DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

MICROSCOPÍA
Integrantes: NRC: 3006 Fecha: 14/03/2021

• Ronny Góngora
• Felipe López
• Stefany Olmedo
• Stephanie Orozco
• Alejandra Solís

INFORME N°2

1. TEMA: Preparación y Observación de muestras en el Microscopio Electrónico de

Barrido (SEM).

2. INTRODUCCIÓN
El microscopio electrónico de barrido (SEM) utiliza un haz enfocado de electrones de alta
energía para generar una variedad de señales en la superficie de muestras sólidas. Las señales
que se derivan de las interacciones entre electrones y muestras. Para revelar información sobre
la muestra, incluida la morfología externa (textura), la composición química y la estructura
cristalina y la orientación de los materiales que componen la muestra. En la mayoría de las
aplicaciones, los datos se recopilan sobre un área seleccionada de la superficie de la muestra y
se genera una imagen bidimensional que muestra variaciones espaciales en estas
propiedades. Se pueden obtener imágenes de áreas que varían de aproximadamente 1 cm a 5
micrones de ancho en un modo de escaneo utilizando técnicas SEM convencionales (aumento
que varía de 20X a aproximadamente 30,000X, resolución espacial de 50 a 100 nm). El SEM
también es capaz de realizar análisis de ubicaciones de puntos seleccionados en la muestra
(Swapp, 2018)
La preparación de la muestra puede ser mínima o complicada para el análisis SEM, según
la naturaleza de las muestras y los datos requeridos. La preparación mínima incluye la
adquisición de una muestra que encajará en la cámara SEM y algunos ajustes para evitar la
acumulación de carga en muestras eléctricamente aislantes. La mayoría de las muestras
eléctricamente aislantes están recubiertas con una fina capa de material conductor,
comúnmente carbono, oro o algún otro metal o aleación. La elección del material para los
recubrimientos conductores depende de los datos que se vayan a adquirir: el carbono es más
deseable si el análisis elemental es una prioridad, mientras que los recubrimientos metálicos
son más efectivos para aplicaciones de imágenes electrónicas de alta resolución (Inoue et al.,
2018).

3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo General:
• Preparar y observar muestras en el Microscopio Electrónico de Barrido
(SEM).
3.2 Objetivos Específicos:
• Identificar y analizar los principales parámetros que influyen en la calidad de
la imagen en el microscopio electrónico de barrido (SEM).
• Realizar un análisis de la calidad de la imagen en muestras de levaduras
impregnadas en el bagazo utilizando diferentes voltajes.

4. METODOLOGÍA
Se realizó la preparación de las muestras, se procedió a recubrir la muestra en caso de
que no fuera conductora, luego se observó una muestra de Ácido Poli Láctico-co-
Glicólico (PLGA), después se procedió activar el detector de electrones secundarios, se
configuró la distancia de trabajo a 500nm y se corrigió el ruido generado por efecto del
astigmatismo y se empezó analizar la segunda muestra correspondiente a un polímero
recubierto con grafeno para finalizar se varió el tiempo de adquisición desde 0.55 a 14
segundos para examinar el efecto sobre la imagen.

5. RESULTADOS
• Levaduras en bagazo

Ilustración 1: Estructura de levaduras en material vegetal (bagazo), imagen

capturada a los 82 segundos con una distancia de trabajo de 9.02mm a 5.0 kV.
 Ilustración 2: Estructura de levaduras en material vegetal (bagazo), imagen
capturada a los 1,33 segundos con una distancia de trabajo de 9.01 mm a 5.0 kV.

Ilustración 3: Estructura de levaduras en material vegetal (bagazo), imagen

capturada a los 54 segundos con una distancia de trabajo de 9.01mm a 5.0 kV.
 Ilustración 4: Estructura de levaduras en material vegetal (bagazo), imagen con
una distancia de trabajo de 8.93mm a 25.0 kV.

Ilustración 5 Levaduras impregnadas en bagazo. Distancia de trabajo 8.32 mm. Foco efectivo se muestra en la flecha azul.
Ilustración 6 Levaduras impregnadas en bagazo. Distancia de trabajo 10.58 mm. Foco efectivo se muestra en la flecha roja.

2. Nanopartículas de plata sobre cintas de carbono

Ilustración 8 Se observan nanopartículas de plata sobre cintas de carbono. A. Electrones secundarios. B. Electrones
retrodispersados. Imagen adquirida con detectores simultáneos.

6. DISCUSIÓN
SEM es una herramienta que permite observar materiales tanto orgánicos como
inorgánicos, incluyendo metales, polímeros, tejidos biológicos y nanopartículas; lo cual se
logra mediante la administración de una fuente de electrones que inciden sobre la muestra
para arrojar una imagen. La calidad de la observación de la imagen por SEM dependerá
tanto de los electrones secundarios como los electrones retrodispersados, pues cuando se
dirige un voltaje positivo a la pantalla del colector, se recopilarán tanto SE como BSE. Sin
embargo, al aplicar un voltaje negativo en la pantalla del colector, solo se recopilará
electrones retrodispersados. Otro aspecto importante es la distancia de trabajo,
comprendida desde la última lente hasta la superficie de la muestra que se está observando,
la distancia de trabajo tiene un efecto directo sobre el aumento y se puede ajustar de acuerdo
al requerimiento de forma manual o automática dependiendo el equipo (Azad & Avin,
2019).
SEM requiere que la muestra se encuentre al vacío debido a que los electrones no se
propagan en la atmósfera o en el líquido, dando lugar a una desventaja para la observación
de materiales cuyo punto de ebullición es relativamente bajo como agua u otros fluidos
biológicos en donde se produce la destrucción de las muestras. Para contrarrestar los efectos
negativos se debe controlar el entorno de vacío dentro del SEM para reducir tasas de
evaporación, se puede realizar observaciones en alto vacío y en bajo vacío (Inoue et al.,
2018).
De acuerdo a los detectores acoplables al SEM, estos dependen de la finalidad del ensayo
a realizar. Antes de proceder, se debe definir el tipo de muestra a analizar (i.e. metal,
mineral inorgánico, compuesto orgánicos, etc.) debido a que cada posible muestra tiene
características que interactúan de una u otra forma con el haz de electrones emitido por el
microscopio electrónico de barrido (Echlin, 2009).
Por ejemplo, muestras ricas en compuestos orgánicos, como las estudiadas en clases (i.e.
levaduras), se caracterizan por su alto contenido de humedad y baja capacidad conductora,
esto implica la necesidad de deshidratar las muestras para evitar interferencias con los
electrones y de un recubrimiento para facilitar la visualización, respectivamente, (Echlin,
2009; Fischer et al., 2012). En teoría, voltajes más altos, aperturas más pequeñas, tamaños
de puntos más pequeños y distancias de trabajo más cortas equivalen a una mejor
resolución, lamentablemente, en la práctica, sin embargo, los ajustes óptimos varían
ampliamente según la aplicación y por eso necesidad de utilizar uno u otro detector.
Algunas de las imágenes estudiadas tienen la presencia de nanopartículas de plata. El SEM
al resolver imágenes superficiales permite la detección de diferentes tamaños de partículas,
distribuciones de tamaño, formas de nanomateriales y la morfología de la superficie de las
partículas sintetizadas a micro y nanoescalas; asimismo, esta herramienta permite estudiar
la morfología estructural de las partículas y derivar un histograma a partir de las imágenes
midiendo y contando las partículas manualmente o usando un software específico. La
combinación de SEM con espectroscopia de rayos X de dispersión de energía (EDX) se
puede utilizar para examinar la morfología del polvo de plata y también realizar análisis de
composición química (Zhang et al., 2016).
7. CONCLUSIONES
• La primera consideración a tener presente previa la realización de un ensayo
es que el equipo a utilizar debe estar calibrado, esto asegura la producción
de imágenes de alta calidad y limita las preocupaciones a otros parámetros
como las características intrínsecas del equipo y el ambiente en donde se
realice el ensayo, así también como la experiencia del operador.
 • De manera general, para obtener una buena imagen mediante SEM se debe
preparar correctamente la muestra a observar, además de controlar
adecuadamente los parámetros como voltaje, apertura, tamaño de punto y
distancia de trabajo.
• Pese a ser una potente herramienta, el SEM carece de la capacidad para
resolver la estructura interna de las partículas analizadas, sin embargo,
puede proporcionar información valiosa sobre la pureza y el grado de
agregación de partículas.

8. BIBLIOGRAFÍA
Azad, M., & Avin, A. (2019). Scanning Electron Microscopy (SEM): A Review. Proceedings
of 2018 International Conference on Hydraulics and Pneumatics - HERVEX, January,
1–9.
Echlin, P. (2009). Sample Exposure. In Handbook of Sample Preparation for Scanning
Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis (pp. 65–95). Springer US.
https://doi.org/10.1007/978-0-387-85731-2_6
Echlin, P., & Echlin, P. (2009). Sample Collection and Selection. In Handbook of Sample
Preparation for Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis (pp. 11–18).
Springer US. https://doi.org/10.1007/978-0-387-85731-2_2
Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., & Dorward, D. W. (2012). Scanning
electron microscopy. Current Protocols in Microbiology, CHAPTER(SUPPL.25),
Unit2B.2. https://doi.org/10.1002/9780471729259.mc02b02s25
Inoue, N., Takashima, Y., Suga, M., Suzuki, T., Nemoto, Y., & Takai, O. (2018).
Observation of wet specimens sensitive to evaporation using scanning electron
microscopy. Microscopy, 67(6), 356–366. https://doi.org/10.1093/jmicro/dfy041
Swapp, S. (2018). Microscopía electrónica de barrido (SEM).
https://serc.carleton.edu/research_education/geochemsheets/techniques/SEM.html
Zhang, X. F., Liu, Z. G., Shen, W., & Gurunathan, S. (2016). Silver nanoparticles: Synthesis,
characterization, properties, applications, and therapeutic approaches. In International
Journal of Molecular Sciences (Vol. 17, Issue 9). MDPI AG.
https://doi.org/10.3390/ijms17091534