FEMM2018 ExtensionTecnica Metodologia ProyectoDelfines ElMorro FEMM

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Estudio de Ecología Poblacional, Contaminantes Orgánicos

Persistentes, Mercurio y Enfermedades del Bufeo costero (Tursiops
truncatus) en el Refugio de Vida Silvestre Manglares el Morro, Golfo
de Guayaquil
Ampliación de La Información Técnica y Aplicación de la Metodología
Fundación Ecuatoriana para el Estudio de Mamíferos Marinos (FEMM)
Investigadores Principales
Patricia Fair, Ph.D.
Juan José Alava, Ph.D
Pedro J. Jiménez, Biol.
Colaboradores Nacionales:
Paola Calle, Ph.D.
Ana Tirape, Ph.D.
Colaboradores Internacionales:
Windsor Aguirre, PhD
George Biedenbach, Biol.
Marco Teórico y Razonamiento
Los delfines nariz de botella o bufeos (Tursiops truncatus) que habitan el Refugio de Vida Silvestre
Manglares El Morro (REVISEM) están sujetos a diversas amenazas antropogénicas que afectan a
esta población. Los estudios de foto-identificación desde el 2005 y las estimaciones de tamaño de
la población indican un decrecimiento gradual en la población de bufeos (Jiménez y Álava, 2014).
Las causas de esta disminución no están lo suficientemente evaluadas, pero factores
antropogénicos tales como la degradación del hábitat natural, las actividades humanas ligadas a la
observación ilegal de delfines, el tráfico marítimo, las capturas incidentales asociadas con la pesca
artesanal y la contaminación ambiental pueden incidir en este declive (Jiménez y Álava, 2014).
Jiménez y Álava (2014) brindaron recomendaciones para emprender nuevas líneas de
investigación y mejorar la conservación de esta especie. Por esta razón la REVISEM ofrece un
área de estudio y las condiciones para analizar contaminantes orgánicos persistentes (COPs) y
mercurio y enfermedades en los delfines y así evaluar el impacto antropogénico en el ecosistema
y hábitat de los delfines de esta área protegida.
Oficina Principal: Urdesa Norte. Pasaje A entre calle 3era y 4ta, Guayaquil - Ecuador.
Oficina Sucursal: Cdla. Narcisa de Jesús, F Sarmiento s/n y Luis Rosales, Santa Elena - Ecuador
Celular: (593) (0) 969062257 Celular Moví / Wasapp: (593) (0) 999892591
FB: FEMM Ecuador Email: femmecuador@gmail.com
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Bajo esta premisa los delfines nariz de botella como depredador tope, sirven y funciona como
especie centinela para monitorear la salud del ambiente marino-costero ya que pueden
proporcionar información valiosa para evaluar la relación entre la exposición a agentes biológicos
y químicos y los efectos adversos para la salud de estas poblaciones (Bossart 2011). El desarrollo
de esta investigación es de vital importancia ya que el bufeo costero está considerado como una
especie "Vulnerable (VU)" de acuerdo la el Libro Rojo de los Mamíferos del Ecuador (Jiménez et
al., 2011). En este contexto, la principal meta de este proyecto será caracterizar la contaminación
química y biológica, ya que es uno de los principales vacíos de investigación identificados para la
conservación de las poblaciones de bufeos en Ecuador.
Estudios de Foto identificación y Estimación Poblacional
Para la ejecución de este proyecto se harán estudios de foto-identificación de aletas dorsales

individuales a cargo del Bio. Pedro Jiménez y miembros de FEMM capacitados para tal actividad.
Estas actividades están basadas en la metodología de estudios anteriores realizados por Jiménez y
Álava 2014 y se usará el software Darwin. La búsqueda de los delfines se hará utilizando
binoculares Bushnell 10 x 42 mm y 10 x 50 mm. Una vez avistados los delfines se realizan
actividades de foto identificación con ayuda de cámaras profesionales Canon t5 i y 70 D con lentes
18-55mm, 55-250 mm y 100-400mm. Se documentará y se dará especial énfasis en foto identificar
a los animales que serán biopsiados para garantizar la no duplicación de muestras.
Durante este proceso se llenará un registro de datos biológicos y oceanográficos, y además
se tomarán entre otras cosas, datos de temperatura y salinidad con ayuda de un multi-parámetro
YSI -EC300A y se georreferenciara cada avistamiento con el apoyo de un GPS Garmin Oregón
300. Además, se estimará el tamaño de grupos y comportamiento general, entre otros. Con los
datos obtenidos, se harán estudios de estimación poblacional actualizados con métodos estadísticos
fundamentados en método de Petersen aplicables a poblaciones cerradas.
Toma de muestras en el campo y manipulación de las muestras
El trabajo propuesto involucrará la recolección de 25 muestras de biopsias con dardos que serán
tomados de tejido grasoso de los delfines. Los delfines serán buscados de manera pasiva en áreas
de alimentación conocidas, las cuales están congregadas en los esteros y ramales del Refugio de
Vida Silvestre Manglares El Morro (REVISEM) y zonas circundantes del Canal del Morro. Para
llevar a cabo los recorridos se contará con la vasta experiencia de investigadores y voluntarios de
FEMM con casi dos décadas de trabajos observando los delfines y con estudios de ecología
poblacional en el canal del Morro y la (REVISEM) (Jiménez y Alava 2014). También se contará
con un motorista con experiencia en manejo del bote para este tipo de estudios de la comunidad
pesquera de Posorja.
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La metodología de campo a utilizar en nuestro proyecto es basada en los métodos de muestreo de

toma de biopsias que no representan peligro a los delfines y no afectarán a la población ya que son
métodos basados en estudios y técnicas validadas de campo llevados a cabo con bastante éxito en
la costa sureste de USA por muchos años y comúnmente usado en todo el mundo en poblaciones
pequeñas de cetáceos y similares a los delfines bufeos del El Morro (por ejemplo ver Barrett‐
Lennard et al., 1996; Krützen et al. 2002; Fair et al., 2003; Parsons et al., 2003; Jefferson y Hung
2008; Tezanos-Pinto y Baker, 2012; Fruet et al 2016). Cabe indicar que en las salidas de campos
participará personal técnico del MAE como invitados a los muestreos.
A continuación, detallamos los criterios para la búsqueda y acercamiento a los delfines y

decisiones técnicas antes de la toma de muestras de biopsias en delfines.
1. Ubicación de los delfines apropiados para muestrear
 A una distancia (> 50 metros), se observará los delfines (es decir, patrones / tasas de
superficie, tamaño del grupo, composición del grupo).
 Si los animales parecen "viables" para el muestreo, el bote se acercará para verlos. La
definición de animales viables para muestrear depende de los objetivos de la
investigación y el tipo de biopsia con dardos a tomar (ver punto 2).
 Si los animales son óptimos y trabajables para muestrear desde la distancia apropiada (4-
6 metros es generalmente la distancia para tomar muestras de biopsias con dardos),
entonces observar y verificar que el tamaño del grupo sea <5 delfines y que estén
moviéndose o nadando de manera lenta, y observar que las respiraciones sean repetidas
(> 3), y sin crías.
 No se intentará muestrear ningún animal sin haber inspeccionado inicialmente todo el
grupo de delfines.
2. Determinación de delfín o delfines apropiados (viables y óptimos) para muestrear
 Se muestrea animales adultos (cuando están solos y separados del grupo) a 4-6 metros.
 Se muestrea adultos y subadultos (cuando están en grupo) a una distancia de 4-6 metros.
La vista es 100% precisa a estas distancias.
 No se muestreará cualquier animal (crías/juveniles) de menos de 2 años (basado en el
tamaño del delfín y la dependencia materna, lo cual es evaluado en el campo por el
experto entrenado que usa la ballesta) a cualquier distancia.
 No se muestreará cualquier subadulto y cría a menos de 2 metros.
 No se muestreará a las madres de animales menores de 2 años.
 No se muestreará crías/juveniles bajo ninguna circunstancia.
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 No se muestreará animales con características de salud aparentemente comprometidas

(p. ej. cualquier tipo de deformidad, lesiones abiertas, signos de enfermedad)
A continuación, se especifica y explica paso a paso el procedimiento de la técnicas y lineamientos

para la tome de muestras de biopsias en delfines.
1. Las muestras de biopsia de dardo serán tomadas con un sistema de ballestas (Ballesta
Barnett, BCR Recurve Crossbow; ver Figura 1) equipada con un larga vistas BSA
Huntsman de 30mm (BSA Huntsman 30mm RGB dot sight) para observar los delfines
vivos y equipados con dardos de biopsias especiales (~ 1.5 cm) para tomar la muestra. Este
equipo será solamente utilizado por un biólogo con alta experiencia (Biol. George
Biedenbach del Georgia Aquarium, Georgia, USA) entrenado en la toma y recolección de
muestras de biopsias por el Departamento Nacional de Pesquerías Marinas (US National
Marine Fisheries) de los Estados Unidos de acuerdo con los protocolos de biopsia de
dardos. El Biol. George H. Biedenbach del Georgia cuenta con autorización y certificación
de salud animal y ha otorgado cursos para colección de muestras de Nivel A (collection of
Level A) en biopsias de dardos con ballestas en delfines y cetáceos en áreas remotas y
Nivel B (Level B) para obtención de datos de foto-identificación como señalado a
continuación:
 NOAA Permit, August 2016: As Co-Investigator authorized for conducting and

supervising Level A (remote crossbow Barnett BCR Recurve Crossbow) dolphin biopsy
sampling.
 Atlantic bottlenose dolphin dart biopsy training Sarasota, Augustine, and Melbourne
Florida – three separate weeks in 2015NOAA/NMMF Atlantic bottlenose dolphin health
assessments, Barataria Bay, LA, 2016 & 2017.
 NOS Atlantic bottlenose dolphin dart biopsy, Jacksonville, FL, Assistant, Sep 2013.
 Beluga whale Health Assessment, Bristol Bay, AK, Field researcher and vessel operator,
2012 & 2016.
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Figura 1. Ballesta Barnett (BCR Recurve Crossbow) usada para muestreo inofensivo de biopsias
de grasa. La ballesta será únicamente usada por el Biol. George H. Biedenbach (Georgia
Aquarium y Mariland, Georgia, USA), quien cuenta con autorización y certificación de salud
animal con Nivel A (collection of Level A). Longitud de la ballesta y peso = 32.5 "/ 4.9 lbs. La
ballesta Barnett BCR libera los dardos a 245 FPS (pies/libra por segundo) con 54 pies/libras de
energía cinética (=24 kg). Esto lo convierte en una ballesta muy ligera. Los dardos de biopsia se
fabrican a medida por Ceta-Dart usando un eje de pernos de ballesta compuesto de aluminio /
carbono Easton 3-71 / 300 equipado con puntas de corte M-11 de acero inoxidable extraíbles y
reutilizables (11 mm = 1.1 cm de diámetro). Nota: FPS = pie/libra/segundo o sistema FPS es un
sistema de unidades construidas en tres unidades fundamentales: el pie para la longitud, la libra
para la masa o la fuerza, y el segundo para el tiempo.
2. Una vez detectado los delfines con binoculares o simple vista o larga vista de la ballesta
(BSA Huntsman 30mm RGB dot sight), el bote se acercará despacio a los delfines,
respetando las distancias establecidas y se tomaran las muestras de biopsias del delfín más
cercano (4-6 m).
3. En el campo se colecta una pequeña muestra de biopsia piel y grasa (<1.5 cm
aproximadamente) usando la ballesta Barnett (BCR Recurve Crossbow) con un dardo
basados en la técnica de campo diversos estudios llevados a cabo con bastante éxito en
diferentes partes del mundo (como ejemplo ver Barrett‐ Lennard et al., 1996; Krützen et
6
al. 2002; Fair et al., 2003; Parsons et al., 2003; Jefferson y Hung 2008; Kiszka et al., 2010;
Tezanos-Pinto y Baker, 2012).
4. El dardo es liberado desde la ballesta hacia el costado del delfín colectando una muy
pequeña muestra de tejido epidérmico y grasoso conocido en inglés como blubber (~1.5cm)
mientras el dardo rebota desde el costado del delfín. El dardo es recuperado del agua y la
muestra es removida en el bote. Esta técnica es comúnmente usada alrededor del mundo
para colectar muestras de tejidos de muchos animales de ambientes acuáticos/marinos
incluyendo cetáceos (Barrett‐ Lennard et al., 1996; Krützen et al. 2002; Fair et al., 2003;
Parsons et al., 2003; Jefferson y Hung 2008; Kiszka et al., 2010; Tezanos-Pinto y Baker,
2012).
5. Una vez recuperada la biopsia con la muestra de tejidos (piel y grasa), la piel se separa de
la grasa para análisis de mercurio (2/3 de muestra de piel) y genética y enfermedades de la
piel (1/3 de la muestra de piel) y toda la grasa se usa para análisis de COPs (ver
procesamiento de biopsia in situ en la Figura 2).
6. Estudios previos muestran que las biopsias con dardo en delfines solo causan reacciones a
corto plazo en delfines y no hay evidencia de impactos a largo plazo sobre el
comportamiento, organización social o patrones de distribución, ni respuestas evasivas a
largo plazo (Barrett‐ Lennard et al., 1996; Krützen et al. 2002; Kiszka et al., 2010;
Tezanos-Pinto y Baker, 2012).
7. Por lo tanto, existen solo reacciones menores a corto plazo a los delfines y los animales
retomaran sus actividades normales después de la biopsia con dardos (Barrett‐ Lennard et
al., 1996; Krützen et al. 2002; Kiszka et al., 2010; Tezanos-Pinto y Baker, 2012).
8. La colecta de muestras de biopsias con dardos y ballestas tiene un éxitos de entre el 96.6
and 100% (Krützen et al. 2002).
9. La curación y cicatrización del sitio de toma de biopsias con dardos está confirmado que
ocurren en aproximadamente entre 18 y <23-35 días (Krützen et al. 2002; Jefferson y Hung
2008; Fruet et al., 2016).
10. Después de obtener las muestras de los delfines vivos, las mismas serán recolectadas y
preservadas en un contenedor portátil con hielo seco (-20°C) y serán transportados luego
al congelador de -80°C al Laboratorio de Investigaciones Toxicológicas y Salud Ambiental
de la ESPOL en donde las muestras de piel serán analizadas para mercurio total (THg) y
las muestras de grasa será transporta al exterior para y los análisis de Contaminantes
Orgánicos Persistentes (USA). Se tomarán fotografías de cada animal biopsiado y se
emparejarán con delfines del catálogo de foto-identificación de estos animales archivado
por la FEMM (Jiménez y Alava, 2014).
11. Se describe como ejemplo uno de los últimos estudios (Fruet et al., 2016
http://dx.doi.org/10.5597/lajam00221) llevados a cabo en Brasil en donde se utiliza esta
técnica de campo, la cual es muy similar a la que se llevará a cabo con los delfines de la
REVISEM. Esta técnica es altamente efectiva y no dañina para muestrear biopsias con
dardos en delfines nariz de botella (Tursiops truncatus). A continuación, se detalla un
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resumen técnico del estudio por Fruet et al. (2016) en comparación a nuestra metodología
de campo: En el Estudio de Fruet et al. (2016) se investigaron y se colectaron biopsias con
dardos en una población pequeña de 85 delfines comunes nariz de botella (Tursiops
truncatus) en el Estuario de la laguna de Pato en el sur de Brasil. Este estudio tiene
similitudes muy cercanas a nuestro estudio con respecto al sitio de estudio, el número de
animales de la población de delfines y la metodología. Fruet et al. (2016) afirman que "el
muestreo de biopsia de cetáceos es una técnica ampliamente utilizada con un valor
científico indiscutible y generalmente se considera una técnica inofensiva sin efectos
aparentes de larga duración". El estudio se centró en la evaluación de las reacciones de
comportamiento individuales y la curación del sitio de la toma de biopsia de los delfines
comunes nariz de botella. En este sentido, Fruet et al. (2016) examinaron y compararon las
reacciones del comportamiento de pequeños definidos al muestreo de biopsias realizadas
en todo el mundo. En general, a partir de estos estudios ellos concluyeron que este muestreo
remoto de biopsias es una técnica ampliamente reconocida para obtener tejidos de piel y
grasa de cetáceos y los efectos de muestreo en los animales son mínimos, de corta duración
y similares entre especies independientemente del tamaño del cuerpo y del grupo (por
ejemplo, los delfines y grupos más pequeños no parecen ser más reactivos que los más
grandes, Kiszka et al., 2010).
Conclusión: "En conclusión, los resultados presentados en el estudio de Fruet et al. (2016)
mostraron que las reacciones de los delfines nariz de botella al muestreo de biopsias
fueron en su mayoría de bajo nivel y corto plazo independientemente del sexo, la distancia
objetivo, el comportamiento pre-biopsia y el tamaño del grupo. El muestreo de biopsias de
la población de delfines nariz de botella utilizando una ballesta es por lo tanto viable y no
cause ningún efecto a largo plazo en el comportamiento de los delfines".
12. Finalmente, Fruet et al. (2016) sugieren que la biopsia debe ser realizada solo por personal
entrenado, como es en nuestro caso ya que el muestreo de biopsias será solamente llevada
cabo por el Biol. George Biedenbach, quien está altamente certificado y entrenado para
este tipo de muestreo y también señalan que la potencia de las ballestas no debe exceder
los 68 kg, lo cual en nuestro caso es mucho más baja (24 kg) o tres veces menor (ver
leyenda sobre la Ballesta Barnett BCR Recurve Crossbow en la Figura 1).
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Figura 2. Ilustración del procesamiento de la muestra de biopsia del delfines in situ durante el muestreo
de campo en la REVISMEN Grasa (Blubber): Contaminantes Orgánicos Persistentes-COPs (Análisis a
cargo del Dr. Keith Maruya): se poner toda la grasa en vial de teflón (guardar en hielo seco y luego a -
80°C). Piel (skin): Genética: Análisis a cargo del Dr. Windsor Aguirre, Biol. Pedro Jiménez (se usará 1/3
de submuestra de piel in 2ml cryovial (guardar en hielo seco); Mercurio total (THg): Análisis a cargo de
la Dra. Paola Calle, Dra. Ana Tirape, Dr. Juan José Alava (se usará 2/3 de submuestra de piel en 2ml
cryovial (guardar en hielo seco).
Protocolos de seguridad durante el muestreo de biopsia en el campo
El protocolo de seguridad en el campo contempla los siguientes criterios, los mismos que son
considerados durante el muestreo basado en Wenzel et al. (2010):
• Biopsia: Se toman precauciones para minimizar los impactos a los delfines y asegurar la
seguridad de la tripulación y los barcos y las personas de los alrededores. Hacemos énfasis en la
atención constante a los detalles y la vigilancia en asuntos de seguridad con los siguientes
lineamientos:
 Es necesario un acercamiento de aproximadamente de 4-6 m para garantizar la
precisión en el muestreo como previamente se ha indicado.
 El apoyo y presencia de las autoridades mejorará la seguridad para el trabajo de campo
durante la biopsia de dardos.
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 El control de la multitud mantendrá la seguridad de botes circundantes cuando usemos

la ballesta conservando un perímetro mínimo de seguridad de 100 metros, que nos
permitirá realizar este trabajo. Para esto se contará con el apoyo de la marina o
Capitanía del Puerto para mantener el perímetro de seguridad de 100 metros (ver
diagrama en Figura 3).
Figura 3. Ilustración de las zonas y radios de muestreo y distancias de uso de ballesta

Barnett (BCR Recurve Crossbow) para disparo de dardos y zona y perímetro de
seguridad para control de multitud (botes turísticos). El área sombreada/rayada en el
centro señala la zona potencial de muestreo de biopsias con dardos. Diagrama adaptado al
español de diseño original creado por: Biol. George Biedenbach.
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Comparación y ventaja sobre otras técnicas
Cabe indicar que existe una técnica de raspado con ballesta y material abrasivo para extraer ADN
de células epidérmicas, pero la misma no es adecuada y no es adecuada para estudiar y tomar
muestras de biopsias de grasa y piel apropiadas para análisis de COPs y mercurio orgánico. Como
indicado en la propuesta original sometida, la piel (epidermis) de las biopsias que se tomarán con
los dardos disparados con la ballesta serán separadas in situ del tejido grasoso, el mismo que es
usado para análisis de COPs y guardadas en viales mientras que la piel se la dividirá en dos partes,
una para el análisis genético de enfermedades y otra para el análisis de mercurio. Un problema
típico con la técnica de raspado con material abrasivo con relación a los estudios genéticos (como
por ejemplo cuando se evalúa la estructura genética de la población), es que el ADN puede no ser
de suficiente calidad y cantidad para llevar a cabo los análisis requeridos (ver Bilgman et al. 2007).
Por lo tanto, se prefiere el muestreo de biopsia con dardos para estudios genéticos moleculares
para obtenerse suficiente cantidad y calidad de muestras (Parsons et al., 2003) y también para
análisis de contaminantes (Fair et al., 2003). Cuando no se obtiene suficiente material o tejido
usando el método de raspado con material abrasivo, esto implica muestrear de nuevo más animales
e inclusivo los mismos animales invirtiendo más tiempo en el campo, energía, dinero y causando
más estrés a los delfines.
Las técnicas de biopsias con dardos suelen dar como resultado muestras con suficiente cantidad y
calidad de ADN para el análisis de marcadores genéticos y secuencias genéticas (Parsons et al.,
2003; Bilgman et al. 2007). Por lo tanto, la metodología descrita en nuestro proyecto es considera
efectiva y asegura una cantidad de tejido apropiado (piel y grasa) (Parsons et al., 2003; Bilgman
et al. 2007), la cual ha sido usada, implementada y es llevada cabo en muchas regiones del mundo
y sustentadas con un número substancial de artículos científicos publicadas en respetables revistas
científicas y arbitradas a nivel internacional como señalados arriba y en las referencias de soporte.
Uso de biopsias de animales vivos versus muestras de animales muertos:
Cabe indicar también que las muestras de grasa de animales muertos o varados no son apropiadas
para análisis de compuestos orgánicos persistentes (COPs) y mercurio orgánico ya que al ser
compuestos orgánicos se degradan en estos tejidos al descomponerse. Por ejemplo, la grasa se
descompone y las proteínas se desnaturalizan en los animales muertos liberando o lixiviando los
COPs y mercurio orgánico, peor aún en estado avanzado de descomposición. Estos son conceptos
básicos de toxicología ambiental y biomonitoreo de muestras para estudios de COPs. La toma de
muestras de animales muertos o varados no reflejan el estado de salud de animales vivos y
saludables (ver contribuciones sobre COPs en muestras de biopsias colectadas de lobos marinos
de Galápagos (Zalophus wollebaekii) y lobos finos/peleteros (Arctocephalus galapagoensis) vivos
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en las Islas Galápagos (por ejemplo ver contribuciones Alava et al., 2009; Alava et al. 2011a;
Alava 2011b; Alava and Gobas 2012; Alava et al. 2017). En estos estudios se tomaron muestras
de biopsias de grasa con un punche quirúrgico directamente de los animales vivos restringido
físicamente por los investigadores de campo con una red modificada para este caso con la
asistencia técnica del personal y guarda parques de Parque Nacional Galápagos en el 2008 (Alava
et al., 2009; Alava et al. 2011a; Alava 2011b; Alava et al. 2017). Cabe indicar que los estudios
eco-toxicológicos llevados a cabo por el Dr. Juan José Alava, científico ecuatoriano radicado en
Canadá, y miembro de la Academia de Ciencia del Ecuador (ACE), así como uno de los
investigadores principales de esta propuesta, contribuyeron y ayudaron a comprender y mejoraron
nuestro conocimiento sobre los niveles de COPs en esta área marina protegida y sobre todo que
las Islas Galápagos no son inmune a la contaminación por COPs ya sea local por su uso en el
pasado (i.e. la aplicación de DDT por la Armada/NAVY de USA durante mediados de los años
1940s para tratar de eliminar ratas en las islas) o regional a través del transporte atmosférico de
largo rango desde el continente (ver Alava et la 2011a, Alava et al., 2011b).
Análisis de Contaminantes Orgánicos Persistentes (COPs)

Los análisis de COPs en las muestras de grasa (separada en el campo y guardas en vial de teflón)
de delfines serán llevados a cabo en el laboratorio de contaminantes orgánicos trazas en al
laboratorio de la Autoridad del Proyecto de Investigación del Agua Costera del Sur de California
(Southern California Coastal Water Research Project Authority, SCCWRP). El control de calidad
incluirá el análisis de materiales estándares de referencia (SRM, NIST), tejidos de control, blancos
(disolventes) y duplicados. El SCCWRP desarrolla y estandariza los métodos para el análisis
ambiental, y utiliza instrumentos de vanguardia para la determinación de los niveles de
contaminantes ultra-rastreo. Este laboratorio está a cargo del Dr. Keith Maruya. El Dr. Maruya y
su equipo han publicado más de 150 manuscritos revisados y estarán disponibles para ayudar con
la preparación del manuscrito para este esfuerzo.
La Autoridad del Proyecto de Investigación del Agua Costera del Sur de California (SCCWRP) es
conocida mundialmente por su trabajo sobre contaminantes orgánicos trazas en los ecosistemas
costeros y marinos desde su creación en 1969. El uso y certificación de este laboratorio es bien
reconocido y está bien establecido por lo que proporcionará datos de alta calidad y permitirá la
comparación datos con otras poblaciones de delfines y mamíferos marinos publicados en todo el
mundo. El SCCWRP organiza rutinariamente y participa en los ejercicios de inter-calibración y
comparación entre laboratorios y en los programas de pruebas de proficiencia para asegurar la
comparabilidad generalizada de los datos analíticos. El SCCWRP desarrolla y estandariza los
métodos para el análisis ambiental, y utiliza instrumentos de vanguardia para la determinación de
12
los niveles de contaminantes ultra-rastreo con Cromatografía de Gas Doble y Espectrómetro de

Masas de Alta Resolución (Pegasus 4D GC×GC/TOF-MS; LECO) con capacidad de detectar
niveles muy pequeños que comúnmente no son reportados por la mayoría de los laboratorios
comerciales.
Los COPs que se analizarán se listan a continuación:

1) Policlorobifenilos o policlorados bifenilos (PCBs), dicloro difenil tricloroetano (DDTs),
éteres de difenilo polibromados (PBDEs), pesticidas organoclorados (OCPs) y compuestos
perfluorados (PFCs) en muestras de biopsias de grasa colectadas de delfines vivos.
Es importante indicar que los métodos analíticos para COPs usados por El Dr. Maruya están
publicados en diversas manuscritos científicos y siguen la metodología descrita para análisis de
COP en delfines nariz de botella (Tursiops truncatus) (como ejemplo ver Pulster et al., 2005;
Pulster y Maruya 2008; Shaul et al., 2015; Alonso et al., 2017) Por ejemplo, el estudio más reciente
es la publicación sobre COPs en delfines nariz de botella en Brasil (Alonso et al., 2017), en la cual
el Dr. Maruya asesoró y analizó los COPs.
Análisis de Mercurio Total.

Para el estudio de mercurio se analizará 2/3 (~67%) de las muestras de piel (epidermis y dermis)
de las biopsias, lo cual dependerá de la cantidad de muestra de tejido obtenida de biopsia de grasa
del dardo para de esta manera garantizar la obtención de al menos 0.2g o 0.5 g de muestra de piel
para análisis de mercurio total de acuerdo a la metodología descrita por Stavros et al. (2007; 2008).
La separación de la piel de la muestra de grasa se realizará directamente in situ en el campo después
de la recolección del dardo y serán preservadas en un cryovial y guardadas en hielo seco en un
termo cooler (-20°C) hasta ser trasladadas al laboratorio en donde se la colocará en un congelador
a -80°C. La otra porción remanente (1/3 o 33%) será colocada también en un vial (cryovial), y
después guardada en el cooler con hielos seco hasta que sea trasladado en laboratorio en donde se
lo trasladará en un contenedor de nitrógenos líquido y hasta realizar los estudios moleculares para
enfermedades y genética poblacional (ver siguiente sección).
El análisis de mercurio total se realizará en un Analizador Directo de Mercurio (DMA-80)

disponible en el Laboratorio de Investigaciones Toxicológicas y Salud Ambiental de la Facultad
de Ciencias de la Vida (FCV) de la Escuela Superior Politécnica del Litoral (ESPOL). En el
análisis se incluirá blancos de procedimientos y material certificado de referencia (SRM-1646a,
NIST), los cuales serán analizados en conjunto con las muestras de piel, como parte de los
procedimientos de control de calidad. El laboratorio está a cargo de la Dr. Paola Calle en
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colaboración con la Dra. Ana Tirapé, quienes son parte de los investigadores nacionales de la
propuesta y contraparte académica (ESPOL) en Ecuador.
Metodología para Caracterización de la variabilidad genética poblacional y enfermedades.
Las muestras de piel remanente (1/3 o 33%) separada de la grasa través de equipos de biopsia
adaptados a tal fin (ver Quérouil et al., 2006), serán preservadas en etanol al 96%. La extracción y
purificación de ADN se realizará siguiendo protocolos estandarizados de extracción tales como el
de Fenol-cloroformo (Gemmel y Akiyama 1996). Para cada individuo, se amplificará un
fragmento de una región ADN mitocondrial (ADNmt) (Natoli et al 2004), utilizando iniciadores
cuya secuencia final no exceda los 600 pares y aquellas superiores se emplearán como indicadores
de diversidad haplotípica entre individuos. Posterior a esto la secuenciación se efectuará en
laboratorios especializados en dicha tarea, La alineación de la secuencia se realizará con programas
bioinformáticos (MEGAR 5.0). Relaciones filogenéticas de haplotipos del ADN mitocondrial serán
inferidos a través de la formación de redes de neighbor-joining o median-joining (PAUPR,
NETWORKR). Diferenciación poblacional se estimará de acuerdo a la frecuencia alélica
empleando para ello ARLEQUINR . Diversidad de haplotipos y nucleótidos serán estimados con
el programa DnaSPR. El razonamiento para incluir el estudio genético en este proyecto es
secundario y está incluido porque la metodología que usamos permite colectar tejidos de alta
calidad y cantidad para estudios genéticos. De esta manera, los tejidos podrían usarse
para aumentar los conocimientos de las características genéticas de la población en el futuro, pues
que es probable que se muestree delfines que no han sido muestreados en estudios previos.
La aplicación de pruebas moleculares y secuenciación de genes e identificación de ADN o ARN

se realizarán para identificar patógenos causantes de enfermedades infecciosas tales como hongos
(lobomicosis o lacaziosis/paracoccidioidomicosis) y virus (fibropapilomas, poxvirus) debido a las
lesiones dérmicas externas y granulomatosas que se han observado en ciertos delfines de la
REVISMEM.
En varios países se ha documentado la aparición de enfermedades emergentes que afectan a

Tursiops truncatus, las cuales pueden tener un serio impacto ambiental y de salud (Bossart et al.,
2017, Van Bressem M, et al., 2006). Sin embargo, a pesar de que se han observado lesiones
dérmicas externas y granulomatosas en ciertos delfines de la REVISEM poco se conoce de los
patrones de salud de estos animales o de los agentes etiológicos que las causan. Por lo que es
nuestra intención realizar una línea base de ciertas enfermedades que pueden alertarnos sobre la
salud de los océanos y de esta especie considerada como especie centinela (Bossart, 2006).
14
Por medio de pruebas moleculares y secuenciación de genes e identificación de ADN o ARN se

realizarán la identificación de patógenos causantes de enfermedades infecciosas tales como hongos
(lobomicosis o lacaziosis/paracoccidioidomicosis) y virus (fibropapilomas, herpesvirus). Este
compoente de la investiagcion es importante debido a que existen evidencias científicas entre la
asociación y brotes de enfermedades infecciosas emergentes y el efecto inmunotóxico de ciertos
COPs tales como los PCBs, los cuales provocan la susceptibilidad de mamíferos marinos a
enfermedades debido a la inmunosupresión del sistema inmune ha sido documentado (Ross et al.,
1996; Ross 2000; Ross 2002; Ross and Birnbaum 2003; Bossart, 2006; Bossart et al., 2017).
Debido a que estas pruebas se realizarán con parte de muestras de piel (1/3 de la muestra) se
estudiarán preferentemente enfermedades que estén asociadas a infecciones de la piel como se
indica en la siguiente Tabla 1:
Tabla 1. Enfermedades causadas por patógenos (hongos y virus) encontrados en la piel de
delfines.
Enfermedad Breve descripción Agente Etológico Referencia
Lobomicosis, Infección crónica de Hongos Murdoch et al. (2010)
Lacaziosis o la piel causada por el Bossart et al. (2017)
paracoccidioidomycosis hongo Lacazia loboi, Ramos et al. (2018)
que afecta solo a los
delfines y a humanos.
Verrugas en Piel/ Lesiones Herpesvirus Rehtanz et al. (2012)
Papilomatosis mucocutáneas en piel Papilomavirus Bossart et al. (2015)
y órganos genitales Bossart et al., (2017)
Davison et al., (2017)
Los análisis genéticos y moleculares serán realizados en el laboratorio del Dr. Windsor Aguirre
(The Aguirre Lab, http://condor.depaul.edu/waguirre/) del Departamento de Ciencias Biológicas
de De Paul University en Chicago, USA. El Dr. Windsor Aguirre es también ecuatoriano y es parte
de la propuesta como uno de los investigadores colaborando en este estudio. Los procedimientos
de técnicas de laboratorio y protocolos de análisis moleculares y genéticos estandarizados y
usados en el laboratorio del Dr. Aguirre están disponibles en el siguiente enlace/link:
http://condor.depaul.edu/waguirre/protocols.html
15
Anexo I. Cronograma de Actividades del Proyecto

Fecha Actividades
Marzo-Mayo 2016 Acercamiento y acuerdos entre los partners del proyecto para
realizar colaboración científica internacional y presentar propuesta
de proyecto
Julio 26, 2016 Propuesta de investigación sometida a La Comisión Fullbright
(USA)
Marzo 6, 2017 Propuesta de investigación aprobada por La Comisión Fullbright
(USA)
Octubre 13, 2017 Permiso sometido al Ministerio de Ambiente de Ecuador (MAE)
Diciembre14, 2017 Permiso aprobado por el Ministro de Ambiente de Ecuador (MAE)
Enero-abril 2018 Planificación, gestión, logística y coordinación del Proyecto
Marzo 10, 2018 Presentación y socialización de la información con el MAE
(Responsable del Área Protegida, Refugio Vida Silvestre
Manglares el Morro)
Abril 2018 Talleres de socialización del taller con el sector turístico las
comunidades del Refugio Vida Silvestre Manglares el Morro
Mayo 7 – 21, 2018 Trabajo de campo para la toma de biopsias de delfines en él,
Refugio Vida Silvestre Manglares el Morro)
Mayo 2018-junio Salidas de campo (al menos dos por mes) para monitorear delfines
2019 con estudios de foto identificación y estimación poblacional
Mayo-Junio 2018 Proceso para someter permiso de exportación desde Ecuador y
permiso de importación de muestras
Septiembre 2018- Análisis de las muestras de biopsias para análisis de contaminantes
Junio 2019 orgánicos persistentes (COPs), mercurio y genética
(enfermedades).
Diciembre 2018 Entrega de reporte parcial a la Dirección Provincial de
ambiente/Ministerio de Ambiente
Renovación del permiso de investigación
Agosto 2019 Entrega de reporte final a la Subsecretaria de Gestión Marina
Costera/Ministerio de Ambiente
Agosto- octubre Preparación de reportes técnicos y manuscritos para publicar en
2019 revistas científicas arbitradas
16
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Available from: National Marine Fisheries Service, 166 Water Street, Woods Hole, MA 02543-
1026, or online at http://www.nefsc.noaa.gov/nefsc/publications/

FEMM2018 ExtensionTecnica Metodologia ProyectoDelfines ElMorro FEMM

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1

Estudio de Ecología Poblacional, Contaminantes Orgánicos

Fundación Ecuatoriana para el Estudio de Mamíferos Marinos (FEMM)

Marco Teórico y Razonamiento

Estudios de Foto identificación y Estimación Poblacional

Para la ejecución de este proyecto se harán estudios de foto-identificación de aletas dorsales

Toma de muestras en el campo y manipulación de las muestras

La metodología de campo a utilizar en nuestro proyecto es basada en los métodos de muestreo de

A continuación, detallamos los criterios para la búsqueda y acercamiento a los delfines y

1. Ubicación de los delfines apropiados para muestrear

2. Determinación de delfín o delfines apropiados (viables y óptimos) para muestrear

 No se muestreará animales con características de salud aparentemente comprometidas

A continuación, se especifica y explica paso a paso el procedimiento de la técnicas y lineamientos

 NOAA Permit, August 2016: As Co-Investigator authorized for conducting and

Protocolos de seguridad durante el muestreo de biopsia en el campo

 El control de la multitud mantendrá la seguridad de botes circundantes cuando usemos

Figura 3. Ilustración de las zonas y radios de muestreo y distancias de uso de ballesta

Comparación y ventaja sobre otras técnicas

Uso de biopsias de animales vivos versus muestras de animales muertos:

Análisis de Contaminantes Orgánicos Persistentes (COPs)

los niveles de contaminantes ultra-rastreo con Cromatografía de Gas Doble y Espectrómetro de

Los COPs que se analizarán se listan a continuación:

Análisis de Mercurio Total.

El análisis de mercurio total se realizará en un Analizador Directo de Mercurio (DMA-80)

Metodología para Caracterización de la variabilidad genética poblacional y enfermedades.

La aplicación de pruebas moleculares y secuenciación de genes e identificación de ADN o ARN

En varios países se ha documentado la aparición de enfermedades emergentes que afectan a

Por medio de pruebas moleculares y secuenciación de genes e identificación de ADN o ARN se

Anexo I. Cronograma de Actividades del Proyecto

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