Ud M- “ EXTRACCION Y PURIFICACION DE ACIDO GIBERELICO" INFORME FINAL DE SERVICIO SOCIAL. TRABAJO REALIZADO EN LAS INSTALACIONES DEL DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA DE LANFI. EFECTUADO POR: LAURA OFELIA banacto FLORES S , |ASESORADO POR: DR. GUILLERMO LARIOS DE ANDA Ina, Broquima tn Tadveted MAYO 1991CONTENIDO 1 TITULO 2 INTRODUCCION 3 GENERALIDADES 3:1 GIBERELINAS 8.1.1 ESTRUCTURA QUIMICA Y PROPIEDADES ¢ 3.1.2 PRODUCCION DE ACIDO GIBERELICO 3.1.3 USOS ‘3.2 PRINCIPIOS DE EXTRACCION LIQUIDA 3.2.1 ANTECEDENTES 3.2.2 DEFINICION 9.2.3 COEFICIENTE DE PARTICION 98.2.4 FACTOR DE EXTRAGCION 33 OBJETIVO GENERAL 4 MATERIAL Y METODOS 4.1 MATERIAL 42 CUANTIFICACION DE ACIDO GIBERELICO ‘4.2.1, CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA 4.22 CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION, 5 EXPERIMENTO 1: EXTRACCION PRELIMINAR 8.1 OBJETIVO 6.2 METODOLOGIA 6.3 RESULTADOS Y DISCUSION 6 EXPERIMENTO 2: PURIFICACION ADICIONAL, 6.1 OBJETIVO 62 METODOLOGIA 63 RESULTADOS Y DISCUSION . 7 EXPERIMENTO 3: OPTIMIZACION DE LA TECNICA 7.4 OBJETIVO + 7.2 METODOLOGIA : 7.3 RESULTADOS Y DISCUSION 8 CONCLUSIONES GENERALES 9 RESUMEN 10 BIBLIOGRAFIA CITADA1 TITULO: "EXTRACCION Y PURIFICACION DE ACIDO GIBERELICO * TF aE a2 INTRODUGCION Los reguladores de crecimiento vegetal 6 fitohormonas son ~ gustancias que intervienen en el metabolismo de las plantas, activando o deprimiendo alguna etapa de su desarrollo. Esta caracteristica de las fitohormonas las hace atractivas desde el punto de vista comercial, con un mercado que comprende cerca del 65 % de los agroquimicos (4). El acido giberélico (GA3), con su amplio campo de accién forma parte importante de este grupo. El &cido giberélico se produce idustrialmente via microbiana por fermentacién sumergida de! hongo Giberella fulikurol. La separacién de este dcido organico es muy importante desde el punto de vista econémico; la rentabilidad de un proceso industrial basado en la fermentacién sumergida Gepende del buen disefio de la fermentacién y de la separacién del principio activo. Estas dos etapas tienen igual importancia, puesto que no es Comercialmente atractiva una tecnolgia fermentativa sin un buen método de extraccién. Se ha reportado que la extracci6n y purificacién de Acido giberélico Puede representar un porcentaje considerable en el costo total de! proceso (8). Los problemas que encontramos en la extraccién y purificacién del Acido giberélico son la baja concentracion en que se presenta en el medio de cultivo final y la presencia de sustancias extrafias como Acido acético, lactico ademas de otras giberelinas. © El objetivo de este trabajo fué obtener cristales de Acido giberélico con pureza igual o mayor al 90 % ar paftir del caldo de fermentacién. Este trabajo forma parte de un proyecto global de investigacién, realizado por el Departamento de Biotecnologia de LANFI. En este informe de servicio social se presentara el trabajo seguido que nos llevé a seleccionar la metedologia para la recuperacién de obtencién de cristales con pureza mayor 6 igual a 90 %.3 GENERALIDADES 3.1 GIBERELINAS 3.1.1 ESTRUCTURA QUIMICA ¥ PROPIEDADES. : — Las giberelinas son Acidos diterpenoides basados en el esqueleto de giberelano que contiene un niicleo llamado gibano (fig.2) (11). Este grupo incluyen compuestos como cido giberélico 6 giberelina 3, giberelina 4 y giberelina 7. Estos son los més importantes de un grupo de 51 giberelinas conocidas (15). Las diferencias extructurales entre elias residen en los diferentes substituyentes en las posiciones 4a, 7, 8, y la ausencia 6 presencia del anillo lacténico gama. En este grupo el Acido giberélico es el més importante comercialmente. Es un constituyente natural de las plantas, capaz de producir profundos efectos fisiologicos y morfolégicos en ellas a muy bajas concentraciones. Quimicamente se define (2) como un Acido tetraciclico dihidroxilact6nico . Su estructura se muestra en la figura 3. 7 7H co th to * Figura 2 " GIBERELANO LX @ of KEK en, CHa “Fgura 3 ACIDO GIBERELICO Férmula molecuter: C 18 H 22 O 6. P.F.: 221-230 C(Merck 1989). Solubilidad: soluble en etanel,‘metanol, acetona, solucién lig. alcalinas y acetato. Lig. soluble en agua y éter. Rotacién éptica: +83 (c.. en etanol). A pH basico es un &cidomonobasico de pK=4. Monometil éster: P:F:209-210 C. Rotacién dptica: +75 (c..0.5 en etanol). Derivado acetilado: P.F.: 233-234 C. Rotacién éptica: +1850 (c.. 0.4 en etanol).Estabilidad y degradacién: Las giberelinas generalmente son estables en agua, pero GA3 es uno de los menos estables en este medio. Acido mineral diluido lo convierte en Acido alogiberélico que calentado a 100 C forma dcido gibérico, El tratamiento con alcali diluido lo convierte a un isémero (16). 3.1.2 PRODUCCION DE ACIDO GIBERELICO Sustancias del tipo de giberelinas han sido encontradas en bacterias, hongos, algas y muchas plantas superiores. Sin embargo giberelinas libres caracterizadas quimicamente se_han extraido sélo del microrganismo Giberella fullkuroi al que también se le ha llamado Fusarium moniliforme 6 Fusarium gxisporum . Se ha reportado que Fusarium moniliforme es el estado imperfecto de Giberelia_fujikurol (15). Las giberelinas pueden producirse por fermentacién liquida (7) 6 Sélida del microorganismo Giberella_fulikurol (8,9), aunque solo se produce comerciaimente por cultivo sumergido. Se han hecho mejoras de cepas por metodos de mutacién como radiacién ultravioleta, neutrones répidos 6 tratamientos con rayos gama (7).3.1.3 USOS La capacidad del dcido giberélico de producir efectos en Ia fisiologia de las plantas se explota para mejorar cualquier tecnologia que involucre el manejo de materia prima vegetal. En la tabla 3.1 -se.ilustran-aigunas de las | aplicaciones de acido giberélico y su efecto. TABLA 3.1. USOS COMERCIALES DEL ACIDO GIBERELICO. CAMPO DE APLICACION EFECTO Industria Cervecera Reduce el tiempo de malteado Cultivo de fa uva ‘Aumenta el tamatio de los y manzana frutos y mejora su presentacién. Produccién de citricos Retarda la maduracién y evita la descomposicion de lacorteza. Cultivo de hortalizas y Induccién de la floracién plantas ornamentals Cultivo de gramineasy ——_Estimulante de la germina- hortalizas cién y crecimiento {Larque.1988) :3.2 PRINCIPIOS DE EXTRACCION LIQUIDA 3.2.1 ANTECEDENTES El proceso original para el aislamiento de giberelina consistia en adsorcion de carbén, seguido por elucién con solvente, usualmente acetona. La elucién del carbon (previamente secado hasta 20 - 30 % de humedad) se realizaba con acetona y agua. A esto seguia una purificacién con acetato de etilo y solucién buffer. Esta técnica presenta la desventaja de usar un solvente caro como la acetona (7). Borrow et al (3) describe un método en el que la purificacién se realiza por medio de {a elucién de carbén con metanol amoniacal. Otra opcién consiste en el uso de resinas de intercambio iénico, en el cual los componentes dcidos diferentes de las giberelinas se diluyen tratando con dlcali, seguido por el uso de resinas de intercambio aniénico y elucién con amonio 6 soluciénes butfer. Sin embargo, el imperante de obtener mejores rendimientos hizo que se desarrollaran los métodas de extraccién con ‘ solventes, en donde los ésteres organicos son usados para procesos a escala comercial (7). 3.2.2 DEFINICION La extraccién liquida es un método de separacién cuyo principio radica en la distribucién del soluto en-doé fases inmiscibles, frecuentemente agua yun solvente organico. Esta medida de la distribucién del soluto en dos fases se llama coeficiente de particion (1). 3.2.3 COEFICIENTE DE PARTICION « Cuando una sustancia en solucién se pone en contacto con una segunda fase inmiscible, la sustancia tiende a distribuirse entre las dos fases. Este fenémeno se explota en las operaciones de extraccién liquido-liquido, pues provee de un método por medio del cual el-soluto deseado puede ser extraidoselectivamente de una solucién en la que se presentan otras impurezas indeseables. El grado en que se presenta la redistribucién del soluto se rige por condiciones termodinémicas, y depende de interacciones moleculares entre el soluto y los solventes individuales. Esto se cuantifica en términos del Coeficiente de particién, que puede definirse como sigue (1). P= C-solvente / C-alimentacién donde C-solvente y C-alimentacién son las concentraciones en el equilibrio del soluto deseado en las fases del solvente y la alimentacin respectivamente. En general, el coeficiente de particién es funcin de los niveles de concentracién presentes en el sistema. La particién del soluto se ve afectado fuertemente por medio de Propiedades de la solucién (vg. pH, fuerza iénica, etc.). También puede modificarse por medio de aditivos que interactuan con el soluto o el solvente para causar cambios en la distribucién de soluto entre las fases. 3.2.4 FACTOR DE EXTRACCION El coeficiente de particién puede usarse para determinar las concentraciones relativas de un soluto en dos fases inmiscibles en el equilibrio, pero por si solo no define el grado de separacién real; esto también esta gobernado por los voltimenes relatives de las dos fases. Evidentemente, a medida que se aumenta el volumen del solvente, una mayor proporcién det soluto se presentaré en el solvente y la fase acuosa tendré menos soluto. El grado de separacién 6 factor de extraccién puede definirse como: FE = (CP V-solvente)/V-alimentado que da efectivamente las capacidades de las dos fases para el soluto bajo condiciones de equilibrio. Aqui V-solvente y V-alimentacién son el volumen del solvente y de la fase alimentada, respectivamente. De esta relaci6n es evidente que a mayor coeficiente de particién seré menor la cantidad de solvente requerida para alcanzar el grado de separacién deseado, y lo que es mas importante, mayor serd la concentracién del soluto en el extractante. Este efecto concentrante es deseable si el producto final es un material puro.La separacién de una substancia de un solvente a otro es de poco interés. El valor de la extraccién liquida radica en la posibilidad de separar dos 6 més substancias basadas en su diferencia en particién. Siun soluto tiene un CP mucho mas grande de 1 y el otro es mucho menor de 1, una sola extraccién causara una separacién completa. Esto sucede si los dos solutos son muy diferentes quimicamente, y en este caso sin duda pueden separarse los dos solutos més facilmente por otro meétodo. La extraccién liquida es adecuada para la separacién de compuestos con semejanza quimica siempre y cuando tengan diferencias en cuanto a su valor de CP. Si los dos solutos tienen CP similares una sola extraccién causaré una separacién parcial con un enriquecimiento de un soluto en un solvente y un enriquecimiento de un soluto en el otro solvente, Para hacer una separacién adecuada, debemos repetir el proceso varias veces. También la modificacién de propiedades de solucién (PH, fuerza iénica) puede crear diferencias en el CP de los solutos, aumentando asila eficiencia de extraccién. 3.3 OBJETIVO GENERAL Optimizacién de la. técnica de extraccién_y_purificacién de cido giberélico a nivel de laboratorio, a partir de un caldo de fermentacién, para obtener cristales con pureza igual 6 mayor del 90 %.———— eee 4 MATERIAL Y METODOS ] 4.4 MATERIAL : ACETATO DE ETILO. T.J. BAKER CARBON ACTIVADO. T.J. BAKER ETER. MERCK : | SOLUCION DE HCI.1.N | REACTIVOS 7 | | ! SOL. DE NaOH .1N SULFATO DE SODIO HEPTAHIDRATADO. T.J. BAKER. CLORURO DE SODIO. T.J. BAKER MATERIAL 2MATRACES ERLENMEYER DE 500 mi. 2MATRACES ERLENMEYER DE 300 mi. 1 VASO DE PRECIPITADOS DE 3 tt. PAPEL WHATMAN #42 EMBUDO DE SEPARACION DE 500 mi. EMBUDO BUCHNER MATRAZ KITASATO. MATRAZ DE BOLA AGITADOR MAGNETICO. “ TUBOS PARA CENTRIFUGA EQUIPO CENTRIFUGA DE CILINDRO Bw oH 7 i CENTRIFUGA CLINICA oy ROTAVAPOR 4 BOMBA DE VACIO EQUIPO FISCHER DE MEDICION DE PUNTO DE FUSION POTENCIOMETRO¢ 4.2 CUANTIFICACION DE ACIDO GIBERELICO 4.2.1 CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA REACTIVOS FASE MOVIL : BENZENO ACETATO DE ETILO ACIDO PROPIONICO ~ SOLUCION REVELADORA: ETANOL ACIDO SULFURICO CONCENTRADO MATERIAL ‘SILICON -CROMATOFOLIOS DE SILICA GEL # MERCK 5555 EQUIPO “CUBAS PARA CROMATOGRAFIA HORNO MICROJERINGA DE 100 MICROLITROS LAMPARA DE LUZ ULTRAVIOLETA 1. PARA ANALISIS DE CRISTALES SE DISUELVE LA MUESTRA EN ACETATO DE ETILO. EN EL CASO DE MUESTRAS ACUOSAS (vg CALDO DE FERMENTACION) SE APLICAN DIRECTAMENTE. 2. SE TOMAN 3 MICROLITROS DE LA MUESTRA Y SE APLICAN SOBRE EL CROMATOFOLIO, SECANDO EL LUGAR DE APLICACION DE LA MUESTRA CON AIRE. 3. AGREGAR A LA CUBA PARA CROMATOGRAFIA LA FASE MOVIL, TAPANDO. YY SELLANDO CON SILICON.4. DEJAR REPOSAR LA CUBA CON LA FASE MOVIL POR 30 MIN. PARA PERMTIR LA SATURACION. 5. COLOCAR EL CROMATOFOLIO ENLA CUBA Y DEJAR CORRER LA FASE. MOVIL HASTA QUE LLEGUE A 1 CM DE LA PARTE SUPERIOR. 6. REVELAR EL CROMATOFOLIO ESPREANDO CON LA SOLUCION REVELADORA. 7. SECAR EN HORNO A 110 C POR 10 MINUTOS. 8 EN UN CUARTO OBSCURO ILUMINAR LA PLACA CON LUZ ULTRAVIOLETA. SE LOCALIZA LA MANCHA ELIPSOIDAL QUE ESTA A LA ALTURA DEL ESTANDAR Y SE MARCA CON LAPIZ LOS EXTREMOS DEL EJE MAYOR Y MENOR DE LA ELIPSE. 9. SE MIDE LA DISTANCIA DE LOS EJES MAYOR Y MENOR, SE CALCULA EL AREA DE LA ELIPSE Y SE OBTIENE LA CONCENTRACION DE LA MUESTRA POR MEDIO DE UNA ECUACION DE CALIBRACION. 4.2.2 CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION EQUIPO CROMATOGRAFO HPLC DETECTOR DE ONDA VARIABLE UV. REGISTRADOR COLUMNA M-BENDAPAK C. (WATER AS50510 P/N 2734) MEMBRANAS POLICARBONADAS(.45 MICHAS) * REACTIVOS a METANOL DESTILADO EN VIDRIO O EQUIVALENTE SOLUCION AL .5 % DE KH2PO4 GRADO ANALITICO SOLUCION DE ACIDO FOSFORICO AL 8.5.% PESO ESTANDAR DE ACIDO GIBERELICO IRSPREPARACION DE FASE MOVIL: MEZCLAR 70 % VOLUMEN DE KH2P04 Y 25 % VOLUMEN DE CH3OH. FILTRAR, DEGASIFICAR Y DEJAR QUE ALCANZE TEMPERATURA AMBIENTE. CONDICIONES CROMATOGRAFICAS: 1. VOL. DE INYECCION 20 MICROLITROS. 2. FLUJO = 2mi/min 3. DETECTOR UV A 204 nm. 4, TEMPERATURA AMBIENTE. 5. RANGO 0.4 AUPS EN EL REGISTRADOR. PREPARACION DEL ESTANDAR: PESAR CON CUIDADO 50 mg. DE ACIDO GIBERELICO IRS EN UN FRASCO VOLUMETRICO DE 100 mi: DILUIR A VOLUMEN CON FASE MOVIL NO FILTRADA Y MEZCLAR. PREPARACION DE ENSAYO: 1. PESAR CON CUIDADO 50 mg. DE LA MUESTRA EN UN FRASCO VOLUMETRICO DE 100 mi. DILUIR A VOLUMEN CON FASE MOVIL NO FILTRADA Y MEZCLAR. PRUEBA DE ADECUACION DEL SISTEMA: CROMATOGRAFIAR —INYECCIONES POR DUPLICADO DE wv PREPARACION ESTANDAR Y DETECTAR UN PICO CON TIEMPO DE RETENCION DE ENTRE 7 Y9 MINUTOS. LA RESPUESTA DEL PICO PARA LAS INYECCIONES DUPLICADAS NO DEBE VARIAR POR M&S DEL 2 %. SI ESTA PRECISION NO SE OBTIENE, CONTINUAR INYECTANDO LA PREPARACIONESTANDAR HASTA QUE ESTE 2% DE CONCORDANCIA SE OBTENGA PARA INYECCIONES SUCESIVAS. PROCEDIMIENTO: INYECTAR EXACTAMENTE EL MISMO VOLUMEN DE CADA PREPARACION DE ENSAYO Y CROMATOGRAFIAR POR 20 min. APROXIMADAMENTE. MEDIR EL PICO DE RESPUESTA PARA GIBERELINA 3 ( TR = 7-9 min.) OBTENIDO CON LA PREPARACION ESTANDAR OBTENIDO DE LA PRUEBA DE ADECUACION DEL SISTEMA PARA EL CALCULO. CALCULOS: A NMI [ANDAR X_PURI RESPUESTA DE GASENESTANDAR =mgPRUEBA ESTANDAR 5 EXPERIMENTO 1: EXTRACCION PRELIMINAR. 5.1 OBJETIVO *™ Ensayar una técnica de extraccién y purificacin de &cido giberélico a nivel de laboratorio previamente establecida. * Identificar los parémetros clave del proceso. * Proponer modificaciones en los parametras que mejoren Ja pureza de los cristales de Acido giberético.5.2 METODOLOGIA Con [a siguiente metodologia nos proponemos hacer una ‘extraccin de todas las giberelinas presentes en el caldo. Esto corresponde a la Primera etapa del proceso de extraccién, a la que hemos denominado etapa de ‘extraccién preliminar — 1 It. DE CALDO DE FERMENTACION DEL. MICROORGANISMO Giberella fujkuroi FILTRAR EL CALDO DE FERMENTACION CON GASA FILTRAR CALDO CON PAPEL WHATMAN # 42 AJUSTAR A pH = 4 CON NaOH 1N CENTRIFUGAR EN CENTRIFUGA DE CILINDRO ‘A8000 RPM 10 min. AJUSTAR A pH = 2CON HCI1N _ ENBANO DE HIELO EXTRAER CON ACETATO DE ETILO 100 ml POR 250 mi DE CALDO FASE ACUOSA FASE ORGANICA DECOLORAR CON CARBON ACTIVADO Y FILTRAR (0.65-0.75 g/t) EVAPORAR EL EXTRACTO HASTA SEQUEDAD A PRESION REDUCIDA (60 C) AGREGAR 5 ml DE ACETATO DE ETILO Y REEVAPORAR (CRISTALIZAR EN SOLUCION DE ETER-ACETATO DE ETILO5.3 RESULTADOS Y DISCUSION ones ‘Durante la realizacién de fos experimentos de. extraccién v