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Microscopia y tinciones

Primer semestre 2018


Dra. Claudia Reinoso
claudiareinoso2001@gmail.com
Objetivos de la clase

Reconocer los fundamentos y componentes del microscopio óptico.

Criterios de evaluación

1.- Reconoce los componentes del microscopio óptico.


2.- Reconoce las tinciones básicas en la microscopia.
3.- Reconoce y describe macrofotografías generadas desde un microscopio
óptico y electrónico (transmisión y barrido).
Microscopía

Microscopio simple

• Poseen una lente convergente.


• Se obtiene una imagen virtual
derecha y aumentada.
• Ventaja: luminosidad.

van Leeuwenhoek (200x)

Este efecto de convergencia genera una imagen virtual de manera que el objeto es observado a
mayor tamaño que el original.
Microscopía

Microscopio compuesto
Combina dos lentes simples convergentes:
un objetivo y un ocular. Se logran aumentos de
1500X.
Microscopio óptico compuesto

1655 Hooke utilizó un


microscopio compuesto para
descubrir pequeñas celdillas
(corcho), a las que llamó células.
Microscopio óptico compuesto

El principio óptico de un microscopio compuesto se basa en aplicar este proceso con dos
lentes. La imagen intermedia que se genera entre el objetivo y el ocular recibe el nombre de
imagen real. La siguiente figura muestra de forma esquemática como se genera la imagen
virtual de la muestra que es observada a través del ocular del microscopio.

https://www.mundomicroscopio.com/aumento-del-microscopio/
Microscopio óptico compuesto

Sistema mecánico

Revólver Tubo

Platina Columna
o brazo

Tornillos macrométrico
y micrométrico

Píe
Microscopio óptico compuesto

Sistema óptico

• Sistema iluminación: fuente de


luz, condensador y diafragma.

• Lentes: objetivos y oculares.


Microscopio óptico compuesto: LUZ

Rayos luminosos
Lente ocular

Lente objetivo
Muestra
Condensador
Rayos luminosos
Parámetros ópticos

1.-Aumento o amplificación

2.-Poder y límite de resolución

3.-Contraste (tinciones)
Amplificación o aumento

Aumento del tamaño de la imagen haciendo visibles al ojo


humano detalles nítidos no visibles a simple vista.

Imágenes resultantes del uso de objetivos con diferentes aumentos (especificados en las
imágenes) al observar un epitelio estratificado plano queratinizado.

http://mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/6-optico.php
AMPLIFICACIÓN*
Tipo de Microscopio
Lente Lente
TOTAL
objetivo ocular
Microscopios ópticos
Débil seco 10x x 10x 100x
Fuerte seco 40x x 10x 400x
Aceite de inmersión 100x x 10x 1.000x
Microscopios electrónicos
Transmisión (MET) ~200.000x
Barrido (MEB) ~10.000x
*
10x = aumenta 10 veces
Poder y limite de resolución
Poder y limite de resolución
Depende de:
• Longitud de onda de la luz incidente: a menor longitud de onda, mejor
resolución.

• Índice de refracción del medio que se encuentra entre la muestra y el objetivo


(p. e.: aire o aceite de inmersión).

Los objetivos de inmersión tienen un


poder de resolución mayor, ya que
utilizan una sustancia viscosa como
el aceite (índice de refracción=1,5)
frente al aire (índice de
refracción=1).
Aceite de inmersión
Tipos de Microscopio óptico

 Campo claro
 Campo oscuro
 Contraste de fases
 Fluorescencia
 Confocal
 Invertido
1. CAMPO CLARO
•La luz colectada por el objetivo forma
una imagen contra un fondo brillante.

•Es la forma más simple de microscopía


donde la luz pasa a través de o es
reflejada por el espécimen.

•La iluminación no se altera por


estructuras adicionales que cambien las
propiedades de la luz (como
polarizadores o filtros).

•Para mejorar contraste se usan


tinciones.

•No es muy útil para células vivas sin


teñir o secciones de tejido sin teñir.
2. CAMPO OSCURO
Treponema pallidum,
Bacteria causante de la sífilis.

 El objetivo recibe la luz dispersa


o refractada por las estructuras
del espécimen.

 También permite visualizar


células vivas sin teñir.
Células
 Aplicaciones: observación de epiteliales.
estructuras externas, (flagelos y
cilios), células móviles y
procesos fisiológicos como
mitosis y migración celular.

 Desventaja: menos detalles


internos que la microscopia de
contraste de fases.
Cristales de azúcar
3. CONTRASTE DE FASES
 Diferencias de índices de refracción de distintas partes de una célula o
tejido.
 Zonas oscuras regiones más densas del espécimen y zonas claras zonas
menos densas.
 Se utiliza para observar células vivas, tejidos vivos y cortes semifinos
no coloreados.

Micrografías de una neurona en campo claro (izquierda) con detalles casi invisibles y con iluminación de contraste de fases
oscuro o positivo (derecha) en el que los detalles son más evidentes en un fondo claro.
Micrografía de células epiteliales en cultivo mediante la
técnica de contraste de fases brillante o negativo, en la cual
los detalles y bordes de las células aparecen brillantes
(debido a un halo de difracción) en un fondo oscuro.
4.-FLUORESCENCIA
 Al iluminar materiales fluorescentes con luz ultravioleta de longitud de onda
corta (invisible), devuelven luz visible, intensamente brillante contra un fondo
oscuro.

 El microscopio debe modificarse con filtros especiales para iluminar la


preparación con luz ultravioleta de longitud de onda corta.

 Lo que se desea observar debe teñirse con colorantes denominados


fluorocromos.

 Algunos fluorocromos se unen directamente a los microorganismos o se une


a anticuerpos (proteínas producidas por el sistema inmune capaces de unirse a
microorganismos específicos).

 Aplicaciones: Marcaje de moléculas en células y tejidos para su caracterización e


identificación, estudio de células normales y patológicas, estudios inmunológicos.
Micrografías de fibroblastos, tomadas con un microscopio de
fluorescencia.
5.-MICROSCOPIO ÓPTICO INVERTIDO

•Un microscopio invertido está al revés


comparado con un microscopio óptico
convencional.

•La fuente de luz y el condensador están


sobre la plataforma apuntando hacia
abajo.

http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/minvertido.htm
MICROSCOPIA ELECTRÓNICA

 Utiliza electrones en lugar de fotones o


luz visible para formar imágenes.

 Permite alcanzar una capacidad de


aumento superior a los microscopios
convencionales (1000000X).

 Presenta mayor poder de resolución


que el microscopio óptico.

 Los hay de dos tipos:


 De transmisión
 De barrido.
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN (MET)
 Emite un haz de electrones dirigido a la muestra. Los electrones rebotan o
son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen
aumentada de la muestra.

 Para utilizar un MET debe cortarse la muestra en capas finas, (deshidratada


y tratada con sales metálicas) no mayores de un par de miles de angstroms.

 Amplificación: hasta un millón de veces.


1 Å= 1 x 10-10 m = 0,1 nm

 Solo genera imágenes en blanco y negro.

 Aplicaciones: virus, estructuras subcelulares, bacterias,etc.


Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM)
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO (MEB)

 La luz se sustituye por un haz de electrones, las lentes por


electroimanes y las muestras se hacen conductoras metalizando su
superficie.
 La muestra es recubierta con una capa de metal delgado, y es barrida
con electrones enviados desde un cañón. Un detector mide la
cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona
de muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones,
proyectados en una imagen de TV.
 Permite obtener imágenes de gran resolución en materiales pétreos,
metálicos y orgánicos. Su resolución está entre 3 y 20 nm,
dependiendo del microscopio.
 Para ver estructuras de organismos intactos, e incluso estructuras
internas con detalles reales.
Microscopía Electrónica de Barrido (MEB)
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE
TRANSMISIÓN (MET) BARRIDO (MEB)
El haz de electrones atraviesa la El haz de electrones no atraviesa la
muestra. muestra.
La imagen se forma por la dispersión La imagen se forma por el reflejo del
de los electrones en función del haz de electrones al incidir sobre la
espesor, de la densidad molecular y superficie de la muestra en función
del n° atómico de los átomos de la del relieve: IMAGEN
muestra. TRIDIMENSIONAL.

Se le añaden sales metálicas para Previamente a la observación se


acentuar la dispersión electrónica. realiza la vaporización de un metal
pesado.
TÉCNICAS DE ESTUDIO CITOLÓGICO
TINCIONES

• Células y tejidos  incoloros  tinciones: mejorar el contraste.

• Muestras de tejido  fijada en formalina, luego se realizan


inclusiones en parafina y se hacen cortes finos con un
micrótomo.

• Tinciones  colorantes: hidrosolubles


afinidades electroquímicas
tiñen células y componentes celulares
Colorantes
orgánicos
afinidad diferencial

Se combinan Se combinan
con estructuras Catiónicos o básicos Aniónicos o ácidos con estructuras
con carga negativa con carga positiva
en la célula Azul de metileno en la célula
eosina

Safranina Fucsina ácida

Cristal violeta

Verde malaquita

Fucsina básica

hematoxilina
TIPOS DE COLORANTE

1.- Ácidos: son sales con el anión coloreado y la base incolora. Se unen a
moléculas básicas, sobre todo estructuras proteicas localizadas en el
citoplasma celular y también por el colágeno de la matriz extracelular. La
unión es por atracción eléctrica.

Ejemplos de colorantes ácidos son la fucsina ácida y eosina.

2.- Básicos: son sales en que la base aporta el color y la parte ácida es
incolora. Son colorantes catiónicos. Se unen a moléculas ácidas, por ejemplo
el ADN o ciertos componentes de la matriz extracelular como los
glicosaminoglicanos. Ejemplos de colorantes básicos son: safranina, azul de
toluidina, el azul de metileno o la hematoxilina.

Ejemplos de colorantes básicos son la safranina, azul de metileno y


hematoxilina.
3.-Neutros: poseen una porción ácida y otra básica, ambas con capacidad
para aportar color. Por tanto un mismo colorante puede teñir tanto las partes
básicas como las ácidas de los tejidos.

Por ejemplo, eosionato de azul de metileno.

4.-Indiferentes: no se unen a elementos de los tejidos por afinidad química sino


porque se disuelven en ellos.

Por ejemplo, el colorante sudán se disuelve en los lípidos y por tanto teñirá a
las gotas de lípidos, especialmente en los adipocitos.
EJEMPLOS DE TINCIONES

a) Hematoxilina-eosina.
b) Tinción tricromica de Masson
c) Tinción tricromica de Mallory
d) Tinción hematoxilina férrica
e) Tinción Gram.
Tinción Hematoxilina eosina

• Hematoxilina: tinción nuclear, se une a los componentes ácidos de la


célula. Es de carácter básico, es soluble en agua y en alcohol, pero por sí
sola no colorea, necesitando entonces de un oxidante y de un mordiente
(sustancia que sirve para fijar el colorante)

Eosina: tinción citoplasmática, se une a los componentes básicos de la


célula. Es de carácter ácido.
a) Hematoxilina- eosina. Los
ácidos nucleicos y otros
componentes ácidos de la
célula tienen afinidad por los
colorantes básicos
(hematoxilina) y el citoplasma,
de naturaleza básica, se tiñe
con colorantes ácidos (eosina).

https://mmegias.webs.uvigo.es/6
-tecnicas/5-general.php
Tinción tricrómica de Masson

• Utiliza tres colorantes: hematoxilina, fucsina y verde luz, pero hay variantes.
• Según la variante utilizada el colágeno se tiñe azul o verde, las células musculares son
rojas, el citoplasma de las células no musculares se ve rosado o rojo pálido y núcleo
negro o violeta.
Tinción tricrómica de Mallory

• Se utiliza para teñir tejido conectivo. Los cortes se tiñen con fucsina ácida,
solución de azul-naranja G de anilina y ácido fosfotúngstico.
• Las fibras de colágeno aparecen en azul y fibras musculares aparecen en rojo.

Cartilago Tendón y músculo estriado


Tinción hematoxilina férrica

• Sulfato de amonio férrico que junto con hematoxilina permite la


visualización de membranas celulares y estriaciones de células musculares
tanto esqueléticas como cardiacas y discos intercalares del músculo
cardiaco.

Disco
intercalar

Miocardio
Tinción GRAM
diferencia en la estructura de la
pared celular bacteriana
Microscopia y tinciones

Primer semestre 2018


Dra. Claudia Reinoso
claudiareinoso2001@gmail.com

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