DILUCIONES Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS

RESUMEN

Durante este laboratorio se busca crear una opción alternativa para el conteo de colonias
de bacterias en cultivos microbianos realizando un conteo mediante un conteo al ojo. . Los
primeros trabajos en Microbiología se hicieron en unas condiciones experimentales que no
permitían tener la certeza de que se hubieran obtenido cultivos puros. Más adelante, los
microbiólogos observaron que, aparentemente, los microorganismos tenían una gran
capacidad de variación en cuanto a su aspecto morfológico y características fisiológicas.
Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismo. En la práctica los
cultivos puros son útiles por diferentes razones: mantienen los organismos viables, permiten
hacer subcultivos para someterlos a diferentes análisis. Para obtener lo anterior es
necesario recurrir a las técnicas de recuento. Existen métodos que permiten establecer el
número de microorganismos en una muestra dada. Hay métodos que cuantifican el número
de células, y existen otros que cuantifican la masa total de la población.

Palabras claves: bacterias, cultivo, agar, nutrientes, conteo.

INTRODUCCION previamente esterilizados. Los recipientes

Un medio de cultivo es un conjunto de
nutrientes, factores de crecimiento y otros
componentes que crean las condiciones
necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. La diversidad
metabólica de los microorganismos es
muy amplia; por ello, la variedad de
medios de cultivo es también muy grande,
no existiendo un medio de cultivo
universal adecuado para todos ellos. Los
microorganismos son seres ubicuos que
han colonizado todos los tipos de
ecosistemas: el agua, el suelo, el aire, el
resto de organismos. Por ello todas las
manipulaciones para conseguir cultivos
puros se deben realizar en un ambiente
estéril que impida el acceso al medio de
otros microorganismos diferentes a los
que deseamos aislar. Se deben crecer
dentro de recipientes y medios de cultivo
más utilizados en el crecimiento de
microorganismos son los tubos de
ensayo, los matraces (ambos para los
medios líquidos) y las placas de Petri
(para los cultivos sólidos).
El crecimiento de una población
bacteriana puede ser entendido desde
diferentes perspectivas y de acuerdo a
éstas se puede llegar a determinar la
medida del crecimiento mediante diversas
metodologías. Para algunos, el
crecimiento es la capacidad para
multiplicarse que tienen las células
individuales, esto es iniciar y completar
una división celular. De esta forma, se
considera a los microorganismos como
partículas discretas y el crecimiento es
entendido como un aumento en el número
total de partículas bacterianas. Para otros,
el crecimiento implica el aumento de los

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microorganismos capaces de formar
colonias debido a que sólo se tiene en
cuenta el número de microorganismos
viables, esto es capaces de crecer
indefinidamente. Para los fisiólogos
bacterianos, bioquímicos y biólogos
moleculares una medida del crecimiento
es el incremento de biomasa. Para ellos,
la síntesis macromolecular y un
incremento en la capacidad para la
síntesis de los componentes celulares es
una medida del crecimiento. Para este
grupo la división celular es un proceso
esencial pero menor que rara vez limita el
crecimiento, ya que lo que limita el
crecimiento es la capacidad del sistema
enzimático para utilizar los recursos del
medio y formar biomasa.
El recuento en placa es uno de los
métodos más utilizados para determinar
cuál es el número de microorganismos
viables en un medio líquido. Cuando la
concentración es baja se procede a filtrar
la muestra a través de una membrana que
será pasada al medio de cultivo, en una
placa de Petri. Los microorganismos
retenidos en la membrana se
desarrollarán formando colonias,
permitiendo su cuantificación. Cuando la
concentración es alta, se procede a la
preparación de diluciones seriadas en una
secuencia de 1:10, alcanzándose
diluciones de 10-7 o mayores. Pequeñas
alícuotas de esas diluciones son
sembradas en medio nutritivo en placa,
donde las bacterias se desarrollan
formando colonias. En las placas donde la
concentración de la alícuota sembrada es
muy alta, las bacterias formarán
crecimiento masivo, pero si la
concentración es muy baja, el número de
UFC podrá ser muy bajo. Entre los dos
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extremos de las diluciones, alguna de las
placas contendrá un número de colonias
entre 30 y 300, permitiendo la
cuantificación.
MATERIALES Y REACTIVOS
Los materiales utilizados durante este
laboratorio no son los descritos en la guía
de laboratorio debido a la situación de
contingencia por el COVID-19, por ende,
se adoptaron materiales de fácil acceso
para cada estudiante.
• Muestra de agua contaminada
• Muestra de suelo
• Gasa
• 5 jeringas de 1ml estériles
• 1 jeringas de 10ml estéril
• 6 frascos de muestra de orina
• Mechero de alcohol
• 4 cajas de Petri
• 100ml de agar nutritivo
• Frasco con tapa y con 99ml de
agua destilada
METODOLOGÍA
Inicialmente se repasaron algunos
conceptos encontrados en la guía de
laboratorio con el objetivo de entender
todo lo que se iba a trabajar durante la
práctica.
Antes de iniciar con la preparación de los
medios de cultivo se desinfecto
correctamente nuestra área de trabajo se
esterilizo cada uno de los elementos a
2
utilizar, además se preparó el mechero de
alcohol el cual debe mantener encendido
durante toda la preparación y por último el
uso de los elementos de protección
personal.
Antes de iniciar se debe rotular los frascos
de orina con el nombre de lo que contiene
(muestra de agua contaminada con agua
esterilizada), fecha y nombre del
responsable. Para la muestra de agua se
utilizan 3 frascos de muestra de orina
(10⁻¹, 10⁻², 10⁻³).
Inicialmente se toma 1ml de muestra de
agua contaminada con una pipeta
(jeringas) y se agrega al frasco de orina
10⁻¹ que debe contener 9ml de agua
destilada, del frasco de 10⁻¹ tomamos con
una nueva jeringa 1ml de muestra y lo
llevamos al frasco de 10⁻², repetimos el
proceso para el frasco de 10⁻³ recordando
que en cada traspaso se debe utilizar una
pipeta distinta con el fin de evitar llevar
contaminaciones de un frasco para el
otro. Lo siguiente es agitar los frascos
(10⁻¹ está más diluida y más
concentrada).
Se procede a realizar la siembra, se va a
utilizar dos cajas de Petri, es decir, se
realizarán dos siembras con el agua
contaminada una profundidad y una en
superficie. Del frasco que contiene 10⁻³ se
toma 1ml y se dispone en la caja de Petri
que debe estar vacía y después se
agregan 25ml de agar nutritivo (muestra
en profundidad). Para la siguiente
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siembra la cual es de superficie primero
tomamos el agar nutritivo y lo agregamos
a la caja de Petri y dejamos que se
solidifique, después se capta 1ml de
muestra del frasco de 10⁻³ para anexar a
la siembra y con ayuda de un isopo
esparcimos por toda la caja.
Para la muestra de suelo se toma 1 gramo
muestra de suelo y lo adicionamos al
frasco que contiene 99ml (Erlenmeyer) y
tomamos 1ml y lo llevamos al frasco de
orina 10⁻¹, desde aquí se repite el proceso
de traspaso de un frasco al otro y de igual
forma para la siembra, se realiza una a
profundidad y otra en superficie, el
proceso se realiza de igual forma. (rotular
cajas de Petri)
RESULTADOS Y ANÁLSIS
Se evaluaron algunos de los métodos
más utilizados para el recuento de
microorganismos determinando así las
ventajas y desventajas de cada uno.
Aunque existan muchos tipos de recuento
de células, algunos mejores que otros, la
gran mayoría siempre tendrá
desventajas. Unas de las desventajas del
recuento por el método de siembra en
profundidad y en superficie son: el tiempo
prolongado que se necesita para la
preparación de los medios. En un balance
general se puede decir que dependiendo
del tipo de microorganismo que se vaya a
cultivar, se debe investigar acerca de cuál
método presenta mejores características
3
para un recuento sin tanto margen de
error, que sea de manera mas fácil.

BIBLIOGRAFÍA

Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992.

Microbiología. Manual de Métodos
Generales (2da edición). Facultad de
Farmacia. Universidad Central de
Venezuela.

Difco y BBL. 2003. Manual de Medios de

Cultivo Microbiológicos. Ilustración 2. Traspaso de muestra de agua contaminada
de un frasco al otro
Merck. 2002. Microbiology Manual

Guía de laboratorio de Microbiología,

universidad de Pamplona.

ANEXOS

Ilustración 3. Sembrado en profundidad

Ilustración 1. Frascos de orina rotulados y con 9ml de

agua destilada

Ilustración 4. Aparición de colonias

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