TÉCNICAS BÁSICAS de
DIAGNÓSTICO PATOLÓGICO
en PECES
Carlos Zarza
Servicio de Patología de Peces
SKRETTING
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
Prólogo
No se pretende que se sigan todos los protocolos al pie de la letra, sino que cada
persona en cada situación concreta adapte paras sí las técnicas que crea conveniente
y le resulten más eficaces.
19 de junio 2005
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
INDICE
1.- Bases Diagnósticas en Patología de Peces ........................................................ 4
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
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mortalidad
Plan de control
A B
tiempo
Tiempo de reacción
Nivel de detección
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Por ello hemos de tener siempre en mente que el éxito o fracaso de la gestión
sanitaria en nuestra instalación dependerá de esta tríada de actuaciones
Si el tiempo de reacción desde que detectamos el problema hasta que se apliquen las
medidas de control va a ser más o menos constante, muchas veces la efectividad de
estas medidas radicará en detectar la causa del problema lo más rápido posible desde
su aparición en la granja.
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
Por ello recomendamos realizar un acercamiento mucho más cauto y prudente a los
problemas. Frecuentemente los problemas patológicos en centros de acuicultura,
núcleos zoológicos o en el medio natural suelen ser complejos, multifactoriales y de
explicación compleja.
D
C
B
ENTRADA = SALIDA =
ANAMNESIS ANALISIS Y
DIAGNÓSTICO
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
Como esto puede sonar a filosofía “barata” y para entendernos, la descripción de este
proceso la realizaremos a partir de un supuesto práctico:
Por qué puede ser un grave error? Porque posteriormente la evaluación del problema
la realizaremos prácticamente en base a solo lo que hayamos podido encontrar en
esos peces. Evidentemente, es fácil que podamos encontrar algo anormal en esos
peces e incluso identificar la presencia de agentes extraños en ellos (parásitos, lo más
habitual). El problema posiblemente aparecerá cuando queramos atribuir la mortalidad
a uno o varios de esos agentes. En este caso, ¿estaríamos haciendo un diagnóstico
real o buscando una especie de “chivo expiatorio”? Desgraciadamente aún siguen
realizándose diagnósticos erróneos de esta manera, con los graves problemas que
esto comporta ya que posiblemente los tratamientos planteados con este diagnóstico
equivocado no sean efectivos y a veces incluso contraproducentes.
Por ello siempre es preciso abordar los problemas en patología de peces con una
mentalidad abierta, sin juicios previos (aunque evidentemente podamos tener
sospechas previas) e intentando primero de todo obtener información y analizar cada
uno de los “contextos” que hemos indicado antes.
Hay que recordar que “sólo podremos encontrar aquello que conocemos”, en este
sentido es MUY importante y recomendable que los técnicos que tengan que realizar
funciones de diagnóstico puedan disponer del tiempo y de los medios necesarios para
“ponerse al día” de estos temas, sea leyendo libros y artículos especializados,
acudiendo a seminarios, congresos, reuniones, a través de foros en internet y sobre
todo manteniendo un contacto permanente y fluido con otros técnicos y especialistas
en patología de peces.
Asimismo es importante conocer datos recientes sobre la situación de los cauces
fluviales o zonas marinas (disponibilidad y calidades de agua), situación meteorológica
(lluvias torrenciales, vientos, sequía…), etc.
Con todos estos datos y sin darnos cuenta nos iremos haciendo a la idea de ese
contexto general y podremos tener ya algunas orientaciones sobre determinados
parámetros que pueden (o no) modular el desarrollo del problema detectado.
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
Una vez nos hayamos familiarizado con las características del centro, es el momento
de pasar al nivel siguiente, el contexto de la población afectada. En este punto es
necesario obtener datos sobre qué parte o partes del sistema se encuentran
afectados. Es posible que el problema pueda expresarse solamente en unos
estanques/ tanques/jaulas determinados, en una especie en particular (si coexisten en
el sistema dos o más especies), en un rango de edad específico, en peces de una
determinada procedencia, en peces que han sido alimentados o han recibido un
manejo especial, etc.
Una vez tenemos acotada de forma mas precisa cómo se distribuye el problema en el
centro, pasamos a la parte final, lo que seria el corazón del problema, que sería el
contexto particularizado de los peces afectados. En este punto es preciso obtener el
máximo posible de datos para que se puedan analizar posteriormente.
Como hemos comentado anteriormente, ahora sólo queda proceder con los protocolos
de diagnóstico correspondientes a las técnicas diagnósticas seleccionadas y esperar a
conocer los resultados. La descripción pormenorizada de estas técnicas de
diagnóstico y de sus protocolos serán tratadas más adelante.
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
El diagnóstico es sin duda la parte más difícil de todo este proceso. En la primera parte
pueden seguirse unas guías más o menos completas. Sin embargo, en el diagnóstico,
la utilización de guías o cuadros es mucho más compleja y depende en buena manera
de la habilidad y experiencia del técnico encargado de emitir este diagnóstico.
Además, es probable que no se dispongan de elementos de juicio suficientes para
emitir un diagnóstico suficientemente claro.
Nuestra experiencia demuestra que uno de los aspectos que pueden mejorar las
habilidades diagnósticas es mejorar el conocimiento de la epidemiología aplicada a la
ictiopatología. Por ello hemos incluido un apartado específico sobre Epidemiología en
este bloque con el objetivo de intentar llenar algunas lagunas sobre determinados
conceptos epidemiológicos y su tratamiento, que creemos son importantes a la hora
de recoger y valorar la información así como en la realización de un diagnóstico.
Evidentemente también es muy importante tener una base lo más amplia posible sobre
conocimientos de patología de peces. Estos conocimientos los podemos adquirir a
través de varios canales: Cursos, libros, revistas, internet. Los veremos en el apartado
final de este capítulo.
Hemos comentado antes que muchas veces las patologías en las explotaciones
acuícolas son procesos multifactoriales y complejos y no siempre es fácil llegar a un
diagnóstico definitivo. Siempre se requerirá esfuerzo, tiempo y práctica para dominar
todas las técnicas que requiere el “arte” del diagnóstico.
Desde nuestro punto de vista, no es tan importante el “qué es”, sino reconocer si lo
que vemos es “normal” o no. Al piscicultor, que está cada día trabajando con los
peces, le puede costar diagnosticar una enfermedad, pero no reconocer si sus
animales están enfermos o no, y qué pasos debe dar para a partir de ese momento
para llegar al diagnóstico final. Esa identificación de los transtornos de salud, será
clave en el diagnóstico rápido. Y por ello determinante en el proceso de prevención.
Una vez detectado el problema, podrá él mismo aplicar las técnicas correspondientes
o enviar una muestra a un laboratorio especializado. Esa “reacción rápida” es lo
fundamental. Más delante repasaremos cómo podemos reconocer la presencia de
enfermedad en los peces.
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
De una forma parecida, cada una de las explotaciones tiene unas tasas de mortalidad
“basales” que dependerán siempre de las circunstancias propias de la empresa y de
su capacidad de gestión. Si las asumimos como “naturales” podemos caer en el error
de pensar que son invariables y no mejorables.
Con esta información, ¿podría ser cero la mortalidad natural en una piscifactoría?
A pesar de lo que podemos aportar en este curso y en el trabajo diario, son muchos
los aspectos que desconocemos sobre etiología, patogenia, epidemiología, prevención
y tratamiento de las enfermedades de peces. Rara vez disponemos de “enciclopedias
de todo el saber” o “recetas mágicas” donde podamos tener métodos operativos
precisos con resultados garantizados.
Uno de estos problemas derivados de esta falta de conocimientos son las infecciones
latentes. Como infección latente o “encubierta”, en un sentido laxo, podemos incluir a
aquellas infecciones por organismos biológicos cuyo nivel de presencia es difícilmente
detectable por la técnicas de diagnóstico empleadas. Por ello, de nuevo hay que
reafirmar en que un diagnóstico nunca debe basarse en el resultado de una única
prueba diagnóstica sino en el razonamiento de todos aquellos datos disponibles sobre
el contexto total que rodea a un grupo de peces.
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LIBROS
Manual on Hatchery Production of Sea bass and Gilthead Sea bream. FAO, 1999
Aquaculture for veterinarians: Fish husbandry and medicine. Editor Lydia Brown.
Pergamon Press 1993. (También en castellano: Editorial Acribia)
Fish Disease. Diagnosis and Treatment. Noga, E.J. Iowa State University Press /
Ames. 2000
Manual on Hatchery Production of Sea bass and Gilthead Sea bream. FAO, 1999
Fish Diseases and Disorders: Volumes 1, 2& 3. CABI Publishing. 1995, 1998, 1999
What should I do. A practical guide for the marine fish farmer . Bruno D.W.,
Alderman, D.J. and Scholtfeldt H.J. European Association of Fish Pathologists. (En
inglés y castellano).
Bacteria from Fish and Other Aquatic Animals: A Practical Identification Manual.
Buller, N.B. CABI Publishing. 2004
Systemic Pathology of Fish. Ferguson, Hugh W. Ames, Iowa Iowa State University
Press 1989
Anaesthetic and Sedative Techniques for Aquatic Animals 2nd ed. Lindsay G.
Ross and Barbara Ross, Blackwell Science, 1999.
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REVISTAS CIENTÍFICAS
Aquaculture
http://www.elsevier.com/wps/find/journaldescription.cws_home/503302/description
Aquaculture International
http://www.ingentaconnect.com/content/klu/aqui
ENLACES DE INTERNET
Taxonomía Bacteriana
http://www.bacterio.cict.fr/index.html
Revista AquaTIC
http://www.revistaaquatic.com/
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AquaFeed
http://www.aquafeed.com/
Aqua-Flow
http://www.aquaflow.org/
IntraFish
http://www.intrafish.com/
UF / IFAS
http://edis.ifas.ufl.edu/
Buscadores científicos
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Buscadores generales
http://www.google.com/
http://www.yahoo.com/
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
•Raza
•Sexo •Resistencia
•Edad •Tropismo
POBLACIÓN AGENTE
AMBIENTE
•Manejo
•Climatología
•Vectores
Las bacterias o parásitos viven en equilibrio con sus huéspedes, los peces, y, en
situaciones normales, no va a existir enfermedad. En la piscicultura intensiva, los
factores estresantes son los que frecuentemente van a desplazar la balanza en favor
de los agentes infecciosos y desencadenarán las enfermedades.
Muchos de los problemas patológicos que nos vamos a encontrar en las instalaciones
piscícolas van a ser resultado de diferentes interacciones entre estos factores
determinantes.
Sea cual sea el tipo de epidemiología que apliquemos, el hecho de trabajar con
poblaciones implica necesariamente que los resultados obtenidos deben ser
expresados numéricamente. De ello deriva la importancia de la cuantificación en
epidemiología.
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
Proporción y ratio
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
Enfermedad
Positivo Negativo
Verdaderos positivos Falsos positivos
Positivo
VP FP
Prueba
Falsos negativos Verdaderos negativos
Negativo
FN VN
Se = VP / (VP+FN)
Ep = VN / (VN+FP)
VP+ = VP / (VP+FP)
VP- = VN / (VN+FN)
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
2.5.- MUESTREOS
Cuando realizamos un estudio a partir de una muestra, los valores obtenidos son una
estimación de lo que realmente sucede en la población. Sin embargo, después de
obtener estos datos nos puede surgir una pregunta: ¿los resultados obtenidos a partir
de esta muestra pueden ser extrapolados la población general? O, en otras palabras,
¿serán el reflejo de lo que pasa en esta población? Si la respuesta es no, habremos
hecho un trabajo en vano, por lo cual es importante seleccionar previamente una
muestra adecuada.
La exactitud nos da una idea de cuanto se acerca nuestra estimación a los valores
reales en la población. Para que esta estimación sea lo más exacta posible, la muestra
ha de ser representativa de la población. Esto lo conseguiremos mediante la selección
aleatoria. El muestreo aleatorio nos asegura que cada individuo de la población a
estudiar tiene las mismas posibilidades de ser seleccionado.
Ejemplo: Hacer estudios de prevalencia de enfermedades diagnosticadas en nuestro
Servicio de Diagnóstico no sería correcto, pues las muestras que nos remiten no son
representativas de la población general, ya que la mayoría provienen de peces
sintomáticos que no se han recogido de forma aleatoria.
MUESTREOS NO PROBABILÍSTICOS
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
En algunos casos este tipo de muestreo intencionado es muy adecuado, como el que
se realiza normalmente para la detección de una enfermedad, por ejemplo, en caso
de sospechar de un brote de Vibriosis en lubina. El técnico evidentemente recogerá
peces sintomáticos (peces con hemorragias en piel y órganos internos) El resultado
de ese estudio posiblemente pueda confirmar la presencia de Listonella anguillarum y
por lo tanto del brote de Vibriosis, aunque no va a permitir determinar qué cantidad de
población se encuentra afectada. Seguramente si calculáramos la prevalencia a partir
de estas muestras tendríamos una sobrestimación de la misma.
MUESTREOS PROBABILÍSTICOS
Las muestras se seleccionan al azar de una población, cada miembro de la cual tiene
las mismas posibilidades de ser elegido. Es imprescindible tener una lista de todos los
individuos de la población, lo que se conoce como marco del muestreo. Este método lo
aplicaríamos en el caso de considerar que toda la población sea homogénea o
uniforme.
Ejemplo: Tenemos en una explotación mayorista de peces ornamentales un stock de
neones repartidos en doce tanques a los que queremos chequear de una determinada
enfermedad (por ejemplo, presencia del microsporidio Pleistophora). Cada tanque esta
numerado del uno al doce y el modelo de muestreo nos dice que es necesario
chequear cuatro de los doce tanques. Lo que podemos hacer para seleccionar estos
tanques es utilizar tablas de números aleatorios o bien aplicar la función matemática
“random” existente en muchos programas informáticos. Lo mismo se puede aplicar a
peces, asignando un número a cada uno (aunque esto lo reservaríamos tal vez para el
caso de tener peces de alto valor, como en el caso de reproductores o peces de
exhibición.
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
Existen también otros modelos más complicados, aunque a efectos prácticos sólo se
requieren en el caso de estudios epidemiológicos determinados.
Existe un software informático específico que podemos utilizar para realizar el cálculo
del tamaño de la muestra, como el STATCALC o WINEPISCOPE.
Podemos expresar algunos casos prácticos sencillos, pero muy frecuentes, en los que
se puede obtener un número de muestra concreto.
a) El tamaño de población
b) Prevalencia supuesta de la enfermedad
c) Nivel confianza del test
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
En este caso, suponiendo que la técnica diagnóstica tiene una sensibilidad total, nos
aseguramos que recogiendo ese número de muestras y con un nivel n de confianza
determinado detectaremos al menos un pez enfermo, en el caso de que exista
enfermedad.
Para calcular al tamaño de la muestra podemos utilizar una complicada fórmula o, más
fácilmente, utilizar las tablas apropiadas. A continuación resumimos una de ellas, con
un nivel de confianza del 95% (uno de los más razonables).
Tamaño de la población
P
100 500 1000 5000 10000 25000 50000 100000 500000 1.106
0.1% --- --- 950 2253 2587 2822 2906 2950 2985 2990
0.5% --- 349 450 563 580 591 595 596 597 598
1% 95 224 258 289 294 295 296 296 296 296
10% 25 28 28 28 28 28 28 28 30 30
a) El tamaño de población
b) Prevalencia esperada de enfermedad
c) La precisión o error
d) Nivel confianza del test
También podemos aplicar la fórmula adecuada o una serie de tablas que nos van a
relacionar el tamaño de la muestra a elegir, con la precisión deseada y la prevalencia
esperada. Si desconocemos este último valor, se asumirá una prevalencia del 50% y
escogeremos el mayor tamaño de muestra.
Así, para un tamaño grande de población y con un nivel de confianza del 95%:
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
2. Recoger peces sólo del fondo, de superficie, cerca de la entrada de agua o cerca
del sumidero: Seguro que recogemos peces enfermos o con problemas.
Para evitar estos errores (por otra parte MUY frecuentes) recomendamos agrupar los
peces antes de tomar la muestra. En tanques es posible hacerlo mediante redes. Es
muy importante que esta operación se haga de forma correcta, impidiendo que se
escapen peces. Una vez esta concentrada TODA la población a muestrear (y los
peces están bien concentrados) coger un salabre mas pequeño y recoger una
submuestra “generosa” en número. Hay que ir con cuidado que al concentrar los
peces no se estratifiquen por pesos. De estas submuestra la volvemos a concentrar y
cogemos al azar el número de ejemplares necesarios.
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
Existen dos tipos de estudios analíticos, los estudios observacionales y los estudios
experimentales.
No es objetivo de este curso el explicar para que sirven, como se estructuran y como
se realizan. Para ello es aconsejable consultar con un especialista en epidemiología o
bien consultar las obras y referencias citadas en la bibliografía.
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
Niveles de actuación
El primer paso a dar cuando nos enfrentamos ante el problema, es recopilar la mayor
cantidad de información posible sobre el mismo y registrarla en una ficha o historial
clínico para su posterior análisis. Nuestra experiencia nos dice que, la mayoría de
veces, esos datos serán imprescindibles para llegar a la causa final del problema. Al
final del manual incluimos un modelo de ficha clínica.
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
Y finalmente:
Parece una lista demasiado amplia, pero hay que insistir y no debemos preocuparnos
por “bombardear” a preguntas para obtener los datos que creamos necesarios para
realizar nuestro diagnóstico. Aunque nosotros realizaremos nuestras técnicas de una
forma ordenada, sistemática y completa, es fundamental que antes de empezar a
examinar los peces tengamos una idea en mente del problema al que nos
enfrentamos.
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
Si el pez va a ser o puede ser sacrificado para su análisis, entonces hay que proceder
lo antes posible al sacrificio del mismo. El sacrificio de los animales puede realizarse
de diversas formas:
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
Una vez hayamos comprobado la muerte de los animales podremos empezar con el
resto de protocolos de diagnóstico.
Cuando debamos obtener muestras de animales que no van a ser sacrificados hemos
de considerar que su manejo debe de ser especialmente cuidadoso, más aún es
especies clásicamente sensibles como la mayoría de los peces ornamentales marinos
y algunas especies comerciales como las lubinas. A continuación indicamos algunas
de las medidas que hemos de tomar:
- Manejo: Para manejar los animales hemos de tener en cuenta que su piel es
mucho más sensible que la de los mamíferos debido a la presencia de moco, la
delgadez de la epidermis y la falta de queratina. Por ello, durante la manipulación
de los peces los peores enemigos son: las abrasiones de la piel, la pérdida de
moco y la deshidratación.
- Para evitar las abrasiones es aconsejable o bien manipular los peces con
guantes de plástico o látex. En caso de no disponer de ellos, recomendamos
humedecer las manos unos 30 segundos con el fin de reblandecer la queratina
de la piel de la mano y hacerla menos áspera. Personalmente recomiendo este
tipo de manejo para especies muy resbaladizas (anguila, trucha) cuyo manejo
con guantes puede verse dificultado. Sin embargo, el uso de guantes es
recomendable por motivos higiénicos y para la prevención de algunas de las
escasas zoonosis transmisibles en peces como las Micobacteriosis.
- Para evitar la pérdida de moco evitaremos realizar las operaciones de manejo
sobre superficies rugosas o absorbentes. Buscaremos superficies lisas,
impermeables y a poder ser no duras. Hemos de evitar en lo posible el uso de
esponjas, bayetas, toallas o papeles y utilizar plásticos y bases de goma.
Evidentemente estas superficies son más resbaladizas pero a su vez son
menos traumáticas
-
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
SEDACIÓN Y ANESTESIA
Existen distintos productos que podemos utilizar para sedar o anestesiar a los peces.
Generalmente el mismo tipo de producto anestésico tiene propiedades de sedación,
utilizado a dosis menores o con menores tiempos de inducción. Normalmente estos
productos se añaden al mismo agua.
Para una correcta anestesia o tranquilización hemos de considerar los siguientes
puntos:
- Hemos de sedar /anestesiar los peces en un pequeño volumen de agua y dejar un
recipiente con suficiente cantidad de agua sin anestésico para su recuperación.
- La recuperación en el caso de anestesia por inhalación (anestésico en el agua) la
recuperación se realiza de forma rápida después de transferir los peces a agua sin
anestésico. Se puede forzar esta recuperación forzando la natación a
contracorriente, poniéndolos debajo de un chorro de agua o un burbujeo fuerte.
- La solución anestésica debe estar a la misma temperatura que el agua de origen.
- El anestésico debe mezclarse de forma eficiente con el agua (muchos anestésicos
son bastante hidrófobos)
- Hemos de observar los distintos movimientos de los peces durante la inducción, lo
que nos indicará el plano de sedación o anestesia que se encuentra. Estos
comportamientos se definen en la siguiente tabla:
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
Para las manipulaciones habituales como por ejemplo para la toma de sangre es
suficiente con una anestesia ligera. Para la toma de biopsias recomendamos una
anestesia profunda o quirúrgica.
BIOPSIAS
Otra técnica de biopsia que puede realizarse sin demasiado problema es la biopsia
branquial. Con el animal suficientemente sedado o anestesiado, y mediante unas
tijeras finas podemos cortar una pequeña porción de filamentos branquiales a nivel del
tercio proximal del arco branquial. Debido a que se trata de un órgano fuertemente
vascularizado, después de la excisión la branquia seccionada suele sangrar.
Personalmente utilizo una ligera cauterización con un instrumento metálico fino
(fórceps, pinzas) calentado moderadamente con un mechero, para cortar la
hemorragia, añadiendo sobre esa zona una pomada dérmica mezclada con antibiótico
(sulfamidas) en polvo para evitar en lo posible la infección en esa herida. Sin embargo,
en muchos de los casos, la herida coagula rápidamente si más en contacto con el
agua.
Una vez obtenidas, la biopsias de piel o branquia pueden mantenerse durante un corto
tiempo en solución salina o suero fisiológico, aunque deben ser siempre examinadas
lo antes posible. También es posible obtener muestras de órganos internos mediante
laparatomía, aunque esta técnica es más complicada y no es el objeto de este curso.
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
¿Como vamos a reconocer que existe una enfermedad en nuestra explotación? ¿Sólo
por que existe mortalidad? NO, GRAVE ERROR: No siempre tenemos que esperar a
que aparezcan la “bajas” para poder detectar que existe un problema en mi granja.
Como comentamos antes, la experiencia de los cuidadores o alimentadores en el día a
día, siendo capaces de detectar si un pez esta enfermo o normal, es fundamental en
este punto.
HISTORIAL PREVIO
Por otro lado, y si es posible, cuando llegan los momentos más críticos del año no está
demás reforzar la comunicación con nuestros colegas vecinos (otros piscicultores) o
consultar a patólogos expertos para ver como está la situación de esa enfermedad
concreta tan grave, si la tenemos cerca y estar preparados.
Variaciones medioambientales
El famoso “estrés” que sufren los peces durante un trabajo rutinario, como un
movimiento o transporte, muchas veces va a desencadenar un problema patológico
debido a la inmunodepresión consecuente. Es importante destacar que cuanto más
severa es una situación estresante, más tardarán los peces en recuperarse (de 1 a 3
semanas) Durante todo ese periodo la población será más susceptible de padecer
infecciones y enfermedades.
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
Es importante recordar que los peces enfermos no suelen comer, y pierden el apetito.
La monitorización de los parámetros productivos, como el crecimiento y la conversión,
es fundamental a la hora de detectar un problema.
Si en los muestreos mensuales nos damos cuenta que los peces no han crecido como
deberían, quizás sea una buena idea chequear bien los lotes, por si hubiera algún
problema patológico subyacente.
CAMBIOS DE COMPORTAMIENTO
Los peces en las unidades de cultivo suelen nadar en grupo. Si vemos algunos
aislados y que nadan de forma separada, quizás estén enfermos. Si los peces están
en superficie boqueando, con los opérculos muy abiertos y en cabecera del estanque
puede ser sintomático que de que les falta oxígeno (por ejemplo, niveles bajos de
oxígeno en el estanque o por qué no, una parasitosis severa branquial)
Tipo de natación
Actividad respiratoria
MORTALIDAD
No sólo hay que darse cuenta de que se mueren los peces, sino de cómo se mueren.
Tenemos que estudiar la evolución en el tiempo de esta mortalidad. Si de un día para
otro nos aparecen mil peces muertos, no existe ningún proceso infeccioso que de un
día para otro tenga ese patrón. Este tipo de mortalidades suelen ser debidas a
alteraciones medioambientales o problemas de estrés sobreagudos (falta de oxígeno,
temporales, accidentes) En general, los procesos agudos suelen estar causados por
virus y algunas bacterias; y los procesos crónicos serán debidos a parásitos y
bacterias. De todas formas es necesario conocer la epidemiología de cada
enfermedad y saber cuál es el patrón de mortalidad característico que que suele
provocar.
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
En una población de peces de cultivo tenemos una distribución normal de tallas, donde
encontraremos una mayoría de peces “normales”, y una serie de “cabezas” y “colas”
cuyo número normalmente dependerá de lo bien que esté clasificado ese lote.
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
A veces, según el tipo de instalación, como las jaulas flotantes, puede ser difícil
recoger las muestras si los peces no están “claramente” enfermos. A veces lo más
fácil es echar un poco de pienso y cogerlos ¡ Eso es un error fatal ! En esta muestra,
los peces estarán sanos (recordad la distribución normal mencionada antes) y
podemos no encontrar el origen del problema. Perderemos un tiempo precioso para
iniciar el tratamiento. Por ello insistimos: Hay que recoger las muestras de forma
correcta y utilizando todo el tiempo que sea necesario. De los bien que se haga
dependerá el éxito de todo el análisis posterior.
Por otro lado es importante conocer la forma de enviar las muestras según el tipo de
análisis a realizar.
No debemos olvidar enviar una historia clínica y, si es posible, AVISAR al laboratorio
donde vamos a enviar ka muestra.
Parasitología +++ ++ ++ ++ ++
Bacteriología +++ ++ - - -
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
La mejor forma de enviar muestras es siempre peces vivos. Si estos peces se han de
transportar durante distancias largas o periodos largos de tiempo antes de llegar al
laboratorio, los peces deben embalarse en buenas condiciones. Estos son algunos
consejos:
- Deben situarse en bolsas de plástico resistente (si pueden ser dobles, mejor) que
estarán convenientemente identificadas con el número de la unidad de cultivo.
- Estas bolsas deben llenarse con 1/3 parte de agua (a poder ser, la misma donde
están los peces)
- Las 2/3 partes restantes deben ser llenadas con oxígeno (si se hace con aire, el
oxígeno en agua bajará de forma extremadamente rápida).
- Debemos sellar convenientemente la bolsa y depositarla en un contenedor
adecuado. Las cajas de porex suelen ser muy adecuadas por ser relativamente
baratas, resistentes y aislantes. El contenedor puede ser rellenado con virutas o
con papeles para que quede bien encajada.
- Pondremos algunas bolsas con hielo encima y debajo de la bolsa con peces para
evitar las subidas de temperatura (importante en verano) o bien bolsas de "calor
químico" si se prevén temperaturas por debajo de las óptimas de los peces
(especialmente especies tropicales en envíos en invierno).
- El volumen máximo de biomasa de peces a transportar debe ser como norma no
superior a 1/4 parte del volumen de agua.
- No deben enviarse de esta forma peces con peso superior a los 250 gramos ya
que soportan mal este tipo de transporte. Hay que ir con mucho cuidado con enviar
peces enfermos puesto que es posible que no soporten el viaje y lleguen muertos
- Si se puede, los peces deben estar en ayunas 24/48 horas para evitar que se
ensucie el agua de transporte.
Para enviar peces refrigerados, utilizaremos las mismas bolsas de plástico donde
introduciremos los peces, SIN AGUA. Las cerraremos bien y las colocaremos en las
cajas de porex o contenderos estanco adecuado. Alrededor colocaremos hielo picado
en otra bolsa o placas congeladoras. Importante: Que no contacten nunca los peces
con el agua. Este será el sistema de elección para peces grandes y enfermos.
O2
h h
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Observación externa
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
Necropsia
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PROCEDIMIENTO DE LA NECROPSIA
Como se indicará más adelante, esta técnica debe ser modificada si se desean obtener
muestras para pruebas complementarias, especialmente en el caso de bacteriología.
Material necesario:
- Pinzas: Es suficiente con unas pinzas de dientes de ratón y unas pinzas más finas de
superficie de contacto estriada. Pueden ser también de utilidad unas pinzas
hemostáticas para separar órganos y tejidos.
- Bisturí con hojas de recambio, aunque debido a la menor consistencia de los órganos y
tejidos en los peces nuestra experiencia nos demuestra que hojas de afeitar, “cutters” o
de cualquier otro tipo son muy útiles para realizar secciones de forma rápida y fácil.
Protocolo de necropsia:
Con el animal recostado sobre su lado derecho, realizaremos la necropsia siguiendo los
siguientes pasos:
1.- Extracción del globo ocular de la órbita. Lo observaremos y realizaremos una incisión
en su plano medio para evidenciar su interior. Nos fijaremos en su forma, la presencia
de la retina y el cristalino, su aspecto y la presencia de alteraciones como masas
anormales de tejido, sangre, burbujas de aire, opacidad de córnea o de cristalino, etc.
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- Realizaremos una tercera incisión uniendo los dos cortes en la zona branquial y
podremos levantar la pared abdominal.
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Esta técnica es bastante variable según la especie y la localización del cerebro en ésta.
La apertura puede iniciarse por una incisión entre las narinas, para seguir de forma
simétrica hacia la zona superior de cada una de las órbitas oculares. Desde esta zona
hay que seguir cortando el cráneo en dirección caudal hasta llegar a la zona de
separación entre cráneo y tronco y unir las dos incisiones paralelas. Posteriormente y
haciendo palanca con las pinzas, levantar cuidadosamente para exponer el encéfalo.
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5- Observación de la musculatura
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
Además de la necropsia, puede hacerse una observación con lupa binocular de los
órganos, además de una serie de pruebas directas que son de realización fácil y rápida
que son muy útiles en el diagnóstico patológico en peces, sobre todo en planta. Estas
pruebas son las siguientes:
- RASPADOS DE PIEL
- PREPARACIÓN EN FRESCO DE BRANQUIA
- "SQUASHES" DE TEJIDO: Cerebro y órganos internos
- IMPRONTAS DE BRANQUIA
- IMPRONTAS DE TEJIDOS
- PREPARACIONES DE LÍQUIDO BILIAR Y ASCÍTICO
- PREPARACIONES DE CONTENIDO INTESTINAL
- PREPARACIONES DE MUSCULATURA
Raspados de piel
a/ Raspar la superficie del cuerpo y de las aletas del pez a examinar usando una hoja de
bisturí o simplemente mediante un portaobjetos. Aconsejamos realizar esta maniobra en
dirección cráneo-caudal ya que en dirección contraria podemos levantar demasiadas
escamas (en los peces que las posean) que pueden enmascarar la observación,
especialmente si no se tiene una cierta experiencia.
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Esta sencilla técnica puede darnos, con un mínimo de experiencia, bastante información
acerca del estado y las patologías de un órgano diana como la branquia.
a/ Tomar uno de los arcos branquiales y separar parte de los filamentos del eje del arco
hasta que se individualicen los distintos filamentos.
b/ Repartir los diferentes filamentos sobre un portaobjetos (que no queden uno sobre
otro), cubrir con un cubreobjetos e introducir solución salina de la misma forma que
describimos en el raspado de piel.
"Squashes” de tejido
Esta técnica está especialmente indicada para la detección de parásitos en los órganos.
b/ Cubrir con un cubreobjetos haciendo presión suave hasta que vemos que el tejido se
expande e introducir solución salina de la misma forma que describimos en el raspado
de piel.
c/ Observar al microscopio
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
a/ Cortar un trozo pequeño del órgano o branquia a examinar y con unas pinzas
presionar varias veces con este trozo sobre la superficie de un portaobjetos, hasta que
veamos que deja una huella.
c/ Teñir con las coloraciones habituales. Particularmente rápidas son las tinciones de
Giemsa, Diff-Quick y especialmente la tinción de GRAM
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También el examen del líquido ascítico, bilis o contenido intestinal pueden aportar
información. En líquido ascítico podremos observar la presencia de células inflamatorias,
macrófagos con bacterias, bacterias libres, hongos, etc. En la bilis y contenido intestinal
podremos observar la presencia de parásitos (sobre todo mixosporidios) y algunos
microorganismos (aunque considerando siempre la posibilidad de contaminación
retrógrada de la bilis procedente del tubo digestivo)
Ambos líquidos pueden recogerse mediante una punción con aguja. El líquido ascítico lo
trataremos como si fuera para realizar una extensión de sangre mientras que el líquido
biliar lo depositaremos en un portaobjetos, pondremos un cubreobjetos y lo
examinaremos directamente al microscopio.
Para el examen del contenido intestinal, cortaremos una sección del intestino y
realizaremos un raspado de la mucosa, depositando este material en un portaobjetos, lo
cubriremos y examinaremos.
Preparaciones de musculatura
Otra forma más sencilla consiste en cortar un trocito pequeño de músculo donde
sospechemos que están los parásitos y lo colocaremos entre dos portaobjetos o entre
un porta y un cubreobjetos. Examinaremos a condensador cerrado.
Sin embargo, el objetivo de este manual no es explicar todas y cada una de las
técnicas disponibles en cada especialidad, sino sencillamente indicar cuáles son,
para qué nos pueden servir y sobre todo cómo hemos de proceder para poder
obtener las muestras correctamente, en las mejores condiciones posibles y
remitirlas adecuadamente a los laboratorios de referencia que disponemos. Uno
de los problemas más habituales es que una muestra recogida de forma inadecuada
suele ser no apta para su estudio, lo que hace que aparte de que se pierde tiempo y
dinero, puede inducir a error en el diagnóstico, lo que es peor.
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ANÁLISIS DE AGUA
Los parámetros que es necesario controlar con mayor detalle son: Oxígeno y
Temperatura
Son los parámetros más necesarios de controlar con mayor detalle. En estos dos
casos hay que procurar obtener varias lecturas durante el día y más frecuentemente
aún si se sospecha que pueden haber oscilaciones. En estos casos lo ideal es tener
mediciones constantes y registradas acopladas a un sistema informático de análisis de
datos y conexión de alarmas.
Las oscilaciones de temperatura son también un fenómeno muy habitual que afecta
seriamente a los peces. En general podemos decir que los cambios de temperatura si
son suficientemente bruscos, afectan a la salud del pez reduciendo la respuesta de
sus sistemas de defensa y alterando su metabolismo durante varios días. Además hay
que añadir que la temperatura es uno de los factores más importantes en la
epizootiología de las enfermedades de los peces
En los casos concretos de la temperatura y el oxígeno, las muestras se toman “in situ”
mediante termómetros / termógrafos y sondas de oxígeno (oxímetros). En el caso
particular del oxígeno es de vital importancia el realizar un mantenimiento adecuado
de los mismos y calibrarlos periódicamente (aunque parezca una tontería, este es un
punto MUY importante y en la práctica se observan todavía errores demasiado
frecuentemente).
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En todos los casos es importante que la muestra de agua a recoger sea representativa
de lo que queremos analizar. Tengamos siempre presentes:
- El tiempo: Los sistemas acuáticos son dinámicos y lo que en un momento está en
el agua, al cabo de un tiempo corto puede haberse eliminado por el recambio del
agua o haberse degradado.
- Localización: La muestra ha de tomarse a distintos niveles (entrada de agua,
salida de agua, distintos tanques, distintas unidades de cultivo, etc)
- Profundidad. Sobre todo cuando se trate de analizar sistemas en grandes masas
de agua (por ejemplo jaulas o estanques ) es importante recordar el fenómeno de
la estratificación del agua y tenerlo en cuenta a la hora del muestreo del agua.
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TECNICAS BACTERIOLÓGICAS
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Sin embargo, también podemos procesar los peces y realizar siembras con un equipo
mínimo.
- Para iniciar la operación de toma de muestras, podemos desinfectar la piel del pez
mediante una solución de hipoclorito o amonio cuaternario, o simplemente retirar el
moco de la zona de incisión mediante un paño o papel absorbente.
- Cuidaremos de no puncionar por error los intestinos puesto que facilitaría mucho la
contaminación de la muestra, tal y como hemos indicado anteriormente. Una vez
hemos expuesto los órganos internos, procederemos a la toma de muestras.
Generalmente se toman muestras de riñón craneal (pronéfrico) y bazo por sus
características de órganos filtradores y hemopoyéticos en los que se reflejan la
mayoría de enfermedades bacterianas. Particularmente es preferible sembrar de
riñón craneal ya que es un órgano separado de la cavidad abdominal y es menos
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
- Para tomar muestras de riñón craneal pueden traccionarse el paquete visceral con
unas pinzas estériles, punzando si es preciso la vejiga natatoria y dejando al
descubierto el riñón. Con el asa de platino al rojo o un escalpelo estéril, incidiremos
en la zona media del riñón sobre la capa fibrosa que recubre a éste para permitir el
paso libre al parénquima renal. A continuación, con la punta del instrumento de
recogida (la misma asa, o otra de plástico o una pipeta estéril, entraremos en este
corte para recoger una muestra de riñón. Debe irse con cuidado de no tocar el resto
de órganos de la cavidad abdominal al entrar o salir de ella.
Inoculación de medios
Para la inoculación de placas con los medios utilizamos la misma técnica en estría que
para otros casos. En casos de múltiples muestras, podemos dividir las placas en
"porciones". También podemos hacer las siembras en tubos con medio líquido ("caldo")
para después pasarlo a medio sólido en placas. Los medios más frecuentemente
utilizados en peces marinos son los siguientes:
- Medios generales: Agar Marino (MA), Agar sangre (AS), Tripticasa Soja Agar (TSA)
- Medios específicos: TCBS (Vibrios), FMM (Flexibacter maritimus)
Estos medios se pueden realizar más o menos fácilmente o bien pueden ser adquiridos
ya preparados. En algunos casos, algunos laboratorios prefieren utilizar otros medios
menos habituales y que suelen dar buenos resultados.
Incubación
Identificación y antibiograma
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TECNICAS VIROLOGICAS
Las técnicas de detección virológica son tal vez el grupo de técnicas más complejas,
laboriosas y de elevado coste económico que requieren de un laboratorio y personal
sumamente especializado (bastante escasos) en este tipo de determinaciones. En este
apartado no abordaremos los protocolos utilizados en el diagnóstico virológico y solo
indicaremos algunos consejos para a la toma de muestras para virología.
ANÁLISIS PARASITOLOGICO
Para la detección de parásitos se emplean casi todas las técnicas diagnósticas que
comentamos en este manual. Normalmente, en nuestro examen directo de los peces y
con las pruebas rápidas ya realizamos un análisis parasitológico. Preliminar. Después,
también se pueden utilizar microscopía óptica y electrónica, técnicas inmunológicas e
incluso moleculares
MICOLOGIA
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HISTOPATOLOGIA
Esta técnica nos permite visualizar en secciones de tejido las lesiones ocasionadas en
los diferentes procesos patológico y a partir de la visualización de un tipo u otro de
lesión, determinar su naturaleza. Para ello es necesario una larga experiencia en
diagnóstico para poder discernir entre los distintos cuadros patológicos que pueden
aparecer.
Por ello es muy importante fijar rápidamente la muestra y que esta muestra tenga el
máximo contacto posible con la solución fijadora. Es MUY importante que las
muestras se remitan en recipientes con ABUNDANTE FIJADOR, ya que de lo contrario
la fijación es deficiente. Como mínimo hay que poner 3 partes de fijador por cada parte
de muestra, siendo lo ideal una relación de 9:1.
Para fijar las muestras, los fijadores más habituales son Formol al 10% tamponado (el
que recomendamos) y Formol salino. La formulación para preparar estos fijadores es:
Las muestras fijadas también permiten realizar sobre ellas las mismas técnicas que las
que describimos en las preparaciones en fresco. También hemos de tener en cuenta
que algunos parásitos (sobre todo los monogenea, los copépodos y los isópodos)
pueden desprenderse de los tejidos o de la superficie de piel y branquias cuando se
sumergen las muestras en el fijador, por lo que es interesante pipetear los fondos de los
recipientes y observar el contenido de este arrastre al microscopio. Recordemos que
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En ocasiones es necesario realizar estudios más precisos para conocer con más detalle
el carácter de las lesiones o de los agentes patógenos que se encuentran en estas
lesiones. Por ello puede ser necesario utilizar el microscopio electrónico (de transmisión
y/o barrido). No nos extenderemos comentando el procesado de las muestras para
estas técnicas ya que son las mismas que se utilizan para otro tipo de muestras, sino
que sólo indicaremos como se debe proceder para obtener muestras para esta técnica.
Las muestras para microscopio electrónico deben tomarse muy rápidamente y a partir
solo de material muy fresco. Es importante indicar las muestras de tejidos deben ser
porciones muy pequeñas (si es posible porciones de menos de 1 milímetro cúbico) y
fijarlas muy rápidamente en el fijador para microscopio electrónico. Existen distintos
tipos de fijadores para este tipo de estudios, aunque nosotros siempre utilizamos el
glutaraldehido como fijador de elección, siguiendo este protocolo:
HEMATOLOGIA
El estudio de la sangre puede ser también bastante útil para el diagnóstico. A partir de
una muestra de sangre pueden realizarse determinaciones como hematocrito,
extensiones sanguíneas, hemograma, bioquímica sanguínea y serología. La mayoría de
estas pruebas necesitan del conocimiento de los valores habituales (y su rango de
variación) para poder ser comparadas. Debido al menor número de datos que se
poseen sobre especies de peces en comparación con la especie humana y otros
vertebrados, su utilización es a veces de poca significación diagnóstica.
Toma de muestras
Para tomar muestras de sangre utilizamos el mismo tipo de agujas y jeringas que se
utilizan en medicina veterinaria, adaptándolas al tamaño del pez y cantidad de sangre a
recoger. Nuestra experiencia indica que es útil (si se puede) utilizar una aguja y jeringa
heparinizadas para evitar la rápida coagulación de la sangre.
En general y de forma habitual se toma muestras de sangre a partir de:
- vena caudal
- corazón (ventrículo o seno venoso)
- arteria aorta dorsal (menos frecuente)
- Sección de pedúnculo caudal
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
Incidir en la zona ventral de la cola, justo después de la aleta anal y en dirección dorsal
avanzar hasta contactar con la columna vertebral, rotar ligeramente la aguja y recoger la
sangre. También puede incidirse en unos 60 grados desde una zona próxima a la línea
lateral.
Incidir en la zona ventral de la región de transición entre cabeza y cola, entre las aletas
pectorales y la zona de los opérculos. Rápidamente se llega al ventrículo de donde se
puede recoger sangre de forma fácil. Si se incide ligeramente por delante de la aleta
pectoral se consigue tomar sangre del seno venoso.
Abrir la boca del pez e incidir en la zona más caudal de la inserción dorsal de los arcos
branquiales.
Para los peces que por su tamaño no es posible sacar sangre de las otras formas
descritas y pueden sacrificarse, puede seccionarse el pedúnculo caudal (después de
anestesiar al pez), secar la superficie de corte y recoger la sangre que sale de la aorta
dorsal y vena caudal seccionadas.
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
Tras retirar la aguja, la sangre puede ser recogida en tubos sin anticoagulante y dejarlas
coagular en un lugar fresco para separar el suero o bien recoger en tubos con
anticoagulante (en general, EDTA o heparina, según el tipo de análisis a realizar) y
mantener a 4 grados.
Extensiones sanguíneas
Hematocrito
Se debe llenar el 70-80% de un tubo capilar heparinizado o con EDTA y después sellar
ambos bordes con plastilina o similar. Centrifugar durante 4-5 minutos a unos 12.000 g y
calcular el porcentaje de la columna roja con el del total de sangre. El valor calculado es
el PCV (Packed Cell Volume) o hematocrito.
TECNICAS INMUNOLÓGICAS
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Técnicas de aglutinación
Técnicas de ELISA
Técnicas de inmunofluorescencia
Directa e indirecta (FAT e IFAT) sobre improntas de órganos y/o tejidos celulares o bien
en suero. Utilizada para el diagnóstico de BKD y la mayoría de las virosis.
Técnicas de inmunohistoquímica
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TÉCNICAS MOLECULARES
Estas técnicas son bastante recientes y derivan en su mayoría de las técnicas de PCR
(Polymerase Chain Reaction). Se basan en el la detección de la presencia del DNA del
agente patógeno mediante su multiplicación del DNA o RNA en varios ciclos mediante
una polimerasa y en la posterior identificación mediante la utilización de sondas
específicas. Son técnicas complicadas pero que se están poniendo a punto para los
diferentes patógenos. Una de las mejores ventajas de esta técnica es su alta
sensibilidad pero su utilización para diagnósticos de rutina es aún limitada, pero puede
tener una importancia cada vez mayor en el futuro.
TEST DE STRESS
RADIOLOGIA
Todas estas técnicas están también teóricamente disponibles para poderlas utilizar en
el diagnóstico en peces. Sin embargo, en las técnicas aparentemente más específicas
como las técnicas inmunológicas o las técnicas moleculares nos encontramos muy
frecuentemente con el problema que muchas de estas técnicas están únicamente
disponibles como herramientas de investigación y aplicadas sólo a estudios
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
Una vez hemos realizado todo los análisis correspondientes de forma ordenada y
completa y con todos los resultados de las pruebas complementarias, ya podemos
emitir nuestro diagnóstico. A la hora de interpretar los resultados de una analítica,
hemos de recordar que nunca una sola prueba es definitiva, y siempre, como últimos
responsables de la salud de los animales, podemos dudar de estos resultados.
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Manual de Técnicas Básicas de Diagnóstico Patológico en Peces - 2005
Disponemos de lo más básico y sólo podemos intuir la causa del problema por
nuestros conocimientos teóricos y las lesiones observadas externa e
internamente. Puede parecer “justito”, pero muchas veces suele ser suficiente.
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4.2.- “TELEDIAGNÓSTICO”
Móvil
Consulta telefónica normal de una duda.
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CLIENTE CODIGO
DIRECCION
TELEFONO / FAX
DIRECCION ELECTRONICA
CENTRO DE ORIGEN DE LOS PECES CODIGO DE CENTRO
ESPECIES
TIPO DE AGUA
TEMPERATURAS DEL AGUA REGISTRADAS
APETITO
EVOLUCION
OBSERVACION CLÍNICA:
NATACIÓN:
RESPIRACION:
ASPECTO BRANQUIAL:
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NECROPSIA:
MUESTRAS TOMADAS:
(Preparaciones en fresco, improntas, sangre, microbiología, virología,
histopatología, toxicología…)
DIAGNOSTICO PRELIMINAR
DIAGNOSTICO DEFINITIVO
TRATAMIENTO RECOMENDADO
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Lesiones en piel:
Lesiones en branquias:
Lesiones en aletas:
Lesiones en ojos:
Lesiones en la boca:
Lesiones en el ano:
Lesiones internas:
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