WESTERN BLOT

Western Blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada, para el estudio de proteínas.
Este método, permite la detección de una sola proteína dentro de una muestra biológica. La
especificidad de Western Blot se logra mediante la utilización de un anticuerpo que
reconoce y se une a un epítopo (anticuerpo) único de la proteína de interés.

Con la técnica de Western Blot se puede estimar el tamaño de una proteína, confirmar la
presencia de modificaciones post-traduccionales como la fosforilación, y ser utilizado para
comparar cuantitativamente los niveles de proteína entre muestras.

La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de

estas en un campo eléctrico.​La separación puede realizarse sobre la superficie hidratada de
un soporte sólido, a través de una matriz porosa, o bien en disolución.

La técnica usa tres pasos para llevarla a cabo: La separación de proteínas por peso
molecular en geles de poliacrilamida La transferencia a una membrana o soporte sólido, que
permite su manipulación El marcaje de la proteína blanco utilizando un anticuerpo primario y
un anticuerpo secundario acoplado a una molécula que permite su visualización. NOTA:
puede haber anticuerpos primarios ya acoplados con moléculas que permiten la
visualización de la proteína blanco.

Materiales
● Gel con proteínas cargadas y separadas previamente
● Camara de transferencia semiseca para Western blot Papeles whatman No1 o 2 del
tamaño del gel. NOTA: 6 papeles whatman por cada gel
● Recipientes del tamaño del gel. NOTA: ahí se colocará el buffer de corrida, el
metanol y se pondrán a incubar con los anticuerpos. Se puede usar tubos de 50 mL
● Membrana de PVDF o nitrocelulosa
● Bisturi o tijera
● Fuente de poder Reactivos

Reactivos
● Tris Base
● Glicina
● NaCl
● HCl
● Tween 20
● Albumina Bovina/leche descremada tipo Svelty
● Ácido acético
● Acetato de sodio
● Anticuerpos primarios y secundarios
● N,N-Dimetilformamida ≥98%
● 3-Amino-9-etilcarbazol H2O2

Procedimiento.
A. Preparación de la muestra.

● Este paso consiste en la extracción de las proteínas localizadas en las

muestras biológicas mediante la disrupción mecánica o química.

Disrupción mecánica: proceso químico de lisis celular, mediante el uso de solución

tampón que contiene detergentes, que va dirigida a enriquecer la proteína de interés
dentro del extracto final.

B. Electroforesis en gel de acrilamida.

Las proteínas son separadas en el extracto de acuerdo a su tamaño mediante

electroforesis. Se prepara un gel de acrilamida, bisacrilamida. El dodecilsulfato de
sodio (SDS) añadido al gel se une a las proteínas y confiere, de forma proporcional a
la masa de cada proteína, una carga negativa a cada una de ellas.

● La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la

movilidad de estas en un campo eléctrico.

C. Transferencia electroforética a una membrana.

 Las proteínas son transferidas electroforeticamente a un soporte rígido o membrana,
dónde quedan inmovilizadas.

D. Hibridación del anticuerpo.

La membrana con las proteínas inmovilizadas debe tratarse para bloquear las zonas
con ausencia de proteínas y así evitar la unión no específica de los anticuerpos.
Posteriormente se incuba con un anticuerpo primario dirigido contra el epítopo
específico de la proteína diana. Tras varios lavados de la membrana, se adiciona un
anticuerpo secundario marcado que se unirá de forma específica al anticuerpo
primario, proporcionando una forma de detección.

E. Detección de las bandas.

 Después de un lavado de la membrana para eliminar el anticuerpo no unido, se
procede a detectar la localización de la banda en la membrana. Para la detección de
quimioluminiscencia, se utiliza un anticuerpo secundario conjugado con el enzima
peroxidasa (HRP); la adición de un sustrato de HRP provoca una reacción
enzimática que da como resultado final la emisión de luz. Dicha luz puede ser
detectada en una película de rayos X, o de forma digital, mediante un sistema de
captación de imágenes. La detección de fluorescencia se basa en la captación de
luz emitida por sustancias fluoróforas conjugadas con el anticuerpo secundario.

● Sustancias fluoróforas: Las sustancias que son capaces de emitir luz al ser
excitadas por diferentes tipos de radiación.

- Preparación de la muestra.
En la mayoría de ensayos, las proteínas se extraen mediante procesos químicos y/o
mecánicos. El método elegido dependerá del tipo de muestra de partida, de la localización
subcelular de la proteína y de las condiciones óptimas que requiera el anticuerpo para
reconocer el epítopo proteico.
En la tabla 1 se resumen los métodos mecánicos que habitualmente se utilizan en la
extracción de proteínas para inmunotransferencia.
A menudo, en muestras tisulares de plantas y animales, se requiere el uso de un proceso
mecánico para la disrupción de la compleja matriz celular. Disrupción mecánica que suele
preceder a un proceso químico de lisis celular, mediante el uso de solución tampón que
contiene detergentes, que va dirigida a enriquecer la proteína de interés dentro del extracto
final. Las células en cultivo, frecuentemente, se suelen lisar utilizando una solución tampón
con detergente y sin la aplicación de métodos mecánicos.

La estructura química de los detergentes permite romper las membranas celulares y

solubilizar las proteínas. Estas substancias tienen una parte polar y otra no polar y se
pueden clasificar según las características del grupo polar: iónicos si el grupo polar tiene
carga positiva o negativa, no iónicos si no poseen carga o zwiteriónicos si poseen carga
negativa y positiva y la carga neta es 0.

La elección de la sustancia detergente, depende en parte de la localización, dentro de la

célula, de la proteína de interés, citoplasmática, unida a la membrana, dentro de orgánulos
celulares como el núcleo y las mitocondrias, etc...Las proteínas citoplasmáticas se pueden
unir a las proteínas del citoesqueleto, afectando así a los procesos de fraccionamiento
subcelular.
Con la rotura celular, se liberan enzimas proteasas que pueden degradar la proteína de
interés. Por tanto, es importante evitar, durate la preparación de la muestra, cualquier
actividad proteásica. La siguiente estrategia ayuda a evitar la degradación de proteínas:
● Evitar excesivos ciclos de congelación/ descongelación.
● Trabajar rápido y mantener las muestras en frío durante todo el proceso.
● Añadir inhibidores de la proteasa en el tampón de lisis.
Además de inhibir la actividad de la proteasa, puede ser interesante reducir la actividad de
la fosfatasa alcalina, en particular en estudios de fosforilación.

El resultado de la prueba de Western blot se informa como negativo cuando hay

ausencia total de bandas; como indeterminado, cuando no cumple los criterios
definidos en la tabla 1 y no es egativo, y positivo cuando cumple los criterios, de
acuerdo con el que se haya adoptado

ELECTROFORESIS.
¿QUE ES?
La electroforesis es una técnica que emplean los cientificos en el laboratorio
utilizada para separar el ADN, el ARN, o moléculas o proteínas en base a su tamaño
y carga eléctrica. Se utiliza una corriente eléctrica para mover las moléculas y que se
separen a través de un gel. Los poros del gel actúan como un colador, permitiendo
que las moléculas más pequeñas se muevan más rápido que las grandes. Las
condiciones utilizadas durante la electroforesis se pueden ajustar para separar
moléculas en el rango de tamaño que se desee, fundamentalmente, se aplica
corriente eléctrica a moléculas biológicas, ya sean ADN, proteínas o ARN..., y se
separan en función de si son más grandes o más pequeñas.

¿PARA QUÉ SIRVE?

Se utiliza en una gran variedad de aplicaciones... como en medicina forense para

determinar la identidad de las personas que puedan haber participado en un delito,
mediante la vinculación de su patrón de ADN -su patrón de electroforesis- a uno que
esté en una base de datos.

El proyecto genoma humano se llevó a cabo con algo que se llama electroforesis
capilar, mediante la separación de ADN en piezas más cortas y su separación en
geles de electroforesis que permite a los patrones de A, C, T y G ser caracterizados.
También son muy importantes en la investigación de proteínas, y en la investigación
de mutaciones genéticas, porque cuando las proteínas o el ADN están mutados, son
con frecuencia más o menos largos, y por lo tanto, aparecen en un gel de
electroforesis de manera diferente de lo normal. Las pruebas de diagnóstico para
muchos casos todavía se realizan mediante electroforesis. Es una técnica muy
utilizada en la investigación básica, muy importante para la comprensión de la
función de genes y proteínas, pero ahora ha irrumpido en el área de diagnóstico
clínico y forense. Una electroforesis se realiza generalmente en una especie de caja
que tiene una carga positiva en un extremo y una carga negativa en el otro. Y como
todos aprendimos en las clases de física, cuando se pone una molécula cargada en
un entorno así, las moléculas negativas van a la carga positiva, y viceversa. Al
analizar las proteínas en un gel, en una de estas cajas, por lo general se toma la
proteína completa para ver lo grande que es. Cuanto más corta, más migran en el
gel, de modo que las proteínas pequeñas terminará en la parte inferior del gel,
porque han ido más lejos, y las más grandes terminarán quedándose en la parte
superior.
En el caso del ADN, el ADN es una molécula muy larga, así que no se puede hacer un
gel de una molécula entera de ADN de una célula. Es tan grande que nunca se
metería en el gel, así que lo que hacen los científicos es cortar el ADN con cosas
como las enzimas de restricción, que cortan el ADN en pedazos más manejables, y
entonces esas piezas, dependiendo de lo grande que sean, migran más o menos por
el gel y terminan más arriba o más abajo.

Transferencia a una membrana

Una vez la electroforesis ha llegado a su fin, las proteínas se transfieren a una

membrana.

Esta membrana es un soporte sólido que une e inmoviliza las proteínas, permitiendo
así que la hibridación de un anticuerpo las pueda detectar. La mayoría de estos
sistemas de transferencia utilizan la generación de un campo eléctrico para conducir
a las proteínas desde el electrodo negativo al positivo. Los sistemas de
transferencia están disponibles en formato semiseco o húmedo. Los sistemas
semisecos son más rápidos y requieren menor cantidad de volumen de tampón que
los sistemas húmedos, sin embargo, no son apropiados para transferencia de
proteínas de gran tamaño (>70 kDa) y pueden causar, según el sistema de detección,
un mayor ruido de fondo. Ambos métodos requieren, para una transferencia efectiva
de las proteínas, un estrecho contacto entre el gel y la membrana. Aunque ambas
funcionan bien en experimentos de inmunotransferencia, las diferencias en sus
características pueden influir a la hora de la elección. La membrana de PVDF ofrece
una mayor resistencia mecánica y una mayor unión que la nitrocelulosa. La
membrana de nitrocelulosa tiene la ventajas de proporcionar un menor ruido de
fondo y que no requieren un pretratamiento con metanol.

Previamente a la transferencia, tanto el gel como la membrana se equilibran en una

solución tampón pre-enfriada. Típicamente, el tampón de transferencia contiene Tris,
Glicina, SDS (este último es opcional) y metano (para membranas de nitrocelulosa).
Hibridación de anticuerpo

En general, los anticuerpos reconocen una secuencia de aminoácidos pequeña

(epítopo) que queda expuesta al eliminar la estructura tridimensional de la proteína
en condiciones desnaturalizantes y reductoras. Entonces, los geles nativos se
podrían usar cuando los anticuerpos requieren de esta proteína plegada para que así
se de el reconocimiento del antígeno. Hay dos tipos de anticuerpos primarios
usados en Western como los monoclonal y los policlonal. Ambos tienen sus
ventajas y desventajas dependiendo de cómo se puedan sintetizar. Eso es lo que
vemos en la tabla, allí se muestra las diferencias que tienen estos dos anticuerpos
por ejemplo en el reconocimiento del epítopo y su sensibilidad, también en la
reactividad, en el tiempo de producción y demás.

Los anticuerpos policlonales se obtienen directamente a partir del suero del animal,
comúnmente conejo, cabra, burro u oveja y son finalmente purificados y probados.
Los anticuerpos policlonales reconocen múltiples epítopos del antígeno y en cambio
los monoclonales reconocen un único epítopo de la proteína. Para la síntesis de un
anticuerpo monoclonal, las células que sintetizan anticuerpos se aíslan del bazo del
animal y se fusionan con células del mieloma. Lo hibridomas resultantes secretan
anticuerpos al medio de cultivo, el cual se analiza y determina la afinidad al
antígeno. Los hibridomas con secreción más estable se seleccionan y pueden ser
cultivados indefinidamente

detección

Ahora, los métodos directos utilizan un anticuerpo primario conjugado con un

marcaje detectable (por ej una enzima) y los indirectos utilizan dos anticuerpos (lo
cual es un anticuerpo primario y uno secundario, cooontra la especie del primer
anticuerpo) Ahora este último que mencioné, o sea el secundario está conjugado
con marcaje detectable.

problemas

Hay problemas que se pueden presentar con el Western Blot, como observamos en
el mapa, por ejemplo que no se pueda ver la proteína, que haya un tamaño incorrecto
en la banda, que haya bandas artefactuales (es decir, que haya bandas incompletas,
o difusas, o verticales, y demás), que se presente algún problema en la electroferesis
o que haya mucho ruido de fondo. Lo bueno de todo esto es que tiene solución y hay
procedimientos y mecanismos que pueden ayudar a arreglarlo, además de
encontrarle la causa. Por ejemplo, si no se puede ver la proteína que quieres, puede
deberse a que hay una baja expresión de la proteína en el tejido o en la cédula,
dependiendo de la muestra que estés usando, y una solución a esto puede ser que
cargues más la cantidad de proteína total en gel, concentrarla más usando algún
equipo o kit especializado y posterior a esto, sí juntar varias muestras.

ventajas y desventajas

VENTAJAS

*Alta sensibilidad 0,1 nanogramos de proteína.

*Diagnóstico eficaz temprano.

*Múltiples muestras y tipos de estudio.

Desventajas

*Costo elevado.

*Variabilidad reaccional en las bandas según el ensayo , el tipo de muestras, las condiciones
técnicas, todo esto hacen variar la subjetividad de las interpretaciones.

* Hay problemas en las proteínas de fácil degradación.

*Es tardado (puede haber una inadecuada transferencia) también bandas sesgadas,
descoloridas, o incluso múltiple

(http://www.ecogen.com/upfiles/A56009.pdf)