2017 Qa Espec Uv Vis

Quimica Analitica – 2do Cuatrimetres 2017
Dr. Fernando A. Iñón.
Temario
Espectroscopía UV-VIS l Teoría de la espectroscopia UV-VIS y

Absorción y fluorescencia luminiscencia
l Instrumentación UV-VIs
l fuentes, elementos dispersivos, detectores,
interferencias.
Química Analítica
l Aplicaciones y consideraciones estructurales
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
l Luminiscencia: Fluorescencia
Universidad de Buenos Aires
Dr. Fernando A. Iñón
¿Qué debo saber explicar? Radiación electromagnética

l Cuáles son los fenómenos espectroscópicos
e
l Cuál es la relación entre potencia incidente y c
transmitida y de qué parámetros depende
l Cómo están conformados los instrumentos y H
cual es el rol de cada parte
l
l Cómo se llevan a cabo las medidas
experimentales, qué interferencias pueden e = campo eléctrico H = campo magnético
existir y cómo se calcula la composición de c = velocidad de la luz (300000 km/s)
una muestra l = longitud de onda n = frecuencia = c / l
¿Ondas o partículas de luz? Efecto Fotoelectrico …

• A principios del siglo XX comienza nuevamente la polémica. l De acuerdo con la teoría ondulatoria, la fuerza o amplitud de la
Ninguna de las dos teorías puede explicar todos los fenómenos luz se hallaba en proporción con su brillantez:
físicos. la luz más brillante debería ser más que suficiente para crear el
paso de electrones por el circuito.
Sin embargo, extrañamente, no lo producía.
• Einstein concluyó que los

Reflexión þ þ electrones eran expelidos del
Refracción þ þ - - metal por la incidencia de
- -
Interferencia þ ý fotones.
Difracción þ ý • Cada fotón individual
Polarización þ ý acarreaba una cantidad de
energía E, que se relacionaba
E. Fotoeléctrico ý þ con la frecuencia n de la luz.

Universidad de Buenos Aires 1
Energía asociada a un fotón Interacción de la materia con

radiación electromagnética
l Fenómenos espectroscópicos
E = hn = hc/l Ø Absorción
Ø Emisión
Ø Fluorescencia
E = energía (J)
l La materia sufre cambios en su energía interna en función
h = constante de Planck (6.63 x 10-34 J/s ) de sus niveles CUANTIZADOS electrónicos, vibracionales,
rotacionales. La energía de la radiación electromagnética
c = velocidad de la luz (3 x 1010 cm/s)
debe estar relacionada con la diferencia entre la energía de
l = longitud de onda (cm) estos niveles energéticos internos.
n = c/ l = frecuencia (1/s)
l Dispersión (Scattering)
n = 1/ l = N°de onda (cm-1)
Ø Elástica
Ø Inelástica
7
Emisión EMISIÓN
Absorción ABSORCIÓN
Q hn hn Q
Interacción luz-materia:
Luminiscencia (flourescencia, fosforescencia)
Espectroscopias
FLUORESCENCIA
EMISIÓN ABSORCIÓN FLUORESCENCIA

hn1 hn2
Q hn hn Q hn1 hn2
l Cambio de energía interna de la materia por

interacción con radiación electromagnética
l Einterna @ Eelectrónica + Evibracional + Erotacional

Transiciones electrónicas
Energía de Transición
Nivel
energético
Estado excitado E1
(eV)
ESTADOS EXCITADOS
DE e DE = E1 - E0 = hn
Energía
ENERGÍA DE = hn = hc/l
Estado fundamental E0
ESTADO
FUNDAMENTAL
Transiciones
Energía
v2
v1
v0
E1
TRANSICION v2 TRANSICION
ROTACIONAL
R5 ELECTRONICA
4
3 v1
2 TRANSICION VIBRACIONAL
1
0
v0 E0
Teoría de Orbitales Moleculares

• Los Orbitales Moleculares resultan de la
Combinación Lineal de Orbitales Atómicos
• Dado que los orbitales son funciones de onda, se
pueden combinar:
• constructivamente
(formando un OM ligante),
• destructivamente
(formando un OM antiligante).
17

Teoría de Orbitales Moleculares

Las funciones de onda de los átomos de hidrógeno A y B
pueden interactuar en forma constructiva o destructiva.
Constructivamente:
Ψ(σ) = (1/√2 ) [φ(1sa) + φ(1sb) ]

Destructivamente
Ψ(σ*) = (1/√2 ) [φ(1sa) - φ(1sb) ]
20
Transiciones electrónicas en moléculas
anti-enlazantes
ENERGÍA
no-enlazante
enlazantes
Niveles de Energía Transiciones
22
El espectro electromagnético Átomos y moléculas UV-VIS

I
Dl <0.01nm
Visible
E1
Rayos X Ultravioleta Infrarrojo Microondas Radio
DE = hc/l
E0
10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 1 l
l (m)
LINEA
ATOMO
3x1012 3x1010 3x108 3x106 3x104 3x102
n (MHz) I
V1,2
E1
V1,1
Dl ~20-30nm
V1,0
V0,2
Electrones Vibraciones V0,1
internos Electrones moleculares E0 V0,0
externos Rotaciones moleculares
l
MOLECULA BANDA

Principios de la espectroscopía Espectrofotometría de absorción

CELDA CON ANALITO
Fuente de Radiación
radiación transmitida
LUZ LUZ
MUESTRA
INCIDENTE TRANSMITIDA
DE LA P0 P1
AL
FUENTE
DETECTOR
§ Parte de la luz emitida por la fuente IR es DE LUZ
absorbida por la muestra
§ La porción transmitida es medida por el
detector CAMINO OPTICO
P1
Transmitancia T =
P0
25
Espectrofotometría de absorción Transmitancia y Paso Óptico

l La transmitancia 100% 50% 25% 12.5% 6.75%
P0 P1 depende del I0 I1 I2 I3 I4
P1 espesor de la
Transmitancia T = b
P0 muestra atravesada 100
Transmitancia
80
l Incrementando al 60
%Transmitancia T% = T x 100 doble el paso

40
20
óptico, la 0
0 b 2b 3b 4b
Paso óptico
100% = transmisión total transmitancia se
Ley de Lambert
reduce a la mitad
0% = absorción total I = I0 e –k b
Deducción Ley de Lambert-Beer

Transmitancia y Concentración Un haz de luz monocromática de intensidad I y
L
frecuencia n atraviesa una muestra de una I0 I

substancia B en solución de concentración CB, s
l La transmitancia 100%
c
50%
que es capaz de absorber la radiación incidente
Probabilidad de que una partícula de
depende de la I0 I1
dI n B absorba un fotón dl
Área
- n = K dN B Proporcional al dN = N c s dl
concentración de la 100%
I0
2c 25%
I2 I partículas de B
número de B A B
Partículas en un diferencial de
muestra 100
90
100%
3c 12.5%
Proporción de radiación absorbida longitud
I0 I3
Absorbancia para la
dI n
80
Coeficiente de
Incrementando la
Transmitancia
frecuencia n
l - n = KN As cB dl
70
absorción molar
60 100%
I0
4c
6.75%
I4 I A e (n ) para la
concentración al
50
40
frecuencia n
30
In dI n l
I 0n KN As
doble, la 20
- òn = KN As cB ò dl log = cB l
In
10
I0 0
In ln10
transmitancia
0
0 c 2c 3c 4c
Concentración
Ley de Beer
decrece a la mitad An = e (n )cBl Ley de Lambert-Beer
I = I0 e –k C

La absorbancia es un parámetro adimensional en escala

logarítmica determinable experimentalmente mediante técnicas Espectrofotometría de absorción
espectrofotométricas
e (n nm )
El coeficiente de absorción molar
varia según la frecuencia de la P0 P1
e (n )
radiación incidente
P1
Transmitancia T =
An = e (n )cBl cm
P0
n1 n2 L·mol-1·cm-1 mol·L-1
n Unidades típicas Absorbancia A = -log T
Las bandas de absorción en líquidos se suelen extender por un intervalo de
frecuencias n1 y n2.
A = 0 (100%T) transmisión total
n2
A = òn e (n )dn A= µ (0%T) = absorción total
1 % Transmitancia
Coeficiente de absorción molar integrado
Unidades típicas L·mol-1·cm-1s-1

Absorbancia
Absorción y Ley de Lambert-Beer
P0 P1
l Si incide luz monocromática

de frecuencia n se verifica que:
b
Al = el x b x C
el = absortividad
molar (o coeficiente de absorción)
b = camino óptico (cm)
C = concentración de la especie absorbente
Absorción y Ley de Beer Análisis de mezclas multicomponentes

A una dada longitud de onda, la absorbancia medida dependerá de la
Al = e l ´ b ´ C
concentración y la absortividad de todas las especies químicas. Si se considera
absorbancia aditivita e independencia química para dos especies:
Al1 = CM aM' l1 + CN aN' l1

Al
Al Al 2 = CM aM' l 2 + CN aN' l 2
C=
el ´ b l LIMITACIONES DEL METODO
l Encontrar las longitudes de onda adecuadas
C l Interferencias entre componentes del sistema
(reacciones, variaciones de pH, etc.)

Instrumentación Espectrofotómetro UV-VIS

l Componentes del espectrofotómetro
l Fuentes de luz Componentes
l Elementos de selección de longitud de onda
l Tipos
l De filtros (de absorción y de interferencia)
l Monocromadores (de prisma y de red de difracción)
l Resolución
l Luz espuria
l Detectores
l Otros componentes
l Espectrofotómetros de doble haz
l Espectrofotómetros de dispositivo de fotodiodos
Fuentes de radiación Lámpara de W-halógeno

l CONDICIONES BASICAS : l Rango: 330 a 2500 nm (VIS y NIR)
l Suficiente energía radiante en toda la

región de longitudes de onda donde se
utiliza.
l Intensidad constante durante el intervalo Ventanas de cuarzo

de tiempo de medición. Excelente estabilidad
Lámpara de W-halógeno Lámpara de deuterio

l RANGO ESPECTRAL:
l Ciclo regenerativo del halógeno l Espectro continuo
l 160 a 370 nm (UV)
l Líneas espectrales
l l = 486.0 y 656.1 nm (también 433.9 y 410.1 nm)
D2 + e- ð D2* ð D + D + hn

Lámpara de deuterio Otras lámparas: Xenón
• La excitación del deuterio atómico produce un espectro de Las lámparas de flash de Xenón proveen alta energía con corto tiempo
líneas, siendo las más importantes las 486.0 y 656.1nm de calentamiento y larga vida útil.
Pueden medir tanto en el UV como en el Visible (190 - 1100 nm).
Típicamente disparan 80 flashes por segundo, con un sonido distintivo.
200 300 400 500 600 700 800 nm
Selección de longitudes de onda Selección de longitudes de onda
l El selector restringe el rango de longitudes El ancho de banda efectivo es el rango de

de onda de la radiación que incide sobre el longitudes de onda en el que la transmisión es
mayor que la mitad del valor máximo.
analito.
l Cuanto menor el rango, mayor adherencia a

la Ley de Beer.
l Cada selector tiene un ancho de banda l0

nominal efectivo.
ancho de banda efectivo = l2 – l1
Resolución Resolución
l Capacidad de discernir diferentes longitudes
l El ancho de banda instrumental es el intervalo de
de onda
longitudes de onda que deja pasar el filtro/
dispositivo de monocromación
l El ancho espectral natural para una la molécula es
el ancho de banda de absorción medido a la mitad
de su altura A
Ancho de media banda
l0
l el puede tener un efecto instrumental!!

Resolución Resolución
l La resolución depende del ancho de banda Espectros de vapor de benceno
1nm 2nm Parámetro que exigen

las Farmacopeas
La Farmacopea Europea
exige un cociente superior
a 1.5 entre el pico a 269
nm y el valle a 266 nm
para una solución de
tolueno en hexano. El Ancho de banda Ancho de banda nominal: 1.5 nm
cociente es 2.23 en el nominal 0.5 nm
diagrama mostrado
Efecto del ancho de ranura Luz espuria

l Es luz parásita de longitud de onda diferente a la de
interés
l Fuentes de luz espuria o parásita:
l Luz de órdenes superiores de la red de difracción
l Dispersión de luz por partículas de polvo o manchas en
superficies ópticas
l Reflexión de luz por paredes del monocromador, lentes y
montaje de componentes ópticos
l ¿Cómo afecta a las mediciones?
Luz espuria Luz espuria
P0 P1 P0 P1
PS PS PS PS
Cuanto menor la transmitancia T , mayor el efecto

La transmitancia medida TM será mayor que la
transmitancia teórica T Ejemplo: equipo con luz espuria 1% a T=10%
P1 + PS P1 + PS 0,1 + 0,01 0,11

TM = TM = = = = 0,1089
P0 + PS 1 + 0,01 1,01
P0 + PS
AM = - log 0,1089 = 0,963

Luz espuria Luz espuria

5
S = 0,0001%
Ejemplo:
Para un espectrofotómetro con nivel
Absorbancia medida
S = 0,001%
4
de luz espuria del 0,05%
S = 0,01%
3 S=0.05%
S = 0,1%
Abs TEÓRICA Abs MEDIDA ERROR
2
S = 1% 1.0000 0.9980 0.19%
1
2.0000 1.9790 1.05%
1 2 3 4 5
3.0000 2.8241 5.86%
Absorbancia teórica
4.0000 3.2221 19.45%
Luz espuria Selección de longitudes de onda
l Cómo disminuir la luz espuria: l Filtros

l Usando filtros de corte de órdenes superiores l De Absorción
l Usando doble monocromador l De Interferencia
l Pintando las paredes y montajes del
monocromador de negro mate l Monocromadores
l Usando monocromadores herméticos (evita la
l Prismas
corrosión de superficies ópticas y el ingreso de
polvo atmosférico) l Redes de difracción
l Utilización de fuentes LED
Filtros de absorción Filtros de interferencia

l Usan la interferencia óptica para obtener radiación
de bajo ancho de banda.
l Consisten de un aislador dieléctrico (MgF2 o CaF2)
entre dos películas metálicas semitransparentes.
vidrio
film metálico
capa dieléctrica
film metálico
vidrio

Filtros de interferencia Monocromadores

l Para mediciones fotométricas exactas, la luz
incidente debe ser monocromática (el ancho
espectral tan pequeño como sea posible) y la
longitud de onda tiene que ser aquella de
máxima absorción del analito.
l Para obtener un espectro de absorción, se
mide la transmitancia o absorbancia en
función de la longitud de onda.
l Si bien tienen menor ancho de banda efectivo que los filtros
de absorción y son útiles en un rango espectral más amplio,
no permiten la libre selección de la longitud de onda ni la
adquisición de espectros
Monocromadores Refracción a través del Prisma

l Los monocromadores contienen diversos
• El índice de refracción (η) varía con la longitud de onda
elementos ópticos:
l Ranuras de entrada y salida
l Elementos de reflexión y enfoque

l Lentes y/o espejos colimadores
l Elemento dispersor
l Prisma
l Red de difracción
Refracción a través del Prisma Red de difracción

• El comportamiento del prisma no es lineal, se l La mayoría de los monocromadores actuales
encuentran más comprimidas las longitudes de
onda altas
usa una red de difracción reflectante.
l La red consiste en una superficie óptica
plana pulida sobre la que se graban líneas
paralelas igualmente espaciadas.

Red de difracción
Resolución en monocromadores
basados en redes de difracción
n=0 l La resolución depende de:
slit l La densidad de líneas (N, mm-1)
n=2
l El diámetro de la ranura de entrada y salida.
n=1
l R se incrementa al:
l incrementar N, pero a expensas del rango espectral
y la intensidad de luz
El problema es que en un mismo ángulo coexisten distintas l Al disminuir el ancho de las ranuras, pero a
longitudes de onda (distintos órdenes de la red): expensas de la intensidad de luz
600 nm (n=1) = 300 nm (n=2) = … = nλ = cte.
Red de difracción
Montaje Czerny-Turner
En monocromadores convencionales (UV de mesada) se utiliza n=1.
Los órdenes superiores se eliminan mediante filtros de corte.
Rueda de filtros
Ranuras (slits) Ancho de ranura

l La ranura de entrada de un monocromador l Algunos monocromadores tienen ranuras
es la fuente de la energía radiante. variables.
l La imagen de la ranura de entrada se enfoca
en el elemento dispersor y luego en el plano l Al disminuir el ancho de ranura aumenta la
focal de salida. resolución.
l La ranura de salida puede ser ajustada de
modo de limitar el rango de longitudes de l Pero al mismo tiempo la potencia radiante
onda que pasa a través de la misma. disminuye en una relación cuadrática,
aumentando la relación S/R.
l Al costo de reducir la potencia de la luz de salida

Resolución Detectores fotosensibles

Cómo seleccionar el ancho de banda instrumental
l Deben tener
MUY ANCHO:
A desviaciones a la ley de Beer
l Respuesta lineal
MUY ANGOSTO:
Poca luz, disminuye S/R
l Sensibilidad suficiente en el rango
espectral de interés
l
l0
Optimo:
ancho instrumental = 1/10 del ancho de media banda
Efecto fotoeléctrico Tubo Fotomultiplicador (PMT)
Cuando un fotón alcanza el cátodo fotosensible, se Los electrones liberados en el fotocátodo son acelerados hacia
libera un electrón que es acelerado hacia el ánodo. los dínodos, arrancando más electrones. Cada dínodo está a un
potencial más positivo que el anterior, produciéndose un efecto
Se mide la corriente. de multiplicación de electrones y aumentando la sensibilidad.
Tubo Fotomultiplicador (PMT) Tubo Fotomultiplicador (PMT)

a) Sin tensión aplicada
Fotosensibilidad (A/W)
b) Con polarización directa entre los
electrodos
c) Con polarización inversa (negativa)
Longitud de onda (nm)

d) Generación de corriente resultante del
impacto de un fotón en el área de despoblación
Fotosensibilidad (A/W)
Longitud de onda (nm)
87
Instrumentos de doble haz Instrumentos de doble haz

Instrumentos de doble haz Dispositivo de fotodiodos

W-I
D2
Muestra
Ranura
DAD
Red PC
90
Comparación de espectrofotómetros Comparación de espectrofotómetros

Convencional Array de diodos
CONVENCIONAL DAD
EXACTITUD ESPECTRAL R
REPETIBILIDAD ESPECTRAL R
EXACTITUD FOTOMETRICA R
RESOLUCION R
LUZ ESPURIA R
DERIVA R
VELOCIDAD (adquisición de espectros) R
MEDICION SIMULTANEA A VARIAS l R
DEGRADACION DE MUESTRAS R
COMPARTIMENTO DE MUESTRAS R
92
Celdas de muestra Materiales Celdas

l Cuarzo o sílice fundida
l UV – Visible - NIR
l Vidrio grado óptico (350 - 2000 nm)

l Visible - NIR
l Plástico
l Visible

Celdas de muestra Celdas cilíndricas
Microceldas Celdas de flujo
Definiciones Definiciones
• Cromóforo
• Cualquier grupo de átomos que absorben luz sin λè Corrimiento batocrómico
importar si se produce “color” o no Desplazamiento de la absorción hacia mayores long. de onda
• Auxocromo çλ Corrimiento hipsocrómico

• Grupo que extiende la conjugación de un Desplazamiento de la absorción hacia menores long. de onda
cromóforo compartiendo electrones no enlazantes

εé Efecto hipercrómico
Incremento de la intensidad de absorción
X
εê Efecto hipocrómico
Disminución de la intensidad de absorción
cromóforo
Chromophore auxocromo
Auxochrome

Electrónicas Transiciones en
Orbirales s y s*
moléculas Orgánicas
Transiciones electrónicas:
Orbitales p y p*
p ® p*
La transiciones p ® p* involucran
orbitales que tienen un solapamiento
significativo, y la probabilidad es cercana
a 1.0 ya que son de “simetría permitida”.
104
Transiciones p ® p* Transiciones electrónicas:

Unión triple n ® p*
Los orbitales n no solapan bien con el

orbital p*, con lo cual la probabilidad de
Compuestos orgánicos con grupos -C≡C- o -C≡N, o metales
excitación es baja. El e de una transición
de transición complejados con ligandos C≡N- o C=O, n®p* es unas 103 veces más pequeño
usualmente tienen orbitales p* de baja energía. que los e de una transición p®p* ya que
son de “simetría prohibida”.

Absorción de cromóforos Cromóforos Orgánicos

Cromófero Transición ` log(e)
Nitrile (-C≡N) h to p* 160 <1.0
Alkyne (-C≡C-) p to p* 170 3.0
Cromóforo Ejemplo Excitación lmax, nm e Solvente
Alkene (-C=C-) p to p* 175 3.0
C=C Etheno p __> p* 171 15,000 Hexano Alcohol (ROH) h to s* 180 2.5
Ether (ROR) h to s* 180 3.5
CºC 1-Hexino p __> p* 180 10,000 Hexano
p to p *
180 3.0
Ketone (-C(R)=O)
h to p* 280 1.5
n __> p* 290 15 Hexano
C=O Etanal p to p* 190 2.0
p __> p* 180 10,000 Hexano Aldehyde (–C(H)=O)
h to p* 290 1.0
n __> p* 275 17 etanol Amine (-NR2) h to s* 190 3.5
N=O Nitrometano
p __> p* 200 5,000 Etanol Acid (-COOH) h to p* 205 1.5
Ester (-COOR) h to p* 205 1.5
C-X X=Br Metilbromuro n __> s* 205 200 Hexano Amide (-C(=O)NH2) h to p* 210 1.5
X=I Metil Ioduro n __> s* 255 360 Hexano Thiol (-SH) h to s* 210 3.0
Nitro (-NO 2) h to p* 271 <1.0
Azo (-N=N-) h to p* 340 <1.0
Transiciones en alquenos
Clasificación de bandas
p ® p*
B (por benzoico)
E (por etilénico)
R (por tipo radical)
K (por conjugación – del término alemán “konjugierte”)
lmax, nm e, M-1 cm-1 log10e Asignación

O
244 12,600 4.1 p ® p* K
C CH3
280 1,600 3.2 p ® p* B
317 60 1.8 n ® p* R
acetophenone
Transiciones en dienos
Espectro UV-Vis del isopreno
p ® p*

Espectros UV-Vis de dienos Transiciones p ® p* de polienos
La conjugación baja la energía de

Dienos conjugados
transición p ® p*
Alqueno lmax (nm) e log10(e)
CH2=CH2 165 10,000 4.0
p* CH3CH2CH=CH-CH2CH3 184 10,000 4.0

(trans)
CH2=CH-CH=CH2 217 20,000 4.3
p CH3-CH=CH-CH=CH2 224 23,000 4.4

(trans)
CH2=CH-CH=CH-CH=CH2 263 53,000 4.7
(trans)
CH3(-CH=CH-)5CH3 (trans) 341 126,000 5.1
CH2=CH2 165 nm CH2=CH-CH=CH2 217 nm
Harwood and Claridge, p. 15 Field, Sternhell & Kalman, p. 10
Espectro de polienos y
Colorantes Orgánicos
compuestos poliaromáticos
lmax = 602 nm
lmax = 495 nm
lmax = 478 nm

Bandas UV-Vis de compuestos

carbonílicos comunes 0.80
Compuesto Estructura lmax (nm) e log10(e) Etinilestradiol (26 mg/L)
Absorbancia
0.60 Gestodeno (5.4 mg/L)
Acetaldehído H3C
C
O 293 12 1.1 Levonorgestrel (7.2 mg/L)
H
0.40
H3C O
Acetona C 279 15 1.2 0.20
CH3
0.00
H
Butenal 207 12,000 4.1 220.0 240.0 260.0 280.0 300.0
C O Longitud de onda (nm) CH3
H2C C 328 20 1.3 CH3
OH
OH
CH2 C CH
C CH
CH3
H
4-metilpent-3- 238 12,000 4.1 CH3
H3C C O
en-4-ona C C 312 40 1.6
OH
CH2 C CH
HO
CH3 CH3 O
Ciclohex-2-en- 225 7,950 3.9 ETINILESTRADIOL (ETE) LEVONORGESTREL (LEV)
1-ona O
Benzoquinona 247 12,600 4.1 O
O O GESTODENO (GTD)
292, 363 1000, 250 3.0, 2.4
Absorción por compuestos inorgánicos Metales de transición

-Los espectros presentan máximos de absorción anchos y poca estructura l Los iones de Cu(II) no complejados aparecen blancos o incoloros
porque la transición entre el orbital ocupado más alto y el desocupado
fina.
más bajo es de alta energía, y la longitud de onda muy baja para ser
-Excepción: iones de la serie de los lantánidos y actínidos. Los e- (4f observada.
y 5f) responsables de la absorción están apantallados de influencias • En los iones de Cu(II) hidratado los niveles energéticos de los orbitales
externas por e- situados en orbitales de nº cuánticos elevados. 3d se desdoblan, siendo posibles las transiciones por absorción de luz
Consecuencia: bandas de absorción estrechas y están relativamente poco visible. El Cu(II) hidratado aparece azul porque la absorción ocurre en
afectadas por la naturaleza de las especies asociadas a ese ión y por el el extremo rojo del espectro.
disolvente.
- Iones y complejos de las 2 primeras series de transición: son

coloreados al menos en alguno de sus estados de oxidación. La
absorción de radiación visible se debe a transiciones de e- entre
suborbitales d completos y vacíos que difieren en energía a causa de los
Ión en campo ligando esférico Ión en campo ligando octahédrico
ligandos unidos a los iones metálicos. La diferencia de energía entre
Desdoblamiento de energía de orbitales d en Cu(H2O)62+
orbitales d depende del estado de oxidación del elemento, su posición
en la Tabla periódica y la clase de ligando unido a ese ión.
Efecto de los ligandos sobre los máximos de

Metales de transición absorción asociados a transiciones d->d
• El grado de desdoblamiento depende del ligando:
• si reemplazamos el agua por amoníaco aumenta el ∆E y
el color del complejo se hace azul-violeta dado que la
absorción ocurre en la mitad del espectro visible.
• Notar que también hay un efecto hipercrómico

(aumenta ε).
Espectro UV-VIS de Cu(H2 O)6 2+
Espectro de Cu(NH3 )4 (H2 O)2 2+

Orden creciente de aumento de este desdoblamiento
I < Br < Cl < F < OH- < C2O 42- = H2O <SCN- < NH3 < etilendiamina < o-fenantrolina < NO2- < CN-
- - - -

Absorción por transferencia de carga Absorción por transferencia de carga

- Complejo de transferencia de carga: consta de un grupo
dador de e- unido a un aceptor de e-. • Absorción más importante en
muchos complejos inorgánicos
- Cuando uno de estos compuestos absorbe radiación, se transfiere
un e- del dador a un orbital localizado preferente en el aceptor. • Transferencia de un electrón
desde el orbital dador hasta el
- El estado excitado es un producto de un proceso de oxidación aceptor
/reducción.
- Complejos inorgánicos y orgánicos.
-Se caracteriza por tener absortividades molares mayores de las

habituales (eMax > 1000), circunstancia que conduce a una gran
sensibilidad.
Solventes Elección del Solvente

l Alta pureza l Transparente en la zona de absorción
l Deben disolver completamente la muestra l Longitud de onda de corte (cut-off)
l Compatibles con los materiales de las celdas l Toxicidad
l Transparentes en la región espectral de

interés
l No deben ser usados cerca o por debajo de
la longitud de onda de corte (l a la cual la
absorbancia del solvente se aproxima a 1)
Efecto del solvente Efecto del solvente

• En la mayoría de las
en HEXANO en ETANOL z • El efecto inverso se observa si el
transiciones π→π* los estados
en HEXANO en AGUA estado excitado reduce el grado de
excitados presentan mayor
uniones por puente hidrógeno.
separación de cargas y por lo
tanto son más polares que sus • Aquí las transiciones son n→π* y
estados fundamentales. el desplazamiento de λ se debe
al menor grado en que el
• Si se usa un solvente polar la
solvente se puede unir por
interacción dipolo–dipolo
puentes H al estado excitado.
reduce la energía del estado
excitado más que la del • En particular, los grupos carbonilo
fundamental, por lo que la tienden a interaccionar con el
Espectro UV de 4-metil-3-penten-2-ona absorción en un solvente polar
(óxido de mesitilo) en hexano y en etanol Espectro UV de propanona en hexano y en agua solvente por puente H.
como etanol será a mayor λ
(menor E, menor ν) que en un • Al cambiar como solvente de
solvente no polar como hexano. hexano a agua el λmáx en el
espectro de la propanona se
corre de 280 a 257 nm

Efecto del solvente Mediciones típicas con UV-Vis
l Técnicas colorimétricas: técnicas analíticas

Efecto del solvente en el máximo de características por lograr especificidad a
absorción de propanona través de reacciones que producen la
generación o desaparición de color
Solvente λmax ε @ λmax
Hexano 280 14.8
l Ampliamente utilizadas para la determinación
Triclorometano 277 17.0 de:
Etanol 271 15.2
Agua 257 17.4
l Cationes
l Aniones
l Algunos compuestos orgánicos: fenoles,
pesticidas
APLICACIONES
CARACTERÍSTICAS DE LOS MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS

APLICACIONES MEDIOAMBIENTALES
- Amplia aplicabilidad.
- Elevada sensibilidad: los límites detección 10-4 a 10-5 M.
- Selectividad de moderada a alta.
- Buena exactitud: errores de concentración 1-5% o incluso menores.
- Facilidad y comodidad en las medidas espectrofotométricas.
- Se prestan a una fácil automatización.
CAMPO DE APLICACIÓN
- Especies absorbentes: compuestos orgánicos que contengan grupos
cromóforos y especies inorgánicas como son los metales de transición.
- Especies no absorbentes: los analitos reaccionan con un reactivo
para producir un compuesto absorbente.
ANALIZADORES DE FLUJO CONTINUO NO SEGMENTADO
Ley de Beer: Desviaciones

ü FLUJO NO SEGMENTADO
§ Las muestras se inyectan en el flujo. En la detección no se alcanza ni el equilibrio
físico ni el equilibrio químico.
§ Se distinguen dos modalidades:
Ø CON INYECCION :
a)Análisis por inyección en flujo (FIA )
b) Análisis por inyección en flujo segmentado, interrumpido y almacenado l Instrumentales
(SF/USA)
Ø SIN INYECCION: l Ancho de banda espectral grande
Análisis en flujo completamente continuo
Ø CON INYECCION : l Efecto de la Exactitud y precisión
üANALISIS POR INYECCION
EN FLUJO (FIA)
§ Son una consecuencia de los l Químicas
métodos de flujo segmentado sin las
burbujas de aire. l Cambios en equilibrios químicos o físicos
§ En la figura a se muestra un
sistema FIA para la determinación l Degradación de reactivos
colorimétrica de calcio en suero,
leche y agua potable. l Inespecificidad del reactivo o del medio de
§ El buffer y el reactivo se mezclan
en un serpentín antes de la inyección reacción
de la muestra.
§ En la figura b se muestran los
fiagramas para tres muestras por
l Reales
triplicado y cuatro patrones por
duplicado. l Cambios en el índice de refracción de la muestra

Longitud de Onda Interferencias

l Exactitud y Reproducibilidad
l Dispersión de la
Luz
Interferencias Interferencias
l La ley de Lambert-Beer relaciona la concentración con el logaritmo de la
l Espectrales transmitancia interna de la solución:
l En ciertos casos se puede corregir l toda otra pérdida de potencia es una interferencia.
Interferencias Métodos analíticos

*A y B especies absorbentes
l Análisis cualitativo
Factor Causa Información Proceso*
l comparación espectral
Constante de equilibrio de
(1) concentración Auto-asociación nA ↔An (n ≥2)
asociación l Análisis cuantitativo:
Equilibrio Constante de equilibrio de l Técnicas de medición (definición de respuesta analítica)
(2) pH A+H3O+ ↔AH++H2O
acido/base protonación
l Corrección de fondo espectral
Reacción química
(3) tiempo Velocidad de reacción A→B l Espectroscopia de absorción de diferencias
(incluyendo solvólisis)
l Espectroscopia de doble longitud de onda
(4) potencia hν
Reacción fotoquímica Velocidad de reacción
(radiante) A → B l Espectroscopia de derivadas
Constante de equilibrio y hν
l Ajuste (matching) de absorbancia
Fotocromismo
velocidad de reacción A↔B l Técnicas de cuantificación (correlación respuesta analítica y
(5) presencia del concentración)
Formación de complejos Constante de equilibrio A + B ↔AB
componente B l Calibración externa
(6) temperatura Termocromismo Constante de equilibrio A ↔B l Agregado patrón
Interacciones l Análisis de mezclas multi-componentes
(7) solvente Tipo de transición
soluto-solvente

Métodos Cuantitativos Métodos Cuantitativos

• Técnicas de medición
l Técnicas de medición
• Espectroscopia de derivadas
l Espectroscopia de derivadas
– Estrictamente se calculan en función del número de onda
l Limitaciones
(en función de λ son levemente diferentes)
l Bandas de absorción muy parecidas
dA de
Al = e l × b × C = b ×C × l l d2el/dl2 debe ser grande (bandas de absorción estrechas)
dl dl
l Disminuye la relación S/N.
l Permite determinar el pico de absorción aunque exista
superposición de bandas.
l Destaca bandas de absorción débiles parcialmente ocultas
en bandas anchas
l Destaca bandas agudas en fondos espectrales anchos

Calibración externa
Calibración externa
l Soluciones patrón con concentración conocida Al = e l × b × C Al
0.5
del analito (especie a determinar)
l Matriz similar a la de la muestra Al = m × C (+0) ? 0.4
0.3
Ax
l Intervalo de concentraciones de interés Conc. Abs
0.2
0.000 0.000 0.1

l Blanco de solvente 0.200 0.171
l Seleccionar la banda de absorción a la cual se 0.400 0.341

0.0
0 0.2 0.4 0.6 C
realizarán las mediciones de absorbancia
0.600 0.512
Cx
Método del Agregado Patrón Método del Agregado Patrón

Muestra tipo
l Para sistemas con matriz compleja, difícil de reproducir Al Matriz ideal Muestra tipo
en los patrones Matriz real
0.5 Matriz ideal

l Debe verificarse la relación lineal entre A y C
0.4
l Se añade a la muestra una pequeña cantidad de Matriz real
solución de analito, de concentración conocida (patrón) 0.3
0.2
l Se mide la muestra y la muestra que contiene una
concentración agregada “a” de analito 0.1
-2a -a 0 a 2a 3a C
Cx

Incertidumbre en las medidas Incertidumbre en las medidas
l La absorbancia de la muestra
debe estar entre 0.1 y 1
l Mínimo error relativo:
l en detector limitado por ruido
térmico (fototubo-fotodiodo) 0.43
l en detector limitado por ruido de
disparo (fotomultiplicador) 0.86
8.7.- APLICACIONES
Espectrofotometria con fibras opticas
VALORACIONES FOTOMÉTRICAS Y ESPECTROFOTOMÉTRICAS
l Son fibras finas de materiales como el vidrio, silice fundido o
plástico. Su diámetro oscila entre 0,05µm y 0,6cm. Ø Las medidas espectrofotométricas son útiles para localizar
l La trasmisión de la luz se produce por reflexión interna, para puntos de equivalencia en valoraciones siempre que uno o más
que sea total se recubre la fibra con material de índice de
refracción menor que el de la fibra. de los reactivos o productos absorban la radiación.
l También existen los sensores de fibra óptica (optrodos). Esto Ø Curva fotométrica: representación de la absorbancia
permite instrumentos para la medida in-situ.
(corregida por la variación de volumen) en función del volumen
l Se arman arreglos experimentales donde una fuente de de valorante.
radiación se trasmite través de una fibra óptica, al final se
encuentra un reactivo que va a reaccionar con el analito en
cuestión, esta reacción va a provocar una variación de la
radiación incidente, que se va a recoger a través de otra fibra
óptica hasta el detector.
Accesorio Stopped Flow Mediciones Stopped-Flow
Reducción de Cr(VI) por H2O2 medio ácido

Mediciones Stopped-Flow Fluorescencia molecular
Es un proceso de fotoluminiscencia en
que las moléculas se excitan por
absorción de radiación electromágnética.
La especie excitada posteriormente se
relaja hasta el estado fundamental, con
la liberación de su exceso de energía en
Reacción de ferricianuro con ácido ascórbico
forma de fotones
DIAGRAMA DE ENERGÍA (Jablonski)
S2 CI RV
CS
S1
T1
E
ABSORCIÓN
N
E F CE P
R
G
í
A
S0
l1 l2 l3 l4
Factores que influyen en la señal Factores que influyen en la señal

fluorescente fluorescente
tipo de transición
tipos de transición p* p p* n
estructura concentración
Compuestos aromáticos,
estructuras con dobles enlaces
estructura
conjugados, anillos aromáticos
solvente LUMINISCENCIA pH fusionados. Rigidez. Sustituyentes
EN SOLUCIÓN
C
temperatura apagadores H2
químicos fluoreno bifenilo

Rigidez estructural Efecto de átomo pesado interno

FLUORESCENCIA
F RELATIVA
100%
Cl
7%
Br
0.2%
I
<0.05%
Espectro de exitación/emisión Análisis cuantitativo

f = No fotones emitidos/No fotones absorbidos
F f = IF/IA
EXCITACIÓN EMISIÓN IF = f IA =
Corrimiento de = f (Io – IT) =

Stokes = f Io (1– IT/Io) =
= f Io (1 – e-2.303ebC) =
l
IF = f Io (1 – e-kbC)
Análisis cuantitativo Análisis cuantitativo

IF vs C (a bajas concentraciones de analito)
IF = f Io (1 – e-kbC)
Recordando que: F
e-x = 1 - x +x2- x3
1! 2! 3!
si x es muy pequeño: e-x = 1-x IF = KC
IF = f Io (1– 1 + kbC) = fIo kbC IF = KC C

K

Obtención de espectros de excitación

Espectrofluorímetro
y emisión
monocromador F
EXCITACIÓN EMISIÓN
fuente M
atenuador
del haz monocromador l
1) Obtención del espectro de absorbancia para
fotomultiplicador determinar la longitud de onda de absorción
de muestra 2) Fijar el monocromador de excitación a esta l y
fotomultiplicador
de referencia amplificador obtener el espectro de emisión
3) Fijar el monocromador de emisión a la l
dispositivo de lectura
seleccionada en el punto 2 y obtener el espectro
de excitación.
Causas de desvío de la linealidad Filtro interno

IF = f Io (1 – e-kbC) Afecta la linealidad de la curva de calibrado y el
perfil de los espectros de excitación y/o emisión
Si kbC es grande (absorbancia > 0.02)
Producido por el propio analito (alta concentración)
(kbc)2 (kbc)3 ...
IF = f Io [kbc – - ] - Variación de potencia de luz incidente en el trayecto
2 + 6 - Autoapatallamiento
F - Autoabsorción
Término lineal
Lineal+cuadrático+cúbico Producido por otra sustancia
Lineal+cuadrático
- Sustancia que absorbe en la región de l de
excitación o emisión del analito
C
Curva de calibración de sulfato de

Filtro interno
quinina
Baja concentración:
emisión uniforme Excitación F
F
Detección de
la emisión
Alta concentración: la
emisión disminuye en el Excitación ppm
0 2 4 6 8 10 ppm
trayecto de la luz incidente 100 200 300
Linealidad
Filtro interno
Término cúbico o
Detección de la
emisión mayor

lex = 350, lem = 450 nm

6
7.0
Ajuste linear, y=b*x + a

[Quinina] Fluorescencia 6.5
Y = 0.01163 * X + 0.0150002
5 (ppb) 6.0 Coeficiente de la determinación r^2 = 0.9977
5.5
100 1.19
INTENSIDAD (nm)
5.0
4 TONICA 4.5
200 2.38
FLUORESCENCIA
500 ppb 4.0
400 ppb 3.5

3 300 ppb
200 ppb
300 3.49 3.0
100 ppb 2.5
2
400 4.53 2.0
1.5
500 5.93 1.0
1 0.5
tónica 3.77 0.0
0 100 200 300 400 500 600
0 CONCENTRACION (ppb)
375 400 425 450 475 500 525 550 575 600
LONGITUD DE ONDA (nm)


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Espectrofotometría de absorción Transmitancia y Paso Óptico

P0 muestra atravesada 100

%Transmitancia T% = T x 100 doble el paso

Deducción Ley de Lambert-Beer

frecuencia n atraviesa una muestra de una I0 I

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La absorbancia es un parámetro adimensional en escala

Unidades típicas L·mol-1·cm-1s-1

Absorción y Ley de Lambert-Beer

l Si incide luz monocromática

Absorción y Ley de Beer Análisis de mezclas multicomponentes

Al1 = CM aM' l1 + CN aN' l1

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Instrumentación Espectrofotómetro UV-VIS

Fuentes de radiación Lámpara de W-halógeno

l Suficiente energía radiante en toda la

l Intensidad constante durante el intervalo Ventanas de cuarzo

Lámpara de W-halógeno Lámpara de deuterio

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Lámpara de deuterio Otras lámparas: Xenón

200 300 400 500 600 700 800 nm

Selección de longitudes de onda Selección de longitudes de onda

l El selector restringe el rango de longitudes El ancho de banda efectivo es el rango de

l Cuanto menor el rango, mayor adherencia a

l Cada selector tiene un ancho de banda l0

Ancho de media banda

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1nm 2nm Parámetro que exigen

Efecto del ancho de ranura Luz espuria

Luz espuria Luz espuria

Cuanto menor la transmitancia T , mayor el efecto

P1 + PS P1 + PS 0,1 + 0,01 0,11

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Luz espuria Luz espuria

Luz espuria Selección de longitudes de onda

l Cómo disminuir la luz espuria: l Filtros

l Utilización de fuentes LED

Filtros de absorción Filtros de interferencia

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Filtros de interferencia Monocromadores

Monocromadores Refracción a través del Prisma

l Elementos de reflexión y enfoque

Refracción a través del Prisma Red de difracción