Protocolo de Diagn Stico para La Detecci N de Globodera Rostochiensis Mediante PCR Cuantitativa QPCR

DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL
Dirección del Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria

Área de Desarrollo, Validación de Protocolos y Diagnóstico
Protocolo de Diagnóstico
para la
Detección de Globodera rostochiensis

mediante PCR cuantitativa (qPCR)
Elaborado por
M.C. Liliana Elizabeth Ronces Frutos
Revisado por
M.C. José Manuel Cambrón Crisantos
M.C. José Gustavo Torres Martínez
Autorizado por
M.C. José Abel López Buenfil
Datos de Control
Fecha de
Revisión Laboratorio Nº de páginas
Elaboración
Desarrollo,
00 Validación de
Octubre de 2016 30
Protocolos y
Diagnóstico
TABLA DE CONTENIDO
ÍNDICE DE FIGURAS
ÍNDICE DE TABLAS
I. ANTECEDENTES
 Información taxonómica
 Hospedantes
 Ciclo de Vida
 Dispersión
 Síntomas
II. IMPORTANCIA
III. TÉCNICAS DE DETECCIÓN
IV. PROCEDIMIENTO PARA EL DIAGNÓSTICO
1. Toma y envio de muestra
2. Recepción y almacenamiento del material
3. Extracción de ADN
a) Extracción de ADN a partir de quistes
b) Extracción de ADN a partir de juveniles J2
4. Amplificación de Ácidos Nucleicos
5. Resultados
6. Confirmación de resultados
V. DESTRUCCIÓN DE LA MUESTRA
VI. RECOMENDACIONES DE TRABAJO
VII. REFERENCIAS
VIII. ANEXOS
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Prevalencia y distribución mundial del nemátodo dorado de la papa (G.
rostochiensis).
Figura 2. Ciclo de Vida de G. rostochiensis.
Figura 3. Hembras de G. rostochiensis en raíces infectadas de papa.
Figura 4. Cultivo de papa mostrando síntomas de la infección por G. rostochiensis.
Figura 5. Resultados de la amplificación de una muestra positiva a G. rostochiensis
mediante qPCR.
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Secuencia de la sonda y oligonucleótidos usados para la amplificación de
G. rostochiensis
Tabla 2. Concentraciones para la mezcla de reacción para qPCR
Tabla 3. Condiciones de termociclaje para qPCR.
Tabla 4. Condiciones de termociclaje para la PCR punto final.

I. ANTECEDENTES
El Nemátodo Dorado de la papa, nombre común con el que se conoce a Globodera

rostochiensis, forma parte, junto con Globodera pallida, del complejo de nemátodos
formadores de quistes en papa (PCN por las siglas en inglés de Potato Cyst
Nematodes). Es un endoparásito sedentario que ocasiona problemas a nivel mundial
en solanáceas, sobre todo el cultivo de papa Solanum tuberosum L. (Núñez et al.
2003)
Se considera originario de Sudamérica, específicamente de la Cordillera de los Andes,

que incluyen Perú, Chile y Bolivia, al sur del lago Titicaca (Mugniéry, 1999). Se cree que
el nemátodo fue llevado a Europa en el siglo XVI, pero fue hasta el siglo XVIII cuando
se diseminó debido al incremento en el uso de variedades mejoradas de papa
(OIRSA, 2015). Según lo reportado por la EPPO en 2016, G. rostochiensis tiene una
amplia distribución geográfica en todos los continentes (figura 1).
En México, este organismo fue detectado por primera vez en 1971 en un lote de
producción de papa en el estado de Nuevo león (Leo, 1972) y después apareció en
los municipios de Saltillo y Arteaga, Coahuila, impidiendo la comercialización de la
papa como semilla, ocasionando pérdidas económicas considerables en los
productores. Hasta 2009, el nemátodo se encontraba distribuido oficialmente en
nueve Estados de la República (Guanajuato, Nuevo León, Hidalgo, Tlaxcala, Puebla,
Veracruz, Estado de México y Ciudad de México) (SENASICA, 2013).
De acuerdo a la normatividad fitosanitaria mexicana, G. rostoshiensis es considerada

plaga P2/P9 presente solamente en algunas áreas y sujeta a control oficial (NOM-025-
FITO-2000).
Figura 1. Prevalencia y distribución mundial del nemátodo dorado de la papa (G. rostochiensis).
EPPO, 2016
Información Taxonómica
Los nemátodos del quiste de la papa pertenecen a la clase Nematoda. El sistema de

clasificación tradicional del nemátodo dorado está basado en la anatomía y
morfología de los especímenes. Adicionalmente, existe una nueva clasificación
basada en su filogenia que considera las propiedades del gen 16S del ARN ribosomal.
 Anatomía y morfología (Siddiqui,  16S del ARNr (De Ley et al., 2006)
2000)
Reino: Animalia Reino: Animalia
Phyllum: Nematoda Phyllum: Nematoda
Clase: Secernentea Clase: Chromadorea
Orden: Tylenchida Orden: Rhabditida
Familia: Heteroderidae Familia: Meloidogynidae
Género: Globodera Género: Globodera
Especie: G. rostochiensis Especie: G. rostochiensis
Hospedantes
Los hospederos de este nemátodo son especies de cultivos y malezas de la familia

Solanaceae, como papas, tomate, pimentón, berenjena, tabaco, entre otras.
Algunos híbridos de Solanum spp y especies silvestres del género Solanum son
hospedantes, como: S. aviculare, S. gilo, S. indicum, S. marginatum, S. nigrum, S.
quitoense, S. dulcamara, S. rostratum, S. triflorum, S. elaeagnifolium, S. xantii, S.
integrifolium y S. Sarachoides, así como cuatro especies del subgenero Lycopersicon
(OIRSA, 2015, EPPO, 2016).
Ciclo de vida
El ciclo de vida de los nemátodos formadores de quistes comienza en primavera,

cuando la eclosión de los huevos se induce por estímulo de los exudados radiculares
del hospedante (INIA, 2016) (figura 2).
La fase infectiva es el segundo estadio juvenil (J2), el cual, al salir del huevo, es atraido
por los exudados radiculares y llega al hospedante . Los juveniles utilizan su estilete
para penetrar mecánicamente a las raíces y migrar a la vasculatura, donde se
convierten en endoparásitos sedentarios obligados (Davis et al., 2004).
Al pasar al tercer y cuarto estadio, los nemátodos se alimentan del periciclo, la

corteza y la epidermis de la raíz (Nicol et al., 2011, OIRSA, 2015). La disponibilidad de
alimento define el sexo de la población. Si el alimento es abundante y existen pocos
nemátodos, la población está constituida principalmente por hembras. Por el
contraio, cuando hay escases de alimento y un alto número de nemátodos,
predominan los machos (Franco, 1986).
Figura 2. Ciclo de vida de G. rostochiensis. A) En primavera, cuando las condiciones ambientales son
óptimas, los huevos eclosan y se liberan los juveniles; B) Los juveniles penetran la raíz del hospedero y
se movilizan al interior de estas para comenzar a alimentarse; C) Después del apreamiento, las hembras
se adhieren al tejido para alimentarse y formar los huevos; D) Al final de la temporada, los quistes que
contienen los huevos son liberados al suelo, donde pueden permanecer viables por muchos años.
Modificado de INIA, 2016
Durante el cuarto estadio, las hembras maduras son esféricas, mientras que los
machos son vermiformes. Las hembras incrementan su tamaño, rompen la superficie
de la raíz y exponen sus cuerpos esféricos dejando la cabeza dentro de la raíz. Los
machos son atraídos por las hembras y ocurre la reproducción sexual y la fase de
producción de huevos (Brodie et al., 1993).
Al alcanzar la madurez, la cutícula de las hembras se endurece y forma una capa

dura externa o quiste que le sirve para proteger los huevos. Cuando la hembra muere,
la cutícula de su cuerpo esférico cambia químicamente y el color que era blanco o
amarillo se torna marrón. La hembra muerta se convierte en un quiste duro, resistente
a las condiciones ambientales, que puede permanecer latente en el suelo hasta por
30 años conteniendo huevos viables (CABI, 2016, INIA, 2016, Mimee et al. 2015).
Dispersión
El nemátodo dorado de la papa es incapaz de desplazarse por sí solo a grandes

distancias debido a que no posee los medios naturales para hacerlo, por lo que se
considera que su dispersión es pasiva. El pequeño tamaño de los quistes facilita la
diseminación del nemátodo, ya que estos son llevados fácilmente de un lado a otro
en la tierra adherida a los tubérculos, maquinaria, herramientas o cualquier material
que implique traslado de suelo (INIA, 2016, CABI, 2016)
El movimiento de semilla-tubérculo, plántulas y suelo que estén contaminados con

este nemátodo y el movimiento de implementos agrícolas, contenedores y agua de
riego en campos infectados con G. rostochiensis, pueden influir en la diseminación de
los quistes de áreas infectadas hacia áreas libres (SENASICA, 2013).
Síntomas
Los nemátodos del quiste de la papa no causan síntomas aéreos inmediatamente,

por lo que pueden permanecer por años en el suelo sin que se detecte su presencia
(Mimee et al. 2015)
La principal característica del ataque de estos nemátodos es la presencia de

pequeños cuerpos blancos, que corresponden a las hembras en proceso de
madurez, y de pequeños quistes en forma de globos (445 + m de largo por 382 + 61
m de ancho, en promedio) adheridos a las raíces y a la superficie de los tubérculos
(Brodie et al., 1993). El color de los quistes varía dependiendo de la madurez de la
hembra: al principio parecen perlitas blancas y poco a poco se tornan dorados,
anaranjados y finalmente cafés (figura 3) (INIA, 2016).
Figura 3. Quistes de G. rostochiensis en raíces de papa infectada.

Créditos: Central Science laboratory, York, GB.
Cuando las poblaciones de nemátodos son bajas no se observan síntomas específicos

que se puedan asociar directamente a la enfermedad, por el contrario, pueden ser
confundidos con síntomas de deficiencia de agua o algún nutriente (SENASICA, 2013,
OIRSA, 2015).
A medida que la población de nemátodos aumenta, los síntomas se hacen más

evidentes. En general, se produce una disminución en el desarrollo e inhibición en el
crecimiento de las plantas (Bello et al., 2005). El nemátodo extrae los nutrientes de las
raíces y reduce el suministro de nutrientes y agua a los tallos y hojas de las plantas.
También se observa clorosis en el follaje, marchitez y, en casos de poblaciones muy
altas del nemátodo, muerte del cultivo (figura 4) (Bello et al., 2005, INIA, 2016). Ello se
traduce en una disminución en el rendimiento y, en consecuencia, pérdidas
económicas.
Los síntomas en campo son no-específicos. Se observa la presencia de manchones

en el cultivo que se extienden con el tiempo hasta generalizarse al total de la parcela.
Estos manchones pueden ser confundidos con un exceso de herbicidas, fitotoxicidad,
etcétera (Mackesy et al. 2014).
Figura 4. Cultivo de papa mostrando síntomas de la infección por G. rostochiensis.

Se aprecia la marchitez y clorosis del follaje, mismos que dan pie a los manchones
que se extienden a lo largo de los cultivos. Créditos: UNECE, 2016
II. IMPORTANCIA
G. rostochiensis es uno de los principales problemas fitosanitarios de la papa a nivel

mundial, considerándose una amenaza en la producción de este cultivo. Se
considera una fuente limitante para la producción agrícola, ocasionando pérdidas
económicas importantes en las regiones donde se encuentra presente (Marks y
Brodie, 1998, Mackesy et al. 2014).
El incremento continuo de la población de G. rostochiensis en los suelos infectados se

debe a su alto índice de reproducción, a la capacidad de permanecer viable en el
suelo hasta por tres décadas en ausencia del hospedante y a la facilidad de ser
dispersado a través del suelo adherido a implementos agrícolas y material
propagativo (Nicol et al. 2011).
El daño causado por este nemátodo se relaciona con el número de huevos por
unidad de suelo y se refleja en el tamaño del tubérculo producido. Su impacto se
manifiesta en la disminución del rendimiento de cultivo, los altos costos en el control,
manejo y erradicación del patógeno, disminución en la rentabilidad de los campos
afectados, restricción o cierre de mercados y restricciones cuarentenarias impuestas
al país con presencia del nemátodo (SENASICA, 2013, CABI, 2016).
III. TÉCNICAS DE DETECCIÓN
Durante años, los métodos tradicionales de taxonomía clásica han sido empleados
para determinar la identidad de los nemátodos formadores de quistes. Los buenos
resultados obtenidos con estas metodologías dependen, en gran medida, de contar
con personal con amplias habilidades en nematología así como de la inversión de
mayor cantidad de horas-hombre.
Sin embargo, la gran similitud morfológica existente entre G. rostochiensis y G. pallida

ha impulsado el desarrollo de técnicas bioquímicas que permitan diferenciar estas
dos especies (Schots et al., 1990, Karssen et al., 1995). Por otra parte, la
implementación de metodologías complementarias más versátiles y rápidas, como el
análisis de material génico mediante técnicas moleculares, ha solucionado los
problemas de ambigüedad en la identificación, además de agilizar el diagnóstico y
favorecer el incremento de la robustez y confiabilidad de los resultados (Carta y
Handoo, 2005).
Por lo general, la discriminación molecular de G. rostochiensis y G. pallida se realiza

mediante la amplificación de las regiones del espacio inter transcrito (ITS, por sus siglas
en inglés) y la posterior digestión enzimática de los productos de amplificación
(Skantar et al., 2011). Actualmente, el SENASICA cuenta con un protocolo de
diagnóstico para nemátodos en papa que combina los métodos taxonómicos con el
uso de marcadores moleculares y el análisis de polimorfismos de longitud de
fragmentos de restricción (RFLP´s) (SENASICA, 2014).
Dentro de las técnicas moleculares, la Reacción en Cadena de la Polimerasa

cuantitativa (qPCR) ha ido ganando aceptación en la identificación de patógenos
debido a que, en comparación con la PCR convencional, es un método de
detección rápido, róbusto y más sensible que permite monitorear el producto de
amplificación conforme transcurre la reacción, sin que sea necesario el empleo de
geles de agarosa para saber si la reacción fue exitosa, además de que reduce el
riesgo de contaminación (Tamay de Dios, 2013).
Por esta razón, en el presente protocolo se propone el diagnóstico de Globodera

rostochiensis mediante qPCR con ayuda de oligos específicos que permiten su
diferenciación de G. pallida así como de otras especies del género Globodera
similares morfológicamente. De este modo, se generará un diagnóstico acertado y
eficiente en un menor tiempo, lo que se verá reflejado en la oportuna toma de
decisiones relacionadas a la regulación de este patógeno en México.
IV. PROCEDIMIENTO PARA EL DIAGNÓSTICO
1. Toma y envío de muestra
Todas las muestras para la detección del nematodo dorado de la papa deberán ser
enviadas al Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria (CNRF) debidamente
etiquetadas y acompañadas por el formato de solicitud de diagnóstico (Ver Anexo
1).
La toma y envío de las muestras se deberá realizar con apego al procedimiento

especificado en el apéndice final de la NOM-040-FITO-2002 que establece los
requisitos y especificaciones para la producción y movilización nacional de papa
comercial (Anexo 2).
2. Recepción y almacenamiento del material
El almacenamiento y tratamiento dado a las muestras depende de la naturaleza del

sustrato (suelo, raíces, tubérculos) que se pretende analizar.
El diagnóstico molecular requiere que se cuente con los especímenes aislados,

preferentemente hembras, ya que estas han mostrado ser más adecuadas para la
identificación morfológica.
Los métodos de aislamiento a partir de un sustrato dado se pueden consultar en el

Protocolo de Diagnóstico para Nemátodos de Importancia Cuarentenaria en papa
para México (SENASICA, 2014).
3. Extracción de ADN
El protocolo de Diagnóstico para Nemátodos del SENASICA propone dos técnicas de

extracción de material génico para estos patógenos, uno para quistes y otro para
especímenes individuales (Juveniles J2). En ambos casos es necesaria la observación
previa al microscopio, ya sea para confirmar que los quistes contengan masas de
huevecillos o para realizar el análisis morfométrico y así asegurar una extracción
exitosa.
El procedimiento para llevar a cabo la extracción de ADN se encuentra detallado en

el anexo 3. Para más información, consultar el Protocolo de Diagnóstico para
Nemátodos de Importancia Cuarentenaria en papa para México (SENASICA, 2014).
4. Amplificación de ácidos nucleicos
El diagnóstico molecular de G. rostochiensis se emplea, generalmente, como un

método complementario al diagnóstico taxonómico. Sin embargo, también puede
ser utilizado como único método de diagnóstico cuando las condiciones de las
muestras así lo requieran, siempre y cuando se cuente con material génico de buena
calidad a concentraciones adecuadas.
En este protocolo se propone la identificación del nemátodo dorado de la papa

mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa cuantitativa (qPCR), la cual
requiere el uso de oligonucleótidos específicos que generen amplicones de un
tamaño que oscile entre 100-150 pb y un sistema reportero de fluorescencia para

detectar los productos amplificados (sonda). Los oligonucleótidos y sonda específicos
para el nemátodo dorado de la papa fueron diseñados por Nakhla y colaboradores
(2010) a partir de la región ITS1 y se describen en la tabla 1.
Tabla 1. Secuencia de la sonda y oligonucleótidos usados para la amplificación de

G. rostochiensis por qPCR.
Tamaño del
Nombre Secuencia (5´- 3´)
amplicón
PGrtf TCTGTGCGTCGTTGAGC
105
Postor CGCAGACATGCCGCAA
Nombre Secuencia (5´- 3´) Absorción-Emisión
GTETp TET/CGCAGATATGCTAACATGGAGTGTAG/BHQ-2  521-536 nm
Los ingredientes químicos en la reacción de qPCR son los mismos que los utilizados en
la PCR punto final. En la tabla 2 se muestran las concentraciones requeridas de cada
uno de los componentes que conforman la mezcla de reacción.
Tabla 2. Componentes y concentraciones para la mezcla de reacción para qPCR

Concentración Concentración
Reactivo Volumen (L)
inicial final
Agua grado PCR ---- 7.3 ----
Amortiguador de
10X 2.5 1X
amplificación
MgCl2 50 mM 2.5 5 mM
dNTP´s 10 mM 0.5 200 M
PGrtf 2 M 2 160 nM
Oligos
Prostor 2 M 2 160 nM
Sonda GTETp 2 M 5 400 nM
Taq polimerasa 5U/L 0.2 0.04 U/L
ADN 10-100 ng/L 3 1.2-12 ng/L
Volumen final ---- 25 ----
NOTA: El método ha demostrado ser confiable en un rango de 5 pg/L a 100 ng/L

de ADN molde (concentración final), siendo las concentraciones recomendadas de
1 a 15 ng/L.
Para la preparación de la mezcla de reacción deberá considerarse el total de

muestras a analizar más un control positivo y un control negativo o NTC. Preparar la
mezcla añadiendo todos los reactivos excepto el ADN. Homogeneizar y colocar 23
L de la mezcla en placas o tiras de tubos para qPCR. Cargar 2 L de muestra,
recordando cambiar de punta entre muestras.
Las condiciones de termociclaje para el diagnóstico de G. rostochiensis se describen

en la tabla 3.
Tabla 3. Condiciones de termociclaje para qPCR.

Temperatura Tiempo Ciclos
95ºC 2 minutos 1
95ºC 1 segundo
40
*58ºC 40 segundos
*Tiempo en el que se realiza la lectura de la fluorescencia
Para poder llevar a cabo la identificación de G. rostochiensis se requiere la tecnología

incluida en los termocicladores de PCR en tiempo real para: a) excitar el reportero, b)
capturar la señal de emisión del mismo y c) realizar el análisis cuantitativo.
El monitoreo de los productos amplificados se produce conforme transcurre la

reacción. En este caso, el software acoplado al equipo de tiempo real genera una
serie de gráficas en donde se muestran todos los datos necesarios para determinar si
la reacción fue exitosa. Dichas gráficas permiten conocer la relación existente entre
el ciclo de amplificación y la fluorescencia detectada por el equipo, generando un

valor numérico de cuantificación (Ct o Cq).
Figura 5. Resultados de la amplificación de muestras positivas a G. rostochiensis mediante qPCR. La

curva de amplificación de las muestras positivas pasa por una fase basal hasta que la señal
fluorescente puede distinguirse del ruido de fondo (Ct) e inicia la fase exponencial. La amplificación
continúa durante varios ciclos hasta alcanzar un nivel constante e independiente del número de ciclos.
Tal como se observa en la figura 5, durante los ciclos iniciales de la PCR no hay
cambios significativos en la intensidad de la fluorescencia emitida. Conforme avanza
la reacción, aumenta la cantidad de ADN amplificado y la señal fluorescente. El
punto donde se observa un incremento en la fluorescencia, distinguiendo entre el
ADN amplificado y el ruido basal, se conoce como fase inicial o Ct y marca el
comienzo de la fase exponencial o logarítmica. Posteriormente, inicia una fase lineal
en la que la eficiencia de la amplificación no es constante. Por último, se alcanza la
fase estacionaria donde el producto de amplificación permanecerá constante
aunque se aumente el número de ciclos.
5. Interpretación de Resultados
Para determinar un resultado de diagnóstico se debe considerar lo observado en los

controles y la forma de la curva.
En este caso, el control negativo no debe presentar un valor de cuantificación

(Ct=N/A) y el control positivo deberá presentar un valor de Ct menor a 37. Además, la
curva del control positivo deberá contar con las tres fases mostradas en la figura 5
(basal, exponencial y estacionaria). Si alguno de los controles no presenta los valores
requeridos, la prueba no puede ser considerada válida y todas las muestras deberán
analizarse nuevamente. En caso de que las curvas generadas no presenten la forma
deseada, las muestras deberán analizarse nuevamente para descartar una posible
degradación de la sonda.
Las muestras que presenten valores de Ct menores a 37 serán consideradas positivas,

mientras que aquellas cuyo valor Ct sea mayor a 37 serán consideradas negativas.
6. Confirmación de Resultados
En caso de que el diagnóstico molecular de G. rostochiensis se hay realizado como

método complementario al análisis taxonómico, los resultados de este estudio
deberán tener concordancia con lo observado durante el diagnóstico morfológico
(a excepción de los casos en los que las condiciones de la muestra no permitan la
caracterización morfológica).
Adicionalmente, el resultado positivo puede confirmarse mediante secuenciación de

los productos de amplificación y la posterior comparación mediante alineamiento de
secuencias. Para ello, es necesario realizar un reacción de PCR punto final
empleando los mismos componentes de la mezcla de reacción mostrados en la tabla

2 exceptuando la sonda, cuyo volumen se sustituye por agua. Las condiciones de
termociclaje para esta nueva reacción son las siguientes:
Tabla 4. Condiciones de termociclaje para la PCR punto final.

Temperatura Tiempo Ciclos
95ºC 3 minutos 1
95ºC 30 segundos
58ºC 1 minuto 40
72ºC 1 minuto
72ºC 5 minutos 1
4ºC  ----
V. DESTRUCCIÓN DE LA MUESTRA
Al finalizar el diagnóstico, las muestras deberán ser resguardadas a 4ºC durante un

mes en caso de que sea necesaria alguna corroboración o algún otro diagnóstico.
Pasado este tiempo, desactivar las muestras en autoclave a 121ºC durante 20-25
minutos a 15-20 libras/pulgadas2 (psi) y, finalmente, desechar o incinerar.
VI. RECOMENDACIONES DE TRABAJO
a) Limpiar y descontaminar perfectamente su área de trabajo.
b) Trabajar con guantes de nitrilo.
c) Siempre trabajar con consumibles (tubos, puntas etc.) estériles.
d) Cada muestra y submuestra debe de ir en un tubo independiente rotulado con

su respectivo número de identificación.
e) Las mezclas de reacción deben realizarse en la campana de flujo laminar o

bien en un gabinete para PCR.
f) Ocupar una punta nueva cada que pipetee una muestra, lo mismo para el
caso de los controles   positivos y negativos.
g) Utilizar las concentraciones de ADN recomendadas. Si se requiere, deben

hacerse diluciones.
h) Descongelar los reactivos a temperatura ambiente sobre hielo, no forzar su

descongelamiento con la mano o aplicando calor.
i) La enzima Taq polimerasa debe almacenarse siempre a -20°C.
j) De ser posible, utilizar puntas con filtro para la mezcla de reacción.
k) Verificar que el fluoróforo para el ensayo sea el apropiado de acuerdo con el

equipo que se usará.
l) La alícuota del fluoróforo debe estar en tubos color ámbar ya que es

fotosensible.
m) Utilizar consumibles ópticos o fotosensibles que permitan la detección de la

fluorescencia emitida durante el proceso.
VII. REFERENCIAS
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12 de octubre de 2016.
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Protocolos de Diagnóstico. Dirección General de Sanidad Vegetal. Centro Nacional
de Referencia Fitosanitaria. México. pp 81
Siddiqui, M. R., 2000. Tylenchida: parasites of plants and insects. CABI Bioscience. St
Albans, UK. 2ª edición. pp 835
Tamay de Dios l. Ibarra C., Velasquillo C., 2013. Fundamentos de la reacción en

cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigación en
Discapacidad, 2 (2); 70-78
VIII. ANEXOS
1. Solicitud de Diagnóstico Fitosanitario
I. DATOS DE LA MUESTRA
Fecha de registro: No. de registro:
Producto/Hospedero y/o insecto: Parte vegetal enviada: Variedad:
Órgano de donde se colecto: Uso del producto: Fase fenológica del cultivo:
Fecha de muestreo: Fecha de envió Cantidad:
Frascos Cepas Tubos Sobres Macerado RNA/ADN Suelo Otro
Nombre del colector:
II. PROCEDENCIA
Campo Huerto Coordenadas GPS y anexar croquis Nombre del predio/Invernadero/Huerto:
Bodega Trampa
Invernadero
Otro (Especifique) No. Lote/Registro:
Localidad o población Municipio y Estado:
III. DATOS DEL INTERESADO

Nombre completo: RFC:
Domicilio completo: Teléfono con lada:
Localidad/Colonia: Correo electrónico:
Biología
Micología Bacteriología Virología Nematología Entomología Molecular Malezas
Motivo del Diagnóstico

Campaña Vigilancia Sospecha de Corroboración Programa Programa Otros
Fitosanitaria Epidemiológica nueva plaga Exportación Emergente
*Todos son datos obligatorios cuando se disponga de ellos.
Recibe Envía
2. Procedimiento para el diagnóstico fitosanitario del lote de producción de papa

comercial. NOM-040-FITO-2002
Un organismo de certificación, unidad de verificación o, en su ausencia, personal

oficial capacitado en esta materia y designado por la Secretaría, quien examinará

y/o tomará muestras antes de la plantación/siembra, durante el desarrollo del cultivo,
durante o después de la cosecha, para constatar la fitosanidad del cultivo.
I. Antes de la siembra
  Selección de sitios de muestreo. 
a) Zonas libres sin reconocimiento oficial.

En cada lote de producción de papa comercial, el organismo de certificación,
unidad de verificación o el personal oficial seleccionará 5 sitios de muestreo al
azar, en cada uno de estos puntos colectará 100 submuestras de suelo de
aproximadamente 30 g cada una a una profundidad de 0 a 5 cm. Las
submuestras se colectarán cada 10 m cubriendo un área aproximada de una
hectárea, se homogeneizarán en el campo y se colocarán aproximadamente
2 kg en una bolsa plástica, la cual se identificará con los datos del lote. Esta
muestra la enviará el organismo de certificación, unidad de verificación o
personal oficial al laboratorio de pruebas que elija el interesado para análisis de
Globodera rostochiensis. Los gastos del envío y diagnóstico serán cubiertos por
el interesado.
b) Zonas bajo control fitosanitario

En cada lote de producción de papa comercial, el organismo de certificación,
unidad de verificación o el personal oficial colectará por cada hectárea del
predio, 100 submuestras de suelo de aproximadamente 30 g cada una, a una
profundidad de 0 a 5 cm. Las submuestras se tomarán cada 10 m, se
homogeneizarán en el campo y se colocarán aproximadamente 2 kg en una
bolsa plástica, la cual se identificará con los datos del lote. Esta muestra la
enviará el organismo de certificación, unidad de verificación o personal oficial

al laboratorio de pruebas que elija el interesado para el análisis de Globodera
rostochiensis. Los gastos del envío y diagnóstico serán cubiertos por el
interesado.
II. Cosecha
En la cosecha, el organismo de certificación, unidad de verificación o personal oficial
examinará visualmente de manera aleatoria una muestra de 100 tubérculos por cada
10 hectáreas o menos, para detectar Meloidogyne chitwoodi y Globodera
rostochiensis.
Cualquier síntoma que no pueda diagnosticarse con seguridad deberá confirmarse

enviando el material a un laboratorio de pruebas para su diagnóstico. Los gastos de
envío y diagnóstico deben ser cubiertos por el interesado.
El laboratorio de pruebas entregará el original del dictamen al interesado y enviará

copia a la Delegación de la Secretaría que envió la muestra y a la Dirección General
de Sanidad Vegetal.
3. Protocolo para la extracción de material génico de nematodos formadores de

quistes
a) Extracción de ADN a partir de quistes
1. Limpiar los residuos de suelo adheridos a los quistes con ayuda de un flotador
de Fenwick. Colocar los quistes limpios en tubos de microcentrífuga estériles de 1.5
mL. La extracción se puede realizar a partir de un solo quiste.
Adicionar 150 μL de solución amortiguadora de extracción A (200 mM Tris-
HCl, pH 8.0, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5 % SDS).
2. Macerar con un pistilo estéril o con la ayuda de un taladro manual.
3. Congelar a -40°C por 10 min.
4. Volver a macerar con otro pistilo estéril antes de que se descongele la solución.
5. Agregar 0.5 volúmenes de Acetato de Sodio 3M pH 5.8.
6. Mezclar por inversión. Incubar a -20°C por 10 min.
7. Descongelar y agitar por vórtex. Centrifugar a 13,200 rpm por 5 min.
8. Transferir el sobrenadante a otro tubo de microcentrífuga estéril de 1.5 mL.
9. Adicionar 1 volumen de Isopropanol frío (± 4°C) y mezclar por inversión.
10. Incubar a -20°C por 20 min.
11. Centrifugar a 13,200 rpm por 15 minutos para precipitar el ADN.
12. Eliminar el sobrenadante teniendo cuidado de no perder la pastilla de ADN.
13. Lavar la pastilla con 200 μL de etanol al 70% enfriado a - 20°C.
14. Centrifugar a 12,000 rpm por 5 minutos.
15. Eliminar el sobrenadante teniendo cuidado de no perder la pastilla de ADN.
16. Repetir los últimos tres pasos una vez más.
17. Lavar la pastilla con 200 μL de etanol al 100% a -20ªC.
18. Centrifugar a 12,000 rpm durante 5 minutos y eliminar el sobrenadante teniendo
cuidado de no eliminar la pastilla de ADN.
19. Dejar secar la pastilla a temperatura ambiente (± 23°C).
20. Resuspender el ADN en 20 μL de agua grado Biología Molecular.
21. Cargar 5μL del ADN extraído para visualizar la integridad del ADN mediante
electroforesis en gel de agarosa al 1%.
b) Extracción de ADN a partir de juveniles J2
1. Después de haber realizado el análisis morfométrico, recuperar los juveniles J2 del

medio de montaje.
2. Transferir un solo espécimen en 10 μL de amortiguador de extracción B (10 mM Tris-
HCl pH 8.0, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0.45% Tween 20, 0.05% gelatina) sobre un
cubreobjetos limpio.
NOTA: La cantidad de amortiguador de extracción a utilizar es proporcional al
número de especímenes individuales utilizados, es decir, un espécimen: 10 μL de
amortiguador.
3. Macerar el nematodo con una punta de micropipeta bajo el microscopio
estereoscópico.
NOTA: Tener precaución al momento del macerado, debido a que el
amortiguador de extracción contiene detergentes que pueden generar burbujas,
lo que ocasiona que el espécimen se mueva y se dificulte el macerado. Cambiar
de punta cada vez que se trabaje con esta solución.
4. Mezclar la solución amortiguadora de extracción con el
nematodo macerado con ayuda de la micropipeta.
5. Transferir la solución a un tubo de microcentrifuga estéril de 200 μL. Colocar
el tubo en hielo mientras se continúe trabajando en el macerado de otros
especímenes.
6. Congelar a -40°C por, al menos, 30 minutos.
7. Pasado el tiempo de congelación, incubar inmediatamente los tubos con
muestras a 65ªC por una hora.
NOTA: Se recomienda hacer la incubación en un termociclador.

8. Durante el periodo de incubación, agitar las muestras con vórtex al menos una
vez.
9. Agregar 0.1 μL de Proteinasa K (60 μg/mL) cuando falten 10-15 minutos para
terminar la incubación a 65ªC.
10. Incubar a 95ªC por 15 minutos. Esto permitirá la inactivación de la Proteinasa K.
11. Enfriar a 4°C.
12. Centrifugar por 1 min a 6,000 rpm.
13. Emplear 3 μL del extracto crudo de ADN para una reacción de PCR.

Protocolo de Diagn Stico para La Detecci N de Globodera Rostochiensis Mediante PCR Cuantitativa QPCR

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Protocolo de Diagn Stico para La Detecci N de Globodera Rostochiensis Mediante PCR Cuantitativa QPCR

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DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL

Dirección del Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria

Detección de Globodera rostochiensis

Figura 1. Prevalencia y distribución mundial del nemátodo dorado de la papa (G.

Figura 2. Ciclo de Vida de G. rostochiensis.

Figura 3. Hembras de G. rostochiensis en raíces infectadas de papa.

Figura 4. Cultivo de papa mostrando síntomas de la infección por G. rostochiensis.

Figura 5. Resultados de la amplificación de una muestra positiva a G. rostochiensis

Tabla 1. Secuencia de la sonda y oligonucleótidos usados para la amplificación de

Tabla 2. Concentraciones para la mezcla de reacción para qPCR

Tabla 3. Condiciones de termociclaje para qPCR.

Tabla 4. Condiciones de termociclaje para la PCR punto final.

El Nemátodo Dorado de la papa, nombre común con el que se conoce a Globodera

Se considera originario de Sudamérica, específicamente de la Cordillera de los Andes,

De acuerdo a la normatividad fitosanitaria mexicana, G. rostoshiensis es considerada

Los nemátodos del quiste de la papa pertenecen a la clase Nematoda. El sistema de

Los hospederos de este nemátodo son especies de cultivos y malezas de la familia

El ciclo de vida de los nemátodos formadores de quistes comienza en primavera,

Al pasar al tercer y cuarto estadio, los nemátodos se alimentan del periciclo, la

Al alcanzar la madurez, la cutícula de las hembras se endurece y forma una capa

El nemátodo dorado de la papa es incapaz de desplazarse por sí solo a grandes

El movimiento de semilla-tubérculo, plántulas y suelo que estén contaminados con

Los nemátodos del quiste de la papa no causan síntomas aéreos inmediatamente,

La principal característica del ataque de estos nemátodos es la presencia de

Figura 3. Quistes de G. rostochiensis en raíces de papa infectada.

Cuando las poblaciones de nemátodos son bajas no se observan síntomas específicos

A medida que la población de nemátodos aumenta, los síntomas se hacen más

Los síntomas en campo son no-específicos. Se observa la presencia de manchones

Figura 4. Cultivo de papa mostrando síntomas de la infección por G. rostochiensis.

G. rostochiensis es uno de los principales problemas fitosanitarios de la papa a nivel

El incremento continuo de la población de G. rostochiensis en los suelos infectados se

III. TÉCNICAS DE DETECCIÓN

Sin embargo, la gran similitud morfológica existente entre G. rostochiensis y G. pallida

Por lo general, la discriminación molecular de G. rostochiensis y G. pallida se realiza

Dentro de las técnicas moleculares, la Reacción en Cadena de la Polimerasa

Por esta razón, en el presente protocolo se propone el diagnóstico de Globodera

IV. PROCEDIMIENTO PARA EL DIAGNÓSTICO

1. Toma y envío de muestra

La toma y envío de las muestras se deberá realizar con apego al procedimiento

2. Recepción y almacenamiento del material

El almacenamiento y tratamiento dado a las muestras depende de la naturaleza del

El diagnóstico molecular requiere que se cuente con los especímenes aislados,

Los métodos de aislamiento a partir de un sustrato dado se pueden consultar en el

El protocolo de Diagnóstico para Nemátodos del SENASICA propone dos técnicas de

El procedimiento para llevar a cabo la extracción de ADN se encuentra detallado en

4. Amplificación de ácidos nucleicos

El diagnóstico molecular de G. rostochiensis se emplea, generalmente, como un

En este protocolo se propone la identificación del nemátodo dorado de la papa

tamaño que oscile entre 100-150 pb y un sistema reportero de fluorescencia para

Tabla 1. Secuencia de la sonda y oligonucleótidos usados para la amplificación de

Tabla 2. Componentes y concentraciones para la mezcla de reacción para qPCR

NOTA: El método ha demostrado ser confiable en un rango de 5 pg/L a 100 ng/L

Para la preparación de la mezcla de reacción deberá considerarse el total de

Las condiciones de termociclaje para el diagnóstico de G. rostochiensis se describen

Tabla 3. Condiciones de termociclaje para qPCR.

Para poder llevar a cabo la identificación de G. rostochiensis se requiere la tecnología

El monitoreo de los productos amplificados se produce conforme transcurre la

el ciclo de amplificación y la fluorescencia detectada por el equipo, generando un

Figura 5. Resultados de la amplificación de muestras positivas a G. rostochiensis mediante qPCR. La

Para determinar un resultado de diagnóstico se debe considerar lo observado en los

En este caso, el control negativo no debe presentar un valor de cuantificación

Las muestras que presenten valores de Ct menores a 37 serán consideradas positivas,

En caso de que el diagnóstico molecular de G. rostochiensis se hay realizado como