6.7 1.468 285 202
Pentano 72.15 0.6262 0.22 0 0 1.355 195 - -129.7 36 -48
Eter de Petroleo 0.3 0.01 0.1 1.39 210 29
n-Propanol 60.1 0.8036 1.9 0.8 4 1.386 240 1.55 -126.2 97 15
2-Propanol (IPA) 60.1 0.7855 1.9 0.82 3.9 1.384 210 15 1.56 -88 82 12
Piridina 79.1 0.9832 0.88 0.71 5.3 1.51 305 16 2.21 -41.6 115 20
Tetrahidrofurano (THF) 72.11 0.8892 0.46 0.6 4 1.407 215 17 1.75 -108.4 66 -17
Tolueno 92.14 0.8668 0.55 0.29 2.4 1.497 285 23 0.37 -95 111 4.4
Trietilamina 0.36 0.54 1.9 1.398 275 89
Agua 18.02 0.9982 1 High 10.2 1.333 <190 1.85 0 100 N/A
Fase Móvil. Reservorios – Preparación -
Degasificado
  Reservorios de vidrio, oscuros, cubiertos de tal
forma que no ingresen partículas o polvo.
  Algunas veces se filtra el solvente.

  Grado HPLC
  Usar sonicador para desgasificar los filtros
incluidos con las mangueras de la fase móvil.
Tipos de fase móvil
  Cuando la composición de la fase móvil, se mantiene
constante, durante toda la corrida cromatográfica. Se
denomina Elución Isocrática.
  Cuando la composición de la fase móvil, varía
proporcionalmente, durante la corrida cromatográfica.
Se denomina Elución con Gradiente.
Fase estacionaria
Columnas
Columnas en HPLC
  Las columnas cromatográficas son las responsables de
la separación de una mezcla, en ella se encuentra la
fase estacionaria.
Características generales de las columnas
en HPLC
  Longitud de columna: 4 a 30 cm.
  Diámetro Interno (i.d.): 2 a 20 mm.
  Tamaño de partícula de rellenos: 3 a 50 µm.
Fases Estacionarias
  La fase estacionaria, principalmente, define el tipo de
cromatografía líquida, se dividen principalmente en dos:
  Fases Normal (FE polar, FM apolar, adsorción)

  Fases Reversa (FE apolar, FM polar, absorción)
  Adsorción vs. Reparto.
ü  Fase Normal:
-Silice o
alúmina.
-Se dejó de
usar.
  Fase reversa:
  Interacción Hidrofóbica de grupos Butilos y Anillo Fenilo, con Fase C18
Fase estacionaria
(a) (b) (c)
Solvente de Solvente de
Elución Inicial Elución Final
Concentración
Nro. Fracciones o Volumen Efluente
Fracciones secuencialmente colectadas

Cromatograma
Un pico de un cromatograma debe presentar siempre la forma

de una distribución Gaussiana.
Gracias!
Clase 2
Partes de un HPLC!
Componentes del HPLC
Desgasificador
  Se encarga de eliminar a todos los gases que se

encuentran disueltos en los solventes que son las fases
móviles.
Bombas
  Las bombas son dispositivos capaces de proporcionar a
la fase móvil la presión necesaria para que operando al
flujo o velocidad precisa, atraviese la columna
cromatográfica.
Sistema de Inyección de Muestra
  Se encarga de introducir la muestra en el cromatógrafo,
y poner a la muestra al mismo flujo que se encuentra la
fase móvil. Aquí se encuentran las bandejas 0 y 1. Se
clasifican en:
  Inyección Manual.
  Inyección Automática.
  Sistema de Inyección Manual.
  Sistema de Inyección Automático.
  Dada la naturaleza separativa y analítica de la técnica de HPLC, estos
sistemas son muy empleados en los campos de clínica e industria, donde
se requiere analizar gran número de muestras.
• Alta precisión al
momento de
inyectar la
muestra.
• Facilidad de
elaboración de
curvas de
calibración.
Horno de la Columna
  Espacio donde se coloca la columna cromatográfica.
  La columna es sometida a una variación de temperatura
para mejorar la separación.
Utiliza lámpara de
tungsteno o de
deuterio (UV).
Detector
  Se encarga de dar una señal, al momento de que inicia
la elución de un componente que ha sido separado por
la columna cromatográfica.
Detector UV-VIS
  Los detectores se pueden clasificar de la siguiente
manera:
  Detectores Universales :
  Se basan en detectar cambios en una propiedad
física, para todo tipo de moléculas.
  Detectores Selectivos :
  Son opuestos a los anteriores, detectan una
limitada serie de compuestos.
  Detectores Específicos :
  Sólo pueden responder a un muy limitado grupo de
moléculas.
ü  Detectores de Absorbancia en el UV-VIS
ü  Detector de Absorbancia con Monocromador.
Espectofotómetro de barrido, se basan n la red de reflexión de los

espejos cóncavos, y la lampara de deuterio.
ü  Detector con arreglo de fotodiodos (DAD).
Detector multicanal de fotones capaz de medir

todos los elementos de un haz de radiación
dispersada simultaneamente.
ü  Detectores de Fluorescencia.
Para la detección de vitaminas, , productos naturales y de interés farmaceutico.

  Detector de Índice de refracción.
Son detectores
universales, son
fiables, no dependen
del caudal.
Gracias!
Clase 3
Aptitudes del sistema

cromatográfico y
cuantificación con HPLC!
Otra Clasificación de la cromatografía
  La cromatografía es, en sí, una técnica de separación y

no una técnica analítica, pero se puede usar para ambos
propósitos, por eso, también podemos clasificar a la
cromatografía de la siguiente manera:
  Cromatografía PREPARATIVA (Separación y

Purificación).
  Cromatografía ANALITICA (Separación y
Cuantificación).
¿cuantificación?
  El HPLC se vuelve un método analítico cuando
puedo cuantificar el analito, para ello debo recordar
que el área del pico es proporcional a la cantidad
de analito, es por ello, que debo usar estándares, y
siempre correr mis estándares con la muestra a
analizar.
Ventajas de la Cromatografía como Técnica Analítica o
de cuantificación
v  Análisis Simultáneos
v  Alta resolución
v  Alta sensibilidad (ppm-ppb-ppt)
v  Volumen de Inyección pequeño (10-100 µL)

Cromatógrafo Líquido (HPLC)
Componentes
  Recipiente de Solventes.
  Desgasificador.
  Bomba.
  Inyector (Auto
Muestreador).
  Horno de Columna.
  Detector.
Injector Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Start Injection time
Column
Detector
Solvents
High Performance Liquid Chromatograph (HPLC)

Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
Aptitudes del sistema
  La verificación de la aptitud del sistema es una
parte integral de los métodos de cromatografía de
líquidos.
  Las pruebas se basan en el concepto de que el

equipo, los sistemas electrónicos, las operaciones
analíticas y las muestras analizadas constituyen un
sistema integral que se puede evaluar como tal.
  Los parámetros de aptitud del sistema se

determinan para el pico de la sustancia ensayada
Gracias!
Clase 4
Parámetros
cromatográficos!
Tiempo de Retención (tr)
Pero cómo determinarlo??? Qué pico elegir?

Por tanto se establece los siguientes conceptos:
Factor de asimetría (Tailing Factor)
Numero de Platos Teóricos (N)
Factor de Capacidad (k’)
Selectividad (α)
¿qué tan selectiva es una columna para separar dos picos?

Selectividad (α)
Resolución (R)
Resolución (R)
Gracias!
Clase 5
Introducción al procesador
de datos o software!
Introducción al Procesador de Datos
o Software
  Procesa los datos obtenidos (cromatogramas) para
análisis cualitativo y cuantitativo.
  Sirve además para realizar ajuste a los métodos.

Instrument control tool buttons
Cromatograma del software
Gracias!
Clase 6
Análisis cualitativo y
cuantitativo!
Análisis Cualitativo y Cuantitativo
  Análisis Cualitativo.
  Cuando un análisis es realizado bajo las mismas
condiciones analíticas, los mismos compuestos eluyen
seguramente al mismo tiempo.
Interpretación de resultados
  Cualita7vo: Si es el mismo compuesto y las mismas
condiciones de corrida, eluirán al mismo 7empo. (Ejm:
everolimus y sirolimus)
Y se podrá diferenciar enantiómeros?
https://www.agsanalitica.com/es/articulos/5/determinacion-de-quirales-por-hplc
Concentracion del
componente A es
　80ppm
  Método del Estándar Externo
Concentration
(ppm)
Componente A 100
Muestra
Problema xuL 80
Peak area　:　800
Estandar xuL  Peak area 800 1000

（Componente A Componente A
100ppm）
Peak area　:　1000
Gracias!
Clase 7
Aplicaciones del HPLC!
Fundamento
  La fase móvil es el líquido que fluye a través de la
columna que contiene a la fase estacionaria por
donde pasa la muestra la cual es separada en
diferentes compuestos.
  La separación cromatográfica en HPLC es el
resultado de las interacciones específicas entre las
moléculas de la muestra en ambas fases, móvil y
estacionaria.
  El área del pico es proporcional a la concentración
por lo que si el área del pico A es mayor que la de
B, la concentración de A es mayor a la de B.
Ventajas
  A diferencia de la cromatografía de gases la HPLC
no está limitada por la volatilidad o estabilidad
térmica de la muestra.
  La HPLC es capaz de separar macromoléculas y
especies iónicas, productos naturales lábiles,
materiales poliméricos y gran variedad de otros
grupos polifuncionales de alto peso molecular.
  La HPLC ofrece una mayor variedad de columnas
que permite una mayor gama de interacciones
selectivas y por tanto mayores posibilidades de
separación.
Aplicaciones
Fármacos: antibióticos, sedantes esteroides,
analgésicos, inmunosupresores.
Bioquímica: aa, proteínas, carbohidratos, lípidos.
Química forense: drogas, venenos, alcohol en sangre,

narcóticos.
Medicina clínica: ácidos biliares, metabolitos de

drogas, extractos de orina, estrógenos,
antimicrobianos.
Biología molecular: SNPs, discriminación entre

mutado y no mutado.
HPLC en inmunosupresores
Introducción
  Dosaje de everolimus
  Dosaje de Ciclosporina
  La terapia inmunosupresora se da a
pacientes trasplantados. Evita el
rechazo del órgano trasplantado
pero puede resultar tóxico por lo
que es necesario su dosaje.
  Everolimus interactúa con
ciclosporina.
Consideraciones
  Rango UV (nm)
  Temperatura del horno con respecto al analito.
  Fases móviles a usar, considerar solubilidad y
viscosidad.
  Tiempo de corrida en base a estándares.

  Procesamiento de la muestra y pureza de la misma.
  Tipo de columna (pequeña)
HPLC para la identificación y
cuantificación de antimicrobianos
Revista de la Facultad de Farmacia de Venezuela

Introducción
  La roxitromicina es un antibiótico que pertenece al
grupo de los macrólidos y es usado en infecciones de
gérmenes broncopulmonares como Streptoccocus,
Neumococo, Meningococo,Listeria monocitogenes,
Clostridium, etc.
  Su efecto es la inhibición del paso de la síntesis

proteica.
  Efecto bacteriostático aunque a altas concentraciones

bactericida.
Consideraciones
  Tipo de columna
  Fase móvil
  Flujo
  UV 215nm
  Tiempo de corrida.
  Método isocrático
Identificación de
proteínas y
determinación del perfil
de impurezas por HPLC
Introducción
  Cromatografía de fase reversa.
  Separación en base a la hidrofobicidad.
  Excelente resolución que se puede lograr bajo un
amplio rango de condiciones cromatográficas para
diferenciar moléculas muy parecidas
estructuralmente y también muy diferentes.
  Alta recuperación de aquí alta productividad.
Aunque puede causar la desnaturalización
irreversible de la proteína.
  Excelente reproducibilidad.
Purificación de ácidos
nucleicos con HPLC
An overview
Gracias!
Clase 8
dHPLC o HPLC
denaturante!
Fundamentos del DHPLC
  Usa la desnaturación y annealing de los amplicones de 7po
salvaje y mutado y la comparación entre sus perfiles. Ya que la
formación de homoduplex y heteroduplex se percibirán en el
HPLC.
Utilidad
  Puede detectar una sola base mismatch en fragmentos de
150 a 500 bp.
  Detecta SNPs y mutaciones, polimorfismos en el cromosoma

Y, factor IX, genes de la neurofibromatosis 7po 1, regulador
de conductancia transmembrana de la fibrosis quís7ca
(CFTR), homólogos de la fosfatasa y tensina en el
cromosoma 10 (PTEN) y en los genes BRCA1 y BRCA2
¿Qué es un heteroduplex?
¿Cómo se forman los
heteroduplex?
95ºC por 5 minutos y que baje

gradualmente hasta 4ºC y guardar a
-20ºC por 20 minutos
Ventajas
  Los productos de PCR no necesitan ser purificados para el
análisis por DHPLC.
  El analizador de DHPLC (Transgenomic Wave) presenta una

m a n i p u l a c i ó n a u t o m a 7 z a d a d e 9 6 m u e s t r a s
simultáneamente.
  Aproximadamente, 10ul (50-200ng) de producto de PCR son

u7lizados por lo que remanente de PCR (20-50ul) puede ser
usado para purificación, secuenciación u otro procedimiento
experimental.
Tipo de columna
El DNA se une a la
columna por
interacciones entre los
grupos fosfato y los
iones positivos de
Trietilamonio, que
interactuan
hidrofobicamente.
Gracias!
Clase 9
Aplicaciones del dHPLC !
BRCA genes
•  Las mutaciones en los genes BRCA I y II
determinan el riesgo de desarrollar cáncer
de mama y ovario.
•  La proteína BRCA I regula la transcripción,
recombinación, reparación de ADN y los
puntos de control del ciclo celular.
•  BRCA1 es el gen más frecuentemente
mutado en cáncer de mama hereditario.
•  La penetrancia de las mutaciones en el
gen BRCA1 es alta. Aproximadamente un
85% de personas con mutaciones en el
gen BRCA I desarrollan cáncer de mama y
hasta un 45% desarrollan cáncer de ovario Gold Standard (secuenciación)
a los 70 años.
•  Portadores de mutaciones en BRCA I
tienen mayor riesgo de padecer otros
tipos de cáncer.
1020 pacientes con
cáncer de mama y 167
control.
Se identificaron 14
mutaciones.
Se comparó con
secuenciación.
Muestras de
pacientes, 1020 extracción de ADN PCR
con cáncer de de las muestras de
mama y 167 pacientes
sanas
Formación de
heteroduplex (95ºC x
5 min y reanealing
Un solo pico, no hasta 25ºC por 50
mutados, personas Homocigotos min
con genotipo WT
DHPLC
Dos picos, personas
con mutaciones, para
identificarlas se Heterocigotos
requiere
secuenciamiento.
Temperatura del
horno
Mutaciones en los genes Ras
funciona como una proteína G intercambiadora de GDP/GTP
Guanine
nucleotide
Proteina GTPasa exchange factor
Tomada de The Biology of Cancer, Weinberg, 2007

K-RAS
  Con frecuencia en
carcinoma colorectal y
adenocarcinoma
pulmonar.
  La presencia de estas
mutaciones se
correlaciona con la
sensibilidad o
resistencia al
tratamiento con
terapias de inhibición
del EGFR.
Las regiones de mutación en K-RAS ocurren en
mayor frecuencia en los codones 12 y 13 (del
exón dos), 61 (del exón 3) y 146 (del exón 4)
Nature Genetics 38, 294 - 296 (2006)
128
Seminars in Diagnostic Pathology (2008) 25, 288-294
www.cdxmolecular.org
Mutaciones JAK2
  La mutación V617F en el
gen de la
tirosincinasa JAK2 (Janus
quinasa 2) está implicada
en la génesis de algunos
síndromes
mieloproliferativos crónicos
(SMP) como la policitemia
vera (PV), la trombosis
esencial (TE) y la
mielofibrosis (MF)
idiopática
Identificación de
microsatélites
Hacen PCR, forman heteroduplex y
corren en DHPLC.
DHPLC estandarizado para identificar
los 8 microsatélites al mismo tiempo.
Logran identificar 4.
Gracias!
Clase 10
Validación de los métodos

de HPLC!
Especificidad
  Habilidad de evaluar inequívocamente el analito
en presencia de componentes que se puede
esperar estén presentes. Esto puede incluir
impureza, productos de degradación, etc.
Linealidad
Exactitud
  Grado de concordancia entre el resultado de una
medición y el valor de referencia aceptado o
verdadero.
Precisión
  Depende sólo de la distribución de errores
aleatorios y no tiene ninguna relación con el valor
verdadero o el valor especificado.
  -Repetibilidad: precisión intermedia o

reproducibilidad intralaboratorio.
  -Reproducibilidad
Repetibilidad
  Es la medida de la precisión de un método
efectuado en las MISMAS CONDICIONES, sobre el
mismo analito, con el mismo método, con el
mismo operador, utilizando el mismo instrumento
de medida y durante un corto intervalo de tiempo.
Límite de detección (LD)
  Menor concentración o cantidad con razonable
certeza que puede ser detectada por un
procedimiento analítico dado. Concentración que
proporciona una señal en el instrumento
significativamente diferente de una muestra blanco.
Límite de cuantificación (LC)
  Es la menor concentración de analito que puede

determinarse con precisión y exactitud razonables
en las condiciones establecidas y se expresa en
unidades de concentración.
Gracias!
Clase 11
Taller 1: Problemas de
entendimiento!
Problema 1
  ¿Por qué hay diferentes w en los picos?, ¿será
necesario tantas fórmulas?
Solución
  Depende de la simetría del pico. Si el pico tiene
una distribución gaussiana, fronting o tailing.
Problema 2
  ¿Puedo tener un valor de selectividad de 1?
Solución 2
  No. Pues un valor de selectividad de 1 esta
indicando que solo hay un pico por tanto es un
mismo compuesto.
Problema 3
 
Solución 3
Si no recuerdas, mira la diapo 74

Problema 4
  ¿qué valor de selectividad preferirías uno de 1.5 o
de 1.01 para el caso de everolimus y sirolimus?
Solución 4
  Un valor de 1.5, pues indicaría que la separación de los
componentes es mejor. Por tanto se podría diferenciar
entre ambos inmunosupresores. Para que sea 1.5 se
refiere a que el segundo compuesto saldría a un t de 3
min (por ejm) y el primer compuesto a un tiempo de
2min. Por tanto hay una separación de 1min. Sin
embargo para el otro caso si el segundo compuesto sale
a un tiempo de 3 minutos el primero tendría que salir a
un t de 2.97 min, lo que dificultaría la interpretación.
Por tanto es mejor si el valor de selectividad se aleja de
1, lo que indicaría que la primera columna es más
selectiva y mejor.
Problema 5
Solución 5
Solución 5
Solución 5
Solución 5
Solución 5
Si la fase estacionaria es constante (no varía la longitud, ni el tamaño de partícula,

diámetro) podemos actuar sobre la fase móvil.
-Cambiar de eluyente, usar disolventes con mayor capacidad de elución.
Adicionar sustancias a la fase acuosa como tampones (cambio de pH y naturaleza
del tampón), pares iónicos, ligandos formadores de complejos, etc.
Variación de la temperatura.
Solución 5
-Aumentar el caudal de la fase móvil.

-Elución en gradiente.
Variando la temperatura
Gracias!
Clase 12
Taller 2: Manejo del equipo

y software!
Partes del equipo y
conexiones internas para
mantenimiento preventivo
de obstrucciones.
Cambio de columna de
HPLC
Encender el equipo y
tiempo de estabilización
Preparación de STD
Correr línea base
Diferencias entre un equipo
con automuestreador y de
inyección manual.
Importancia de la
preparación de la muestra.
Corrida de muestras.
Limpieza y mantenimiento
del equipo.
Purgado del equipo.
Preguntas de entendimiento
P1: ¿Cuál es el principal
indicio que mi columna está
sucia o que su tiempo de
vida ya está por terminar?
R1: La presión aumenta,
para que el flujo se
mantenga constante.
P2: Si el líquido es viscoso
¿qué pasa con la velocidad,
la presión, la temperatura?
R2: La velocidad debería
disminuir pero para que no
ocurra esto la presión
aumenta y la temperatura
debería aumentarse, ya que
al aumentar la temperatura,
la presión disminuye. Todo
está relacionado.
P3: ¿Cómo establezco el
tiempo de retención de la
muestra?, ¿qué pico debo
considerar?
R3: Lo establezco de acuerdo al
pico del STD. A veces pueden
aparecer varios picos, el que debo
considerar usualmente es el más
grande y el que va disminuyendo a
medida que la concentración de los
STD que coloco van disminuyendo.
Gracias!
Clase 13
Taller 3: Cálculos químicos

básicos!
La curva estándar se establece de
acuerdo al rango donde se espera se
encuentren los resultados. Por ejemplo
si los resultados usualmente se
encuentran en el rango de 30 a 50ppb.
Se recomienda que la curva estándar
conste de las siguientes
concentraciones 20, 30, 40, 50 y 60
ppb. Es recomendable que se usen al
menos 3 puntos, obviamente si hay más
puntos el sesgo es menor.
P1: A partir de un STD de
1ppm preparar un nuevo
STD de 500ppb
SOLUCIÓN 1
  1ppm= 1000ppb
  Yo elijo el V2
  C1.V1=C2.V2 1000ppb.V1= 500ppb. 10ml
  V1= 5ml
  Tomar 5ml del stock de 1ppm y enrazar con
solvente hasta 10ml
P2: A partir de un STD de
100ppb preparar un STD de
10ng/mL
SOLUCIÓN 2
  1ppb=1ng/mL
  C1.V1=C2.V2
  100ppb.V1= 10ppb. 10ml
  V1= 1ml
  Tomar 1ml del stock de 100ppb y enrazar con
solvente hasta 10ml
P3: Preparar 500ml NaOH
de 1M
SOLUCIÓN 3
  NaOH peso molecular de 40g
  M=(n/V)= (w/PM)/V
  El volumen debe estar en litros
  1= (w/40)/0.5
  despejo y hallo w en gramos
  w= 20 g
  pesar 20g de NaOH y agregarlo en 500ml de agua.
P4: Tengo un STD stock de
0.75 mg (sólido) ¿cómo
preparo a partir de ello mi
STD de 75ppm?
SOLUCIÓN 4
  1ppm=1mg/L
  75ppm= (0.75mg)/xL
  X= 0.01 L o 10 ml
  Colocar los 0.75mg del STD en 10ml de solvente.
P5: ¿qué significa preparar
una solución al 20% (p/v)?
Y al 30% (v/v)?
SOLUCIÓN 5
  20% (p/v) son 20 g del soluto A en 100ml del
solvente B y 30% (v/v) son 30 ml de la solución A
en 100ml de solución total.
P6: Si mi stock está a
500ng/mL como preparo
los siguientes STD 20, 30,
40, 50 y 60 ppb?
SOLUCIÓN 6
  500ng/mL=500ppb
  para 20; C1.V1=C2.V2; 500ppb. V1= 20ppb.2000uL;
V1=80uL
  para 30; C1.V1=C2.V2; 500.V1=30.2000uL; V1= 120uL

  para 40; C1.V1=C2.V2; 500.V1= 40. 2000uL; V1=
160uL
  para 50; C1.V1=C2.V2; 500.V1=50.2000uL; V1= 200uL

  para 60; C1.V1=C2.V2; 500.V1=60.2000uL; V1= 240uL
P7: Los valores de mi curva
STD arrojan un R de 0.65
2
¿qué puedo decir de la

curva?
SOLUCIÓN 7
  Es mejor repetirla, la curva debe tener un R2
cercano a 1.
P8: Los valores del área de la
curva de la pregunta 6 son
25, 35, 45, 67 y 70
respectivamente y el valor del
área del pico de mi muestra
es de 48. Según esto ¿cuál es
la concentración de mi
muestra en ng/mL?
SOLUCIÓN 8
  La curva al colocarla en Excel (usando el área del
pico como ordenada y la concentración como
abscisa) sale como en la figura. Usando eso puedo
calcular la concentración si el área es de 48. Para
ello reemplazo en la fórmula 48= 1.22x -0.4.
Siendo x la concentración de mi muestra igual a
39.67 ppb o 39,67 ng/mL.
80
70
y = 1.22x - 0.4
R² = 0.95952
60
á
r 50
e
a
d
e 40
l Serie1
p
i Lineal (Serie1)
c 30
o
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70
Concentración
y sería recomendable eliminar algún STD ¿Cuál se eliminaría?,

¿cambiaría en algo la curva?, ¿cuál de ellas es mejor?
Gracias!
Clase 14
Taller 4: Establecimiento y
entendimiento de la curva
estándar!
  Considerando la tabla 2 del paper.
  1.- ¿Es el método exacto? Si el VR es la media
  2.- ¿Es el método preciso?
  3.- ¿Me dice algo el valor de su desviación STD
relativa?
S1 1.- ¿Es el método
exacto? Si el VR es la media
  Exactitud.- Grado de concordancia entre el
resultado de una medición y el valor de referencia
aceptado o verdadero.
  Si el valor de referencia es la media. Podemos decir

que para los valores 3 y 4 es más exacto. Mientras
que es menos exacto para el 5 pues se aleja del
valor de referencia.
S2 2.- ¿Es el método
preciso?
  Precisión.- Depende sólo de la distribución de
errores aleatorios y no tiene ninguna relación con el
valor verdadero o el valor especificado. Relacionado
a repetibilidad.
  El método es repetible pero no del todo preciso.

S3 3.- ¿Me dice algo el valor
de su desviación STD
relativa?
  Tiene una desviación STD menor al 2% por tanto
se confirma la precisión del sistema analítico.
  Según la tabla 1
  4.- ¿ es necesario repetir el experimento? En que
factor me puedo basar
  5.- El experimento ¿es lineal?

S4 4.- ¿ es necesario repetir el
experimento? En que factor me
puedo basar
  No es necesario repetir el experimento porque el
coeficiente de correlación R2 es 0.999. Si es
cercano a 1 es mejor.
S5 5.- El experimento ¿es
lineal?
Si es lineal 2000000
por el valor 1800000 y = 117183x - 2163.6
del R2 y 1600000
R² = 0.99999
además al 1400000
colocarla en
Área del pico
1200000
excel
obtenemos 1000000
Serie1
los sgte que 800000
Lineal (Serie1)
se aproxima 600000
a una línea 400000

recta. 200000
0
0 5 10 15 20
Concentración
Gracias!

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Curso: Fundamentos del

HPLC y sus aplicaciones en

La Cromatografía, es un método físico de separación donde el soluto se

 La cromatografía líquida, es aquella en la cual la fase

 La longitud de la columna es entre 4 y 25 cm

Es un líquido (solvente orgánico o agua), el cual puede estar

Fuerza Indi. de Número de Pto. de

1,2-Dicloroetano 98.96 1.2521 0.78 0.44 3.5 1.442 230 - -35.7 83 13

Acido Acético 1.1 6 1.37 235 118

Disulfuro de Carbono 0.34 0.15 0.3 1.626 380 46

Tetracloruro de Carbono 0.9 0.18 1.6 1.457 265 77

Clorobenceno 0.8 0.3 2.7 1.525 21 132

Ciclopentano 0.42 0.05 -0.2 1.406 200 -103.5 49 -20

Fluoroalcanos -0.25 <-2 1.25

Indice de Número de Punto de Punto de

Heptano 100.2 0.6838 0.4 0.01 0.2 1.388 195 29 0 -90.6 98 -4

Acetato de n-Butilo 0.73 0.4 4 1.394 254 22 126

n-Butil Eter 0.64 0.25 2.1 1.397 220

N-Metil Pirolidona 1.67 0.7 6.7 1.468 285 202

Pentano 72.15 0.6262 0.22 0 0 1.355 195 - -129.7 36 -48

Eter de Petroleo 0.3 0.01 0.1 1.39 210 29

n-Propanol 60.1 0.8036 1.9 0.8 4 1.386 240 1.55 -126.2 97 15

Trietilamina 0.36 0.54 1.9 1.398 275 89

 Algunas veces se filtra el solvente.

 Fases Normal (FE polar, FM apolar, adsorción)

Fracciones secuencialmente colectadas

Un pico de un cromatograma debe presentar siempre la forma

 Se encarga de eliminar a todos los gases que se

Espectofotómetro de barrido, se basan n la red de reflexión de los

Detector multicanal de fotones capaz de medir

Para la detección de vitaminas, , productos naturales y de interés farmaceutico.

Aptitudes del sistema

 La cromatografía es, en sí, una técnica de separación y

 Cromatografía PREPARATIVA (Separación y

v Alta sensibilidad (ppm-ppb-ppt)

v Volumen de Inyección pequeño (10-100 µL)

Start Injection time

High Performance Liquid Chromatograph (HPLC)

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

 Las pruebas se basan en el concepto de que el

 Los parámetros de aptitud del sistema se

Pero cómo determinarlo??? Qué pico elegir?

¿qué tan selectiva es una columna para separar dos picos?

 Sirve además para realizar ajuste a los métodos.

Estandar xuL Peak area 800 1000

Aplicaciones del HPLC!

Bioquímica: aa, proteínas, carbohidratos, lípidos.

Química forense: drogas, venenos, alcohol en sangre,

Medicina clínica: ácidos biliares, metabolitos de

Biología molecular: SNPs, discriminación entre

  La cromatografía líquida, es aquella en la cual la fase

  La longitud de la columna es entre 4 y 25 cm

  Algunas veces se filtra el solvente.

  Fases Normal (FE polar, FM apolar, adsorción)

  Se encarga de eliminar a todos los gases que se

  La cromatografía es, en sí, una técnica de separación y

  Cromatografía PREPARATIVA (Separación y

v  Alta sensibilidad (ppm-ppb-ppt)

v  Volumen de Inyección pequeño (10-100 µL)

  Las pruebas se basan en el concepto de que el

  Los parámetros de aptitud del sistema se

  Sirve además para realizar ajuste a los métodos.

Estandar xuL  Peak area 800 1000

  Tiempo de corrida en base a estándares.

  Su efecto es la inhibición del paso de la síntesis

  Efecto bacteriostático aunque a altas concentraciones

  Detecta SNPs y mutaciones, polimorﬁsmos en el cromosoma

  El analizador de DHPLC (Transgenomic Wave) presenta una

  Aproximadamente, 10ul (50-200ng) de producto de PCR son

  -Repetibilidad: precisión intermedia o

  Es la menor concentración de analito que puede

  para 30; C1.V1=C2.V2; 500.V1=30.2000uL; V1= 120uL

  para 50; C1.V1=C2.V2; 500.V1=50.2000uL; V1= 200uL

  Si el valor de referencia es la media. Podemos decir

  El método es repetible pero no del todo preciso.

  5.- El experimento ¿es lineal?