Cristalografía de rayos X

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Proceso de determinación de la estructura de una molécula por cristalografía de rayos X.

La cristalografía de rayos X es una experimental para el estudio y análisis de materiales,

basada en el fenómeno de difracción de los rayos X por sólidos en estado

Los rayos X son difractados por los electrones que rodean los átomos por ser su longitud de
onda del mismo orden de magnitud que el radio atómico. El haz de rayos X emergente tras
esta interacción contiene información sobre la posición y tipo de átomos encontrados en su
camino. Los cristales, gracias a su estructura periódica, dispersan elásticamente los haces
de rayos X en ciertas direcciones y los amplifican por interferencia constructiva, originando
un patrón de difracción.n. 1 Existen varios tipos de detectores especiales para observar y
medir la intensidad y posición de los rayos X difractados, y su análisis posterior por medios
matemáticos permite obtener una representación a escala atómica de los átomos y
moléculas del material estudiado.

Max von Laue realizó los primeros experimentos de cristalografía de rayos X en 1912. Von
Laue, William Henry Bragg y William Lawrence Bragg desarrollaron inicialmente la teoría
de difracción de cristales, tarea a la que pronto se sumaron otros científicos. A lo largo del
siglo XX tuvieron lugar varios avances teóricos y técnicos, como la aparición de los
superordenadores y el uso de sincrotrones para la producción de rayos X, que
incrementaron la capacidad del método para determinar las propiedades estructurales de
todo tipo de moléculas: sales, materiales inorgánicos complejos, proteínas y hasta
componentes celulares como los ribosomas. Es posible trabajar con monocristales o con
polvo microcristalino, consiguiéndose diferentes datos en ambos casos: para las
aplicaciones que requieren solo una caracterización precisa de los parámetros de la red
cristalina, puede ser suficiente la difracción de rayos X por polvo; para una dilucidación
precisa de las posiciones atómicas es preferible trabajar con monocristales.

Dada la relación existente entre la estructura tridimensional de las moléculas y sus

propiedades químicas y físicas, la cristalografía ha contribuido al avance en varias
disciplinas científicas como la química, la biología molecular, la geología, la física aplicada
y la ciencia de materiales. La amplia disponibilidad de tubos de rayos X, complementada
con el desarrollo de fuentes de rayos X de alta intensidad ha aumentado significativamente
su impacto en estos campos de investigación así como en áreas con aplicaciones
industriales, como el desarrollo de fármacos y la mineralogía aplicada. La mayor limitación
de este método es la necesidad de trabajar con sistemas cristalinos, por lo que no es
aplicable a disoluciones, a sistemas biológicos in vivo, a sistemas amorfos o a gases. En
algunos casos, los rayos X pueden romper los enlaces químicos que mantienen la integridad
estructural, lo que resulta en un modelo distorsionado de la molécula estudiada. Este
problema afecta especialmente a los materiales de interés biológico.

Índice
 1 Historia
o 1.1 Primeros experimentos
o 1.2 El desarrollo de la técnica: 1920-1960
o 1.3 Avances en cristalografía de macromoléculas: 1960-1980
o 1.4 Expansión y madurez: 1980-2010
 2 Aspectos físicos
o 2.1 Cristales y redes cristalinas
o 2.2 Rayos X
o 2.3 Dispersión elástica de rayos X
o 2.4 Difracción cristalina
 2.4.1 Ley de Bragg
 2.4.2 Índices de Miller
 2.4.3 La red recíproca
 2.4.4 La esfera de Ewald
 2.4.5 El factor de estructura cristalino
 3 El problema de las fases
o 3.1 Método de Patterson
o 3.2 Métodos directos
o 3.3 Reemplazamiento isomorfo
o 3.4 Dispersión anómala
o 3.5 Reemplazamiento molecular
 4 Refinamiento de la estructura
  5 Cristalización
 6 Adquisición de datos
o 6.1 Fuentes de rayos X
o 6.2 Detectores
o 6.3 Geometrías de difracción
 6.3.1 Método de Laue
 6.3.2 Métodos de rotación de cristal
 6.3.3 Método de polvo cristalino
 7 Aplicaciones
o 7.1 Premios Nobel
o 7.2 Análisis de minerales
o 7.3 Diseño de fármacos
 8 Comparación con otras técnicas de difracción cristalográfica
 9 Limitaciones
 10 Véase también
 11 Notas
 12 Referencias
o 12.1 Bibliografía
 13 Enlaces externos

Historia
Primeros experimentos
Pioneros de la cristalografía de rayos X. De arriba abajo: William H. Bragg, su hijo
William L. Bragg y Max von Laue.

La idea de que los cristales son una repetición periódica de un grupo de moléculas ya
existía anteriormente a que Wilhelm Conrad Röntgen descubriera los rayos X en 1895.
Aunque las distancias típicas entre los planos de la red cristalina se desconocían, se sabía
que debían ser muy pequeñas comparadas con la longitud de onda de la luz visible. Esto le
dio al físico alemán Max von Laue la idea de utilizar cristales de sulfato de cobre para
determinar si los rayos X se componían de partículas u ondas: dedujo que, si fueran ondas,
deberían generar un patrón de difracción al atravesar los cristales.n. 2 Los experimentos se
realizaron en 1912, con la ayuda de Walter Friedrich y Paul Knipping, ambos antiguos
estudiantes de Röntgen. Estos experimentos confirmaron la presencia de difracción
cristalina, interpretada por von Laue como la extensión a tres dimensiones de la difracción
de Fraunhofer por un enrejado.

Poco después, los británicos William Henry Bragg y William Lawrence Bragg (padre e hijo
respectivamente) reprodujeron el experimento. W.L. Bragg explicó la difracción como la
interferencia de los rayos X reflejados por planos cristalinos paralelos, introduciendo la
descripción conocida desde entonces como la ley de Bragg.1 En 1913, Paul Ewald demostró
que las dos interpretaciones de los resultados publicadas independientemente por von Laue
y Bragg eran equivalentes.2 Von Laue recibió el premio Nobel de Física en 1914 por su
descubrimiento del fenómeno, y los Bragg recibieron el mismo premio un año más tarde
por su trabajo en las aplicaciones prácticas.n. 33 Hacia el final de la década, se había logrado
determinar las longitudes de onda de los rayos X y la estructura de varios compuestos
inorgánicos simples y se habían establecido las bases teóricas de la técnica gracias al
trabajo de los ya mencionados investigadores, Charles Galton Darwinn. 4 y Peter Debye,
entre otros.

El desarrollo de la técnica: 1920-1960

El período entre 1920 y 1960 se caracterizó por importantes adelantos metodológicos que
propiciaron el empleo de la difracción de rayos X para analizar estructuras de moléculas
más complejas.

Durante la década de 1920, los avances de la teoría cuántica sirvieron para caracterizar más
precisamente la interacción entre los rayos X y los átomos de los cristales; esto posibilitó el
análisis correcto de la intensidad de la difracción. En la misma época aparecieron las tablas
para determinar la simetría cristalina a partir de la distribución de reflexiones en el patrón
de difracción y se empezaron a usar las series de Fourier para representar la distribución de
electrones en la red cristalina. Los desarrollos en la representación matemática de la
densidad electrónica continuaron hasta la Segunda Guerra Mundial, facilitando la obtención
de las primeras estructuras de moléculas orgánicas. En 1935, el cristalógrafo británico
Arthur Patterson descubrió un truco matemático para obtener las distancias interatómicas
directamente a partir de los datos experimentales, lo que supuso un importante avance en el
análisis de la difracción.4

Entre las décadas de 1940 y 1960, surgieron otros procedimientos para la determinación de
estructuras, especialmente, métodos heurísticos basados en el proceso de ensayo y error,
que demostraron ser bastante exactos en combinación con restricciones condicionantes
basadas en las propiedades físicas de una estructura correcta, como por ejemplo, que la
densidad electrónica debe ser siempre positiva. En este período la cristalografía empezó a
adquirir importancia en el campo de la química orgánica, proceso que culminó con la
determinación en 1957 de la estructura de la vitamina B12, un proyecto liderado por
Dorothy Hodgkin.4

Avances en cristalografía de macromoléculas: 1960-1980

El adelanto más trascendente durante las décadas de los 60 y 70 fue el reconocimiento de la

cristalografía de proteínas y de moléculas involucradas en procesos biológicos en general
como área de investigación clave en la biología molecular. El año 1962 marcó un hito al
otorgarse dos premios Nobel por los resultados obtenidos usando métodos cristalográficos
en esta área: el premio Nobel de Química fue concedido a Max Perutz y John Kendrew por
sus estudios cristalográficos de las proteínas hemoglobina y mioglobina y el premio Nobel
de Medicina a Francis Crick, James Watson y Maurice Wilkins por descubrir que el ADN
forma una doble hélice.n. 5 En 1964 Dorothy Hodgkin también obtuvo el premio Nobel de
Química por la determinación de varias estructuras de importancia biológica, como la
penicilina y la vitamina B12, entre otras.6
Un adelanto que facilitó en gran medida el éxito de las técnicas cristalográficas tanto en el
caso de macromoléculas orgánicas con un gran número de átomos como en el de moléculas
de menor tamaño fue el desarrollo de ordenadores digitales; gracias a ellos fue posible usar
programas para medir y analizar fácilmente los datos obtenidos en los experimentos en vez
de realizar los laboriosos cálculos manualmente.7 Sin embargo, al final de este período el
estudio de proteínas estaba aún limitado por la ausencia de fuentes de rayos X intensos y el
empleo de película fotográfica para medir los patrones de difracción, lo que requería un
largo proceso de revelado y digitalización de las imágenes.n. 6 A consecuencia de estas
limitaciones, y a pesar del reconocimiento generalizado del potencial de la cristalografía
para estos experimentos, a finales de la década de 1970 el Banco de Datos de Proteínas solo
contaba con unas sesenta entradas.8

Expansión y madurez: 1980-2010

Modelo cristalográfico de la subunidad mayor del ribosoma. La obtención de esta

estructura, galardonada con el premio Nobel de Química en 2009, fue posible gracias a los
avances tecnológicos y metodológicos de los años 1980 y 1990. Como comparación, a la
derecha y aproximadamente en la misma escala, se muestra el modelo de la mioglobina,
una de las primeras proteínas estudiadas con esta técnica durante los años 1950 y cuya
determinación se consideró un logro considerable en esa época.

Los tubos de rayos X, con sucesivas mejoras, se utilizaron como la fuente primordial de
rayos X para los experimentos de cristalografía desde sus comienzos hasta la década de
1970, época en la que se empezó a experimentar con la radiación de sincrotrón de rayos X.
Los sincrotrones dedicados exclusivamente a la producción de rayos X aparecieron en la
década de 1980 y su número no ha dejado de aumentar desde entonces.n. 7 En la primera
década del siglo XXI se construyeron los primeros láseres de electrones libres de rayos-X,
capaces de producir haces de luz pulsada de una intensidad de órdenes de magnitud mayor
que en las fuentes de luz sincrotrón convencionales. La duración de los pulsos de luz, del
orden de femtosegundos ofrece la posibilidad de observar cambios en los cristales a escalas
temporales inalcanzables anteriormente.7 Durante estos años también se desarrollaron
nuevos detectores bidimensionales o «de área», capaces de generar directamente una
imagen digitalizada del patrón de difracción. Estos detectores facilitaron la rápida medición
y análisis de la difracción y sustituyeron totalmente a las placas fotográficas usadas hasta
entonces.

Los mencionados avances, unidos al incremento de la capacidad de los ordenadores

modernos para almacenar y procesar datos, han permitido llevar a cabo experimentos
antaño irrealizables, y han desembocado en un aumento exponencial del número de
estructuras elucidadas por métodos cristalográficos. El desarrollo más notable ha tenido
lugar en el área de las macromoléculas orgánicas, con más de 88 000 estructuras
depositadas en el Banco de Datos de Proteínas al comienzo de 2013.8 La obtención en 2000
de la estructura del ribosoma,9 un enorme complejo de ácidos nucleicos y varias proteínas
donde tiene lugar la síntesis de proteínas en la célula, ilustra las capacidades que ha
alcanzado la técnica.

Aspectos físicos
Cristales y redes cristalinas

Estructura cristalina de cloruro de hidrógeno deuterado con la celda unidad superpuesta

sobre las moléculas. La red cristalina se forma mediante la translación de la celda unidad a
lo largo de las direcciones definidas por y .

Parámetros de la celda unidad.

Artículos principales: Celda unidad y Redes de Bravais.
Los cristales están formados por una repetición periódica de moléculas en tres dimensiones.
El cristal se puede representar matemáticamente como una red tridimensional, llamada «red
de Bravais», en la que todas las intersecciones, o nodos, son idénticas.1011 El paralelepípedo
definido por las líneas entre distintos nodos de la red se conoce como la celda unidad;
aunque para una red dada sea posible designar múltiples celdas unidad que cumplan esta
definición, por convención se escoge habitualmente la de menor volumen que refleje la
simetría del cristal.1211 La celda unidad se define por la longitud de sus lados , y en la
dirección de los tres ejes espaciales y los ángulos , y que los ejes de la red forman entre sí.
Las coordenadas de cualquier punto de la red cristalina se pueden expresar como una
combinación lineal de los vectores , y .13

La posición de un átomo en la celda unidad se expresa como coordenadas fraccionarias de ,

y de la siguiente forma:

con las coordenadas (, , ) comprendidas entre 0 y 1.14

El objetivo de los experimentos de difracción por rayos X es averiguar , y para cada átomo.
Para lograrlo es necesario, en primer lugar, determinar la relación entre la red cristalina y la
geometría del patrón de difracción y, en segundo lugar, obtener las posiciones de los
átomos a partir de la intensidad de la difracción.

Rayos X

Artículo principal: Rayos X

Representación esquemática de una onda electromagnética, mostrando la oscilación

periódica de los campos eléctrico y magnético.

Los rayos X son un tipo de radiación electromagnética con longitudes de onda entre 10 y
10-2 nm o energías entre 0,1 y 100 keV.15 Para los experimentos de difracción cristalina se
suelen usar rayos X de energía relativamente alta, del orden de 10 keV, correspondiente a
longitudes de onda del orden de 0,1 nm.1617

Los rayos X se describen matemáticamente como una onda sinusoidal propagándose a

través del espacio.

Tomando un punto arbitrario como origen, el valor del campo eléctrico en función del
tiempo se puede escribir como:1819

es la amplitud de la oscilación, la longitud de onda y la velocidad de la luz. A consecuencia

de la interacción con los electrones de los átomos en la muestra, la onda sufre un desfase
con respecto a la onda en el punto de origen:
La diferencia de fase depende de la distancia entre el punto de origen y los átomos del
material; esto implica que la estructura atómica, es decir, las posiciones que ocupan los
átomos, se pueden derivar de la fase de los rayos X que han atravesado el material.

Dispersión elástica de rayos X

Véanse también: Factor de forma atómica y Factor de estructura.

El fenómeno de difracción cristalina tiene su origen en la dispersión elástica o scattering
elástico del haz de rayos X por los átomos del cristal.n. 8 En este tipo de interacción, el
electrón desvía los rayos X, que toman exactamente la misma trayectoria que un rayo de luz
visible reflejado en un espejo, es decir, los rayos dispersados emergen a un ángulo con
respecto a la dirección de los rayos incidentes.n. 9 Tanto el electrón como los rayos X
conservan su energía inicial durante esta interacción.20

La dispersión elástica por un grupo de átomos en una dirección dada se puede cuantificar
con una cantidad conocida como factor de estructura que es igual a la suma de los rayos
reflejados por cada átomo que interactúa con los rayos incidentesn. 1021

es una función llamada factor de forma atómica —o factor de dispersión atómica— que
describe la dispersión por todos los electrones del átomo en conjunto. La dispersión elástica
atómica depende del número atómico y del ángulo de incidencia de los rayos X.22 El
cambio de fase de los rayos dispersados durante la interacción viene dado por el producto
escalar de , el vector entre el origen y cada átomo y , conocido como vector de dispersión,
con magnitud y dirección perpendicular al plano virtual de reflexión.

Difracción cristalina

Adición de ondas: cuando las ondas están desfasadas, se aniquilan mutuamente; cuando
están en fase, se amplifican.

Ley de Bragg

Artículo principal: Ley de Bragg

La difracción en una dirección dada se debe esencialmente a la relación entre las fases de
todas las ondas reflejadas por cada celda unidad del cristal en esa dirección. Los rayos que
han atravesado distintos puntos del cristal siguen caminos ópticos de diferente longitud y
esta diferencia da lugar a un cambio en la amplitud de la onda resultante; cuando la
diferencia de fase es de 180 grados, las ondas se anulan entre sí. Por el contrario, cuando las
ondas están en fase, la amplitud de la onda final es la suma de las amplitudes para cada
onda. Puesto que un cristal está compuesto de un gran número celdas unidad, la
interferencia constructiva entre todas ellas resulta en un haz lo suficientemente intenso para
poder ser medido con un detector de rayos X.

Ley de Bragg: Los átomos o grupos de átomos en la red cristalina están representados por
esferas (para simplificar el diagrama, la tercera dimensión del cristal no se representa). Las
esferas se sitúan sobre planos imaginarios paralelos, perpendiculares al diagrama, separados
por . Los rayos X inciden sobre los planos a un ángulo . En la imagen de la izquierda, la
diferencia en el camino recorrido por las ondas dispersadas por los dos planos es un
múltiplo entero de la longitud de onda; por lo tanto, las ondas emergentes están en fase y se
observa difracción a un ángulo respecto de los planos de difracción o respecto al haz
incidente. A la derecha, con un ángulo de incidencia diferente, la Ley de Bragg no se
cumple para esta familia de planos cristalinos; las ondas emergentes están desfasadas y no
se observa difracción.
La condición para que las ondas estén en fase es que la diferencia de sus caminos ópticos
sea cero o un múltiplo entero de la longitud de onda. En un cristal, la diferencia en el
camino óptico entre átomos situados en posiciones equivalentes en distintas celdas unidad
es donde es la distancia entre los planos imaginarios que unen los puntos equivalentes de la
red cristalina. Es decir, para que se observe interferencia constructiva de rayos X a un
ángulo de observación , se debe cumplir la expresión conocida como Ley de Bragg:23

Como en el caso de la dispersión elástica por un átomo, la difracción cristalina se puede

interpretar como la reflexión especular de los rayos X por todos los planos del cristal a un
ángulo del haz incidente y separados entre sí por la distancia que cumple la ley de Bragg.
Por este motivo, los puntos del patrón de difracción se denominan «reflexiones».24
Índices de Miller: La figura muestra ejemplos de diferentes planos de difracción en una
celda unidad, ilustrando la correspondencia entre los índices de Miller y la orientación de
los planos en el sistema de coordinadas definido por aquella.

Índices de Miller

Artículo principal: Índice de Miller

Para que se cumpla la ley de Bragg para un grupo de planos de reflexión paralelos, estos
deben cruzar los ejes de la celda unidad un número entero de veces. Las reflexiones
cristalinas se identifican mediante tres números , y iguales al número de intersecciones de
los planos con los ejes , y de la celda. Los números , y reciben el nombre de índices de
Miller. Matemáticamente, los índices de Miller describen un vector perpendicular al plano
de reflexión en el sistema de coordenadas definido por la red cristalina.25

La red recíproca

Artículo principal: Red recíproca

Se denomina red recíproca a la transformada de Fourier de la red cristalina. Esta
construcción matemática facilita la representación de los planos de reflexión y la
visualización de la relación entre la orientación del cristal y el patrón de difracción. Las
coordenadas de cada punto de la red recíproca coinciden con los índices de Miller, es decir,
cada punto de la red recíproca representa a una familia de planos de Miller en el espacio
real de la red cristalina; la distancia del origen a cada punto de la red es .2627

Al igual que en el caso de la red cristalina, los puntos de la red recíproca se pueden
expresar como una combinación lineal de vectores , y :26

La relación entre los parámetros de la celda unidad (, , , , , ) de volumen y la celda unidad

recíproca (, , , ,, ) es la siguiente:2827

Representación bidimensional de la construcción de Ewald. Los rayos X incidentes están

representados por el vector de onda , de amplitud . La red recíproca se representa en azul;
para simplificar el diagrama, solo se muestran las coordenadas de algunos puntos de la red,
representando a los planos de Miller correspondientes. El punto (4,1) coincide con la
superficie de la esfera, por lo tanto se observará un haz de rayos X con el vector de onda
reflejado en la dirección dada por . La magnitud del vector diferencia entre y o vector de
difracción es la distancia entre los planos paralelos de índices (4,1).

La esfera de Ewald

Artículo principal: Esfera de Ewald

Para visualizar fácilmente los planos de Miller que contribuyen a la difracción en una
dirección dada y determinar la relación entre la orientación del cristal y el patrón de
difracción, se utiliza la construcción conocida como esfera de Ewald. La esfera de Ewald
ilustra todas las posibles direcciones en que los rayos X pueden ser reflejados por el cristal.
El radio de esta esfera es y su extremo en la dirección del haz de rayos X incidente coincide
con el origen de la red recíproca.2426

Si un punto de la red recíproca de coordenadas se encuentra sobre la superficie de la esfera

de Ewald, los planos de Miller con índices darán lugar a un punto de difracción en la
dirección definida por el centro de la esfera y ese punto de la red recíproca. La distancia
entre el origen y es , por lo que se puede demostrar geométricamente que esta condición de
difracción es equivalente a la ley de Bragg.26

El factor de estructura cristalino

Véase también: factor de estructura

El vector con coordenadas en la red recíproca es perpendicular al plano de reflexión y su
magnitud es ; es decir, es un vector de dispersión , introducido en la definición del factor de
estructura , para el que se cumple la ley de Bragg. Por lo tanto, el factor de estructura en la
dirección definida por los planos de Miller descritos por los índices se reformula como29n. 11

donde es el vector de coordenadas del átomo en el sistema definido por la celda unidad y la
suma se realiza para todos los átomos contenidos en ella. En lugar de sumar las
contribuciones de cada átomo, también se puede realizar una integración sobre los
electrones en el volumen de la celda unidad, cuya distribución por elemento de volumen se
representa por la función de densidad electrónica :30

Representación vectorial de la Ley de Friedel en la ausencia de absorción. Las magnitudes

de los factores de estructura relacionados por esta ley, conocidos como «pares Friedel» son
iguales, y sus fases, opuestas.
La aplicación de las operaciones de simetría del cristal a las coordenadas resulta en
relaciones de igualdad entre los factores de estructura de diferentes reflexiones. A las
reflexiones así relacionadas se las denomina «simétricamente equivalentes». En los
experimentos cristalográficos, donde el grupo de simetría no se conoce con certeza a priori,
se comparan las reflexiones relacionadas por diversas operaciones de simetría para
caracterizar la simetría del cristal. La igualdad entre los módulos o «amplitudes» de las
reflexiones relacionadas por un centro de inversión, con índices de Miller y
se conoce como ley de Friedel y ocurre incluso en la ausencia de simetría, aparte de la
traslación de la celda unidad sobre la red cristalina.31 En la práctica la ley de Friedel no se
cumple exactamente debido a la presencia de interacciones inelásticas entre los rayos X y
los átomos, que resultan en absorción de energía por estos.32 Esos efectos suelen ser
pequeños comparados con las interacciones elásticas y no se suelen tener en cuenta,
excepto para longitudes de onda en la vecindad de una discontinuidad de absorción del
cristal.

El problema de las fases

El propósito de los experimentos cristalográficos no es obtener el patrón de difracción, sino
el valor de la función de distribución electrónica , lo que permite determinar la posición de
los átomos y la estructura tridimiensional de la molécula cristalina. Se puede demostrar que
puede representarse como sumas de Fourier de los factores de estructura en todas las
direcciones:33

Mientras que el módulo del factor de estructura es simplemente la raíz cuadrada de la

intensidad del punto de difracción, medida por un detector sensible a los rayos X, la fase no
se puede computar directamente. Esto se conoce como el «problema de las fases».34 Existen
varios métodos para resolver el problema de las fases y elucidar la estructura atómica,
clasificados en los siguientes grupos:35

 Métodos de Patterson
 Métodos directos
 Dispersión anómala
 Reemplazamiento isomorfo
 Reemplazamiento molecular

Método de Patterson

Artículo principal: Método de Patterson

La función de Patterson se calcula efectuando la síntesis de Fourier con el cuadrado de los
factores de estructura como coeficientes. Esta función se puede calcular directamente a
partir de los datos experimentales, al no depender de la fase de los factores de estructura.
En 1935, Arthur Patterson se percató de que los máximos de esta función corresponden a
los vectores que se pueden trazar entre cada par de átomos en la celda unidad, lo cual se
puede utilizar en ciertos casos favorables para determinar la posición de todos o algunos
átomos. En particular, el análisis de la función de Patterson se utiliza a menudo para
localizar los átomos causantes de diferencias isomorfas o anómalas, lo cual es a su vez el
primer paso para solucionar el problema de las fases por estos otros métodos.363738

Métodos directos

La función de distribución de densidad electrónica se caracteriza por ser siempre positiva y

alcanzar valores máximos alrededor de los átomos. Estas y otras propiedades derivadas de
principios básicos, expresadas en forma matemática, se utilizan para discriminar entre
valores de las fases que resultan en una estructura con características físicamente posibles y
los que no y, por eliminación de estos últimos, elucidar la estructura de la molécula de
interés. Este método se usa corrientemente para resolver el problema de las fases para
moléculas pequeñas.39 En contraste, en el caso de los cristales de macromoléculas, los
métodos directos no suelen ser suficientes para resolver la estructura totalmente ab initio
sin ninguna información experimental adicional; esto se debe a que, por un lado, los
cristales de proteínas y moléculas de similar tamaño raramente difractan a una resolución
suficiente para obtener el número de reflexiones requerido para determinar todos los
parámetros atómicos y, por otro lado, al gran número de átomos en la celda unidad, que
causa que las relaciones entre las probabilidades de las fases sean menos determinantes que
en los casos de moléculas que cuentan con pocos átomos.4041

A pesar de los límites del método, sus principios también se aplican en el área de difracción
de macromoléculas para mejorar las fases obtenidas por otros métodos y el cálculo de las
fases a partir de un modelo de baja resolución. En la cristalografía de proteínas, las
propiedades claves para discriminar entre fases correctas e incorrectas incluyen:42

 El contraste entre las zonas de la celda unidad ocupadas por moléculas de agua o
solvente en estado amorfo y las zonas ordenadas ocupadas por la molécula.
 Una distribución característica de la probabilidad de valores de la densidad
electrónica.

Al igual que la función de Patterson, los métodos directos también se utilizan para
determinar las posiciones de átomos especiales en los métodos de sustitución o
reemplazamiento isomorfo y de dispersión anómala.

Reemplazamiento isomorfo

El reemplazamiento isomorfo o sustitución isomorfa es un método para resolver el

problema de las fases empleado predominantemente en cristalografía de macromoléculas.
Consiste en la introducción en el medio de cristalización de un compuesto químico de
pequeño tamaño conteniendo un átomo pesado, es decir de un número atómico elevado.
Los compuestos de mercurio, platino, uranio, y oro son los más utilizados, entre muchos
otros.43n. 12 Para que el método tenga éxito se debe establecer un enlace químico entre la
molécula de interés y el átomo pesado, y la molécula modificada o «derivada» debe formar
cristales isomorfos, con la misma simetría que los obtenidos a partir de la molécula
«nativa» sin modificar. El factor de estructura de la molécula derivada es la suma del factor
de estructura «nativo» y la contribución del átomo pesado .

Las fases del átomo pesado que contribuyen a esto se pueden calcular por métodos directos
a partir de las diferencias . Aunque una sola sustitución isomorfa no es suficiente para
determinar , si se repite el proceso con al menos una segunda estructura derivada diferente,
es posible determinar las fases para la estructura nativa, por el método conocido como
reemplazamiento isomorfo múltiple o sus siglas en inglés MIR (Multiple Isomorphous
Replacement)n. 1344
Las principal limitación de este método estriba en la dificultad de encontrar compuestos
que reaccionen con la molécula a estudiar sin destruir al mismo tiempo el cristal o
modificar sensiblemente su simetría o las dimensiones de la celda unidad.

Dispersión anómala

Valores de las componentes del factor de estructura anómalo f" y f' alrededor de un salto de
absorción.
El factor de forma atómica no solo describe la dispersión elástica, sino también el efecto
fotoeléctrico, que tiene lugar cuando los electrones cambian su estado cuántico al absorber
parte de la energía de los rayos X. El término que corresponde a la dispersión inelástica o
«anómala» es un número complejo .45 Ambas componentes real e imaginaria alteran la
magnitud de los factores de estructura. La componente imaginaria, relacionada con el
coeficiente de absorción, introduce además un cambio de fase que resulta en diferentes
magnitudes de los pares Friedel y , idénticas en ausencia de este efecto.

La contribución anómala al factor de estructura es menor que la contribución elástica y a

menudo no es necesario tenerla en cuenta. Sin embargo, depende de la longitud de onda de
los rayos X y experimenta grandes variaciones cuando la energía del haz incidente es
similar a la energía de un nivel atómico del átomo. Cuando y alcanzan sus valores máximos
los cambios en la magnitud y fase de los factores de estructura pueden ser significativos. Si
algunos átomos en la molécula resultan afectados por este tipo de interacción, se pueden
hallar sus posiciones en la celda unidad analizando las diferencias de intensidad entre las
mismas reflexiones medidas a distintas longitudes de onda, o entre los pares de Friedel a la
misma longitud de onda. Dichas diferencias se pueden utilizar para resolver el problema de
las fases, por el método MAD (Multiwavelength Anomalous Dispersion/Diffraction o
‘dispersión/difracción anómala a múltiples longitudes de onda’)46 o SAD (Single-
wavelength Anomalous Dispersion/Diffraction o ‘dispersión/difracción anómala a una sola
longitud de onda’)n. 14

La mayoría de los átomos pesados usados en el método de reemplazamiento isomorfo

exhiben una dispersión anómala importante en el rango de longitudes de onda usado en los
experimentos cristalográficos, por lo cual estas dos técnicas se usan a veces en conjunción.
La ventaja de los métodos basados en la dispersión anómala es que, al precisar en principio
solo un cristal para determinar las fases, no están limitados por un isomorfismo imperfecto.
El uso de radiación sincrotrón, que se puede sintonizar a las longitudes de onda que
optimizan la dispersión anómala, ha resultado en un fuerte incremento de la popularidad del
método.

Reemplazamiento molecular

El método de reemplazamiento molecular consiste en el empleo de una molécula de

estructura conocida para calcular las fases iniciales de una segunda molécula con elementos
estructurales comunes con la primera. Este es el método más usado para determinar la
estructura de macromoléculas como las proteínas, ya que muchas de ellas se agrupan en
familias con una estructura similar o forman complejos supramoleculares en los que se
conoce la estructura de una o más componentes.4849

La desventaja del reemplazamiento molecular es que las fases obtenidas están sesgadas
hacia la estructura utilizada como punto de partida, lo que no ocurre con las técnicas
basadas enteramente en los datos de difracción experimentales y conocimiento a priori de
las propiedades químicas o estructurales del material. El éxito de este método depende de
algoritmos sofisticados para detectar y eliminar este sesgo durante el refinamiento de las
fases.49

La obtención de las fases permite calcular un mapa de densidad electrónica (mostrado en

blanco), a partir del cual se construye el modelo de la estructura. El modelo suele consistir
en líneas, representando los enlaces atómicos, o puntos, representando átomos individuales.
En la figura se usan ambas representaciones.

Refinamiento de la estructura
Una vez calculada la función a partir de las fases, se puede construir un modelo de la
estructura en el mapa de densidad electrónica, descrito por un número de parámetros: las
posiciones de cada átomo , y , su factor de temperatura representando los deplazamientos
de los átomos con respecto a su posición media, etc.50n. 15 La determinación inicial de estos
parámetros puede ser incorrecta, debido a errores en la determinación de las fases o fallos
de interpretación de la densidad electrónica.51 Durante el refinamiento, se modifica
reiterativamente el modelo y a continuación se compara el módulo de los factores de
estructura calculados a partir de este con el de los factores de estructura experimentales ,
hasta que la diferencia entre ambos sea mínima. La figura de mérito utilizada para la
comparación es el factor R, definido como:52

La suma se realiza sobre todas las reflexiones .

Se usan dos técnicas matemáticas para ajustar los parámetros del modelo durante el
refinamiento: los mínimos cuadrados y la máxima verosimilitud. El segundo método
requiere más recursos computacionales, pero es más general y se aplica con preferencia en
problemas difíciles, como macromoléculas y difracción a baja resolución.5354

Cristalización
Artículo principal: Cristalización

Esquema ilustrativo del método de difusión de vapor para obtener cristales para su estudio
por rayos X.

Para obtener datos de difracción de un cristal, este debe cumplir ciertos requisitos en cuanto
a tamaño, pureza y regularidad de la red cristalina. Aunque a veces es posible utilizar
cristales de metales o minerales inorgánicos formados por medios naturales, a menudo es
necesario prepararlos mediante recristalización o precipitación del material en una solución
líquida sobresaturada en condiciones controladas de concentración y temperatura. En el
método de cristalización por difusión de vapor, la solución que contiene el material a
cristalizar junto con un precipitante alcanza un estado de equilibrio termodinámico con otra
solución más concentrada del precipitante, por difusión del disolvente hacia esta a través
del aire; esta técnica se usa tanto para moléculas de pocos átomos como para proteínas y
otras macromoléculas.5556 Un segundo método es la cristalización en geles, muy útil para
cristalizar materiales insolubles; esta técnica, lenta comparada con la difusión de vapor,55
consiste en la introducción de un reactante en un gel antes de que este se endurezca.
Posteriormente se introduce otra solución de un segundo reactante en la capa superior del
gel, desde donde se difunde al resto de la matriz y reacciona con la primera sustancia para
dar lugar a cristales.57

Las condiciones de preparación de cristales deben también ser las adecuadas para obtener
cristales de un tamaño óptimo para su estudio por difracción de rayos X; la talla ideal está
determinada por la densidad y composición de la muestra: mientras que los cristales de gran
tamaño atenúan excesivamente los rayos X y suelen presentar irregularidades en la matriz
cristalina, los de talla muy pequeña difractan débilmente. En el caso de cristales de
materiales orgánicos, son preferibles los cristales de unas décimas de milímetro; no
obstante, cuando se usan fuentes de rayos X muy intensas, como láseres de electrones libres
o líneas de luz sincrotrón modernas, es posible trabajar con cristales de dimensiones de
unos veinte μm o incluso menores.5859 Para las aplicaciones de cristalografía en polvo, se
requieren al menos varios cientos de miligramos de material machacado hasta formar
cristales de aproximadamente diez μm o menores.60

Adquisición de datos
Fuentes de rayos X

Estación de sincrotrón para experimentos de cristalografía usando el método de rotación. El

haz de rayos X, de un par de décimas de mm se dirige al cristal, de aproximadamente el
mismo tamaño, desde la izquierda de la imagen. El cristal se emplaza sobre un
difractómetro, que permite orientar y girar el cristal para obtener un conjunto de reflexiones
lo más completo posible. El patrón de difracción se graba en el detector bidimensional
mostrado a la derecha, en este caso una pantalla de material sensible a los rayos X
conectada a una cámara de CCD por medio de fibra óptica.

Los experimentos de cristalografía de rayos X se pueden realizar, o bien con un tubo de

rayos X o usando la radiación sincrotrón emitida por aceleradores de partículas. En los
tubos de rayos X, se aplica un voltaje para acelerar un haz de electrones producidos por
calentamiento de un filamento de wolframio —el cátodo. Los electrones acelerados
colisionan contra un material metálico —el ánodo— y durante la consiguiente
desaceleración emiten radiación de Bremsstrahlung de espectro continuo, es decir,
compuesta de múltiples longitudes de onda. El ánodo absorbe parte de los rayos X emitidos
por los electrones y emite a su vez rayos X de las longitudes de onda características del
metal. Por ejemplo, un ánodo de cobre emite principalmente en la longitud de onda de
1,5405 Å. La radiación de Bremsstrahlung y otras líneas de emisión características menos
intensas se filtran con un metal absorbente. En el ejemplo del ánodo de cobre, se utiliza
níquel, que es bastante transparente a los rayos X de 1,5405 Å, pero absorbe eficazmente la
radiación a longitudes de onda menores, obteniéndose un haz de rayos X bastante
monocromático.61 Los tubos de rayos X son relativamente baratos y los laboratorios de
investigación los suelen utilizar para realizar experimentos in situ.

La radiación sincrotrón se obtiene cuando un haz de electronesn. 16 acelerados hasta alcanzar

una velocidad cercana a la de la luz es desviado de su trayectoria por medio de un campo
magnético. La radiación sincrotrón es de espectro continuo y la longitud de onda deseada
para el experimento se puede seleccionar mediante un monocromador. Las fuentes de
radiación sincrotrón emiten rayos X mucho más intensos que los generados por los tubos y
son necesarias para mejorar la calidad de la difracción cuando los cristales son muy
pequeños o están compuestos de átomos ligeros, que interaccionan débilmente con los
rayos X.

Detectores

Véase también: Rayos X

Existen varios tipos de detectores usados en los experimentos de cristalografía. El detector

bidimensional más usado durante mucho tiempo fue la película fotográfica, actualmente
reemplazada por otros detectores más sensibles a los rayos X. Otro detector clásico es el
contador proporcional unidimensional, normalmente un detector de centelleo, instalado en
un difractómetro y controlado por ordenador. Este tipo de detector mide las reflexiones una
a una y todavía se usa para la cristalografía de moléculas pequeñas, pero es poco eficaz en
los experimentos con macromoléculas, donde el número de reflexiones ronda entre 10 000
y 100 000.62

A partir de los años 1990 empezaron a aparecer nuevos detectores, como las «placas de
imagen» (image plates). Las placas de imagen están recubiertas de un material
fosforescente, donde los electrones incrementan su energía al absorber los rayos X
difractados y son atrapados en este nivel en centros de color. Los electrones liberan la
energía al iluminarse la placa con luz láser, emitiendo luz con intensidad proporcional a la
de la reflexión. Estos detectores son un orden de magnitud más sensibles que la película
fotográfica y poseen un margen dinámico superior en varios órdenes de magnitud, lo que
facilita la medición simultánea de las reflexiones más intensas y las más débiles. Otros
detectores usados en la actualidad son detectores electrónicos, conocidos como detectores
«de área», que procesan la señal inmediatamente tras la detección de los rayos X. Pueden
ser cámaras de ionización o una placa fosforescente acoplada a una cámara CCD.63 En los
años 2000 se empezaron a utilizar fotodiodos alineados formando una placa, denominados
PAD (Pixel Array Detectors). Estos detectores se caracterizan por un gran margen
dinámico y un tiempo muerto entre imágenes muy bajo, del orden de milisegundos.64

Geometrías de difracción

Existen tres métodos para medir la difracción de rayos X: el método de Laue, el método de
rotación y el método de polvo.
Método de Laue

Patrón de difracción obtenido por el método de Laue en transmisión: las reflexiones

dispuestas a lo largo de una curva son generadas por una misma longitud de onda.

Consiste en hacer incidir en un cristal un espectro continuo de rayos X, de tal manera que
para cada longitud de onda se cumple la ley de Bragg para diferentes puntos de la red
recíproca. Esto posibilita medir todas o casi todas la reflexiones sin cambiar la orientación
del cristal. Existen dos variantes del método de Laue: transmisión y reflexión. En el método
de Laue por transmisión, el cristal se emplaza entre la fuente de rayos X y el detector. En
método de reflexión, el detector se encuentra entre la fuente y el cristal, para detectar los
haces difractados hacia atrás.65

A pesar de ser el método utilizado en los primeros experimentos cristalográficos, el método

de Laue se usaba muy poco para la determinación de estructuras debido principalmente a la
baja intensidad de la radiación de espectro continua producida por los tubos de rayos X en
comparación con la emisión característica monocromática. El creciente uso de la radiación
sincrotrón ha fomentado el resurgimiento del método. La capacidad de medir todos los
datos necesarios para la determinación de la estructura en un corto tiempo lo convierte en el
método más apropiado para el estudio de reacciones químicas que tienen lugar en pocos
segundos, como catálisis por enzimas y zeolitas y los efectos de perturbaciones causadas
por campos eléctricos, cambios de presión y temperatura, etc. en diversos materiales.66

Métodos de rotación de cristal

Patrón de difracción obtenido por rotación de un cristal. El uso de ordenadores para la
interpretación de las imágenes obtenidas por este método lo ha transformado en el modo
preferido de medición de datos en la mayoría de las aplicaciones.

Patrón de difracción obtenido por el método de precesión. Este método resulta en una
representación sin distorsiones de los planos de la red recíproca.

Se hace incidir un haz de rayos X monocromáticos sobre un cristal, que rota a una
velocidad constante alrededor de un eje perpendicular a los rayos X. La rotación del cristal
causa que todos los puntos de la red recíproca atraviesen consecutivamente la esfera de
Ewald, logrando así medir las reflexiones necesarias. Existen diferentes variantes de este
método. En el método de Weissenberg se usa una cámara de forma cilíndrica rodeando al
cristal tal que el eje de rotación del cristal coincide con el eje del cilindro. La cámara se
traslada a medida que el cristal gira para que las reflexiones estén separadas. En el método
de precesión, la cámara es plana, y rota alrededor de un eje paralelo al eje de rotación del
cristal. En ambos métodos se usa una pantalla para medir solo una sección bidimensional
de la red recíproca en cada imagen.6768 Estos métodos facilitan la determinación de la
orientación del cristal y los índices de las reflexiones, pero son lentos e ineficientes. Los
avances en computación de los años 90 posibilitaron un diseño más simple, en el que el
detector se mantiene estacionario detrás del cristal, usándose programas para hallar
automáticamente la orientación y los parámetros cristalinos consistentes con el patrón de
difracción observado.69

Método de polvo cristalino

Patrón de difracción de polvo. Debido al uso de múltiples cristales en múltiples
orientaciones los puntos de difracción correspondientes a los puntos de la red recíproca a la
misma distancia del origen d se unen para formar un anillo.

En el método de polvo cristalino o de Debye-Scherrer,n. 17 el cristal a analizar es pulverizado

de tal manera que forme un conjunto de microcristales en todas las posibles orientaciones
de la red recíproca. Con esta geometría todas las reflexiones se pueden medir en un solo
patrón de difracción, consistente en círculos, uno para cada reflexión. Aunque el método de
rotación de cristal resulta en valores más exactos de la intensidad de las reflexiones, el
método de polvo es a veces la única opción cuando el material a estudiar no forma
monocristales de un tamaño suficiente para producir difracción detectable. Este método se
usa mayoritariamente cuando no es necesario determinar la estructura; por ejemplo, en el
análisis de minerales presentes en una muestra.70

Aplicaciones
La cristalografía tiene muchas aplicaciones en una gran variedad de disciplinas científicas,
como la mineralogía, la química, la biología molecular, la farmacología,71 la geología, la
física aplicada y la ciencia de materiales.727374 Asimismo, las diferencias en el patrón de
difracción de diversos materiales,7576 hielo,77 sean minerales, drogas, pigmentos,
adsorbentes,78 catalizadores,798081 etc., con aspectos y composiciones químicas similares son
de mucha utilidad en la industria y campos sin relación directa con la investigación
científica básica o el desarrollo tecnológico, como la ciencia forense o la historia del arte.82
83

Premios Nobel
Cristales de insulina. La cristalografía de proteínas ha contribuido notablemente al
desarrollo de la biología molecular.
Véanse también: Ganadores del Premio Nobel de Química y De Física.

Varios de los descubrimientos y avances científicos que fueron llevados a cabo gracias a la
cristalografía de rayos X han sidos galardonados con el Premio Nobel.84 Entre ellos, una
alta proporción se han otorgado a descubrimientos en química orgánica y biología; los
primeros fueron los sendos premios en 1962 a Kendrew y Perutz en Química y Crick,
Watson y Wilkins en Medicina, seguidos dos años más tarde por el galardón a Dorothy
Hodgkin. Tras cuatro décadas de expansión, la cristalografía de macromoléculas empezó a
contribuir de manera significativa al esclarecimiento de muchos procesos clave en la
biología molecular y celular: En 1997, Boyer, Walker y Skou recibieron el Nobel de
Química por elucidar el mecanismo de la síntesis del ATP; Roderick MacKinnon obtuvo
dicho premio en 2003 por sus estudios de los canales de potasio en la membrana celular y
Roger Kornberg en 2006 por el análisis de la maquinaria de transcripción genética. En
2009, fue otorgado a Ramakrishnan, Steitz y Yonath por el estudio de la estructura y
función del ribosoma, complejo celular que lleva a cabo la síntesis de proteínas, y en 2012 a
Lefkowitz y Kobilka por la investigación sobre los receptores acoplados a proteínas G,
proteínas que permiten a las células detectar y responder a cambios en su entorno exterior.6

En el campo de la química inorgánica, la difracción con rayos X ha contribuido a la

obtención de la estructura de los boranos, compuestos importantes para la síntesis química,
por cuyo estudio la Academia recompensó a Herbert Brown con el Nobel de Química en
1979. Asimismo, la técnica se ha usado para determinar la estructura de los fulerenos,
materiales con interesantes propiedades físicas y químicas. En 1996, Krotro, Smalley y
Curl recibieron el premio por el descubrimiento de estas moléculas.6

En otras ocasiones se ha concedido premios Nobel por desarrollos teóricos y prácticos de la

técnica misma, reconociendo su impacto científico; en esta categoría se incluyen los
premios en Física a Max von Laue y William Henry y Lawrence Bragg, así como el de
Química de 1936 a Peter Debye y el de 1985 para Hauptman y Karle por el desarrollo de
los métodos directos para la solución de estructuras cristalinas.6

Análisis de minerales

La cristalografía de rayos X se utiliza no solo para obtener estructuras desconocidas, sino

también para determinar la composición de muestras de suelos o minerales, así como para
la identificación de metales y otros elementos. Cada sustancia mineral forma cristales con
una celda unidad y simetría determinada, que resulta en un patrón de difracción
característico. La difracción por el método de polvo es muy usada para este tipo de
aplicaciones, por ser sencillo comparar el espaciado entre los anillos de difracción con los
valores compilados por el Joint Committee on Powder Diffraction Standars (JCPDS).70 Las
proporciones relativas de dos o más minerales presentes en una misma muestra se obtienen
comparando las intensidades de sus respectivas líneas con aquellas de muestras de
composición conocida. Un ejemplo de esta aplicación es la identificación de minerales
arcillosos, la fracción del suelo cuyas partículas minerales tienen un tamaño inferior a
2 μm.8586

El vehículo explorador Curiosity, que aterrizó en Marte en 2012 para estudiar la superficie
del planeta, cuenta entre sus instrumentos científicos con un difractómetro compacto
equipado con un generador de rayos X y un detector de área.87En octubre de 2012,
transmitió las primeras imágenes de difracción, que demostraron la presencia de minerales
como feldespato, piroxeno y olivina en el suelo marciano, mezclados con material amorfo,
a semejanza de los terrenos basálticos de los volcanes de Hawái.88

Diseño de fármacos

Desde finales de siglo XX se ha empezado a diseñar nuevos fármacos y medicamentos

basados en inhibidores y sustratos naturales de diversas proteínas y enzimas involucradas
en ciclos celulares y metabólicos. El conocimiento de la estructura de la parte de la proteína
—la forma y la distribución de cargas electrostáticas— que liga estos compuestos facilita
este proceso, gracias a la mejor comprensión de las interacciones entre la proteína y el
ligando de interés; esto permite concentrarse en el diseño de fármacos con las
características específicas deseadas.89 Uno de los ejemplos más importantes de esta
aplicación es el compuesto vemurafenib, diseñado para bloquear una enzima mutante
presente en el 60 % de los casos de melanoma.90

Comparación con otras técnicas de difracción

cristalográfica
Debido a la dualidad onda-partícula, es posible estudiar cristales mediante la difracción de
un haz de neutrones o de electrones, además de con rayos X. Los primeros experimentos de
difracción por electrones tuvieron lugar en 1926 y la difracción de neutrones se observó por
vez primera en 1936. Aunque los experimentos y el análisis de datos obtenidos por
cristalografía de electrones, neutrones y rayos X tienen mucho en común, existen algunas
diferencias debidas a los diferentes modos de interacción con la materia: los electrones
interaccionan tanto con el núcleo atómico como con los electrones que lo rodean y los
factores de estructura cristalinos son unos cuatro órdenes de magnitud mayores que los
resultantes de la dispersión elástica de rayos X, lo que posibilita el estudio de muestras de
menor tamaño con electrones. Los neutrones, a su vez, son reflejados solo por el núcleo y
no los electrones, aunque estos contribuyen indirectamente al factor de forma atómico
mediante la creación de campos magnéticos; además, la interacción de la materia con ellos
es mucho más débil que con los rayos X y es necesario usar reactores nucleares para
generar haces de neutrones lo suficientemente intensos para obtener difracción cristalina.91

Una ventaja importante de la difracción de electrones es que puede combinarse con las
fases obtenidas a partir de la transformada Fourier de las imágenes del objeto en un
microscopio electrónico. En 1968, David DeRosier y Aaron Klug publicaron un método
para reconstruir mapas de densidad electrónica tridimensionales basados en este principio.92
Aunque la mejor resolución espacial de estos mapas —alrededor de 0,4 nm— es baja
comparada con los valores alcanzables con rayos X o neutrones, el procedimiento puede ser
útil en casos donde el problema de las fases impide la solución de la estructura por otros
métodos.93 En lo que respecta a la cristalografía de neutrones, la ventaja principal estriba en
la clara visualización de los átomos de hidrógeno, muy difíciles de detectar con rayos X
debido a que solo poseen un electrón; esta propiedad constituye una ventaja para el estudio
de aquellas moléculas orgánicas en cuya función tenga un papel importante el intercambio
de hidrógeno.94

Limitaciones
La limitación fundamental de la cristalografía de rayos X consiste en que solo puede
aplicarse a sustancias susceptibles de formar cristales. Aunque las técnicas cristalográficas
pueden utilizarse también para determinar la estructura de otros materiales con periodicidad
espacial, como fibras helicoidales —ADN, algunos tipos de virus, etc.— y cuasicristales,
resulta imposible estudiar gases, líquidos y sólidos desordenados por este método. Además,
la obtención de cristales no es siempre suficiente para obtener la estructura de interés: las
moléculas de tamaño grande, por ejemplo, suelen ser casos difíciles.95

Efectos de los rayos X en un enlace disulfuro: los átomos de azufre (en naranja) capturan
los fotoelectrones emitidos por los átomos presentes en la molécula al ser excitados por los
rayos X. Al reducirse, el enlace entre ellos se rompe y se desplazan de su posición original,
como indica la desaparición gradual de la densidad electrónica a su alrededor. Esto resulta
en un modelo erróneo de la estructura.

Otro límite de la técnica está relacionado con el tipo de información que proporciona sobre
la estructura: Los modelos obtenidos por difracción representan una media de las
posiciones atómicas para todas las moléculas del cristal; cuando la molécula cuenta con
átomos que oscilan entre diferentes conformaciones, la densidad electrónica media se
extiende sobre la totalidad del espacio que pueden ocupar estos átomos y las partes
desordenadas de la molécula resultan invisibles. Esto representa un serio problema para el
estudio de enzimas si el sitio activo de la molécula —asociada a su actividad química—
presenta una gran movilidad; en este caso la determinación de las propiedades de materiales
biológicos in vivo a partir de su estructura cristalina es problemática y requiere métodos de
estudio alternativos, como la resonancia magnética nuclear.

Las vibraciones atómicas también limitan la resolución alcanzable con los datos de
difracción, incluso cuando las moléculas adoptan la misma conformación en distintas
celdas unidad. La resolución del modelo no suele ser suficiente para determinar el estado de
oxidación, posicionar todos los átomos de hidrógeno o distinguir elementos con números
atómicos semejantes.9596 La débil interacción de los rayos X con los átomos ligeros es otra
desventaja de la técnica en aplicaciones, como la caracterización de nanomateriales.97

Finalmente, las propiedades ionizantes de los rayos X pueden alterar o destruir las
moléculas del cristal durante el experimento. Cuando esto ocurre, el modelo obtenido no
refleja la verdadera estructura molecular y puede dar lugar a interpretaciones erróneas sobre
sus propiedades. Además, las distorsiones globales de la red cristalina y otros efectos
secundarios de la irradiación dificultan la obtención de las fases. Este problema es grave en
cristales de proteínas, que contienen una alta proporción de agua y compuestos orgánicos
fácilmente radiolizables, y un gran número de enlaces químicos susceptibles al ataque por
los radicales libres y electrones producidos por dicha radiolisis. Los experimentos con
moléculas biológicas se suelen realizar a temperaturas de 100 K o menores; esto frena la
difusión de los radicales libres, aunque no soluciona enteramente el problema, pues los
fotoelectrones excitados por los rayos X permanecen móviles hasta el cero absoluto.9899