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DESARROLLO DE UN PROCESO DE FERMENTACIÓN SÓLIDA

PARA EL HONGO Trichoderma asperellum Th204 EN UN


FERMENTADOR DE LECHO FIJO

Fredy Mauricio Cruz Barrera

Universidad Nacional de Colombia


Facultad de Ingeniería, Ingeniería Química y Ambiental
Bogotá, Colombia
2014
VII Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

DESARROLLO DE UN PROCESO DE FERMENTACIÓN SÓLIDA


PARA EL HONGO Trichoderma asperellum Th204 EN UN
FERMENTADOR DE LECHO FIJO

Fredy Mauricio Cruz Barrera

Tesis presentada como requisito para optar al título de:

Magister en Ingeniería Química

Directora:
Ph.D. Martha Isabel Gómez Álvarez
Codirector:
Dr. Ing. Juan Carlos Serrato Bermúdez

Línea de Investigación:
Bioprocesos
Grupo de Investigación:
Control Biológico de Plagas Agrícolas

Universidad Nacional de Colombia


Facultad de Ingeniería, Ingeniería Química y Ambiental
Bogotá, Colombia
2014
A Dios, Mi Amada Familia y a esa personita
que siempre estuvo conmigo
Contenido VIII

Agradecimientos
Este trabajo no hubiera sido posible sin el apoyo de CORPOICA y el de mis compañeros
de trabajo que en una u otra forma me ayudaron durante el desarrollo del trabajo.
Adicionalmente quiero agradecer a la empresa alemana PROPHYTA GmbH y
especialmente a la investigadora Ute Eiben por la gran persona que fue conmigo al
brindarme su amistad y su ayuda incondicional.

Quiero expresar mis sinceros agradecimientos a la directora, codirector y asesor de tesis


la Dra. Martha Isabel Gómez, el Dr. Juan Carlos Serrato y el ingeniero Andrés Díaz
García, quienes tuvieron una excelente dirección del trabajo y que siempre estuvieron
dispuestos a dedicar preciado de sus respectivos tiempos para dar buen desarrollo y
término a este trabajo tesis.
Contenido

Resumen
Se desarrolló un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma asperellum
Th204 utilizando un fermentador de lecho fijo PROPHYTA® L05 mediante un diseño
fraccionado (1/16) evaluando sobre su productividad (conidios/g.s.h) factores de la
operación como la relación C/N, la temperatura de incubación, la relación de inoculación,
la altura del lecho, la humedad del aire entrante, el caudal de aire y dos tipos de soporte
inerte (espuma de poliuretano y cascarilla de arroz). Los factores C/N y el caudal de aire
presentaron un efecto significativo sobre la productividad de Th204. El soporte espuma
de poliuretano se seleccionó por presentar un significativo efecto sobre la productividad
con un valor máximo de 3,89x107 conidios/g.s.h en comparación a la obtenida con la
cascarilla de arroz (2,83x106 conidios/g.s.h). Adicionalmente, con la espuma de
poliuretano se encontraron condiciones favorables para el crecimiento de Th204 como
menores gradientes de humedad del lecho, una menor caída de presión y la mayor µmax.
Por último, se generó un modelo de superficie de respuesta utilizando un diseño central
compuesto, validando las condiciones óptimas (caudal de aire saturado 0,9 m3/h, relación
C/N 18,1, temperatura de incubación 28°C, altura de lecho 5 cm y una relación de
inoculación de 1,0x107 conidios/g) con tres fermentaciones obtenido un ajuste promedio
del 91,2% respecto a la productividad esperada de 3,16x107 conidios/g.s.h.

Palabras clave: Fermentación sólida, modelamiento, productividad, caída de presión,


diseño central compuesto

Abstract
Solid fermentation process by using a fixed bed fermenter PROPHYTA® L05 for the fungi
Trichoderma asperellum Th204 was developed. A fractional design (1/16 ) on productivity
of Th204 (conidia/d.s.h) by operating factors such as C/N ratio, incubation temperature,
inoculum ratio, bed height, the inlet air humidity, airflow and two types of inert support
(polyurethane foam and husk rice) was evaluated. The factors C/N and the airflow had a
significant effect on the productivity of Th204. The polyurethane foam support was
selected to present a significant effect on productivity with a maximum value of 3.89x107
conidia/d.s.h compared to that obtained with husk rice (2.83x106 conidia/d.s.h).
Additionally, by using polyurethane foam favorable conditions to growth Th204 as minor
Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

bed moisture gradients, lower pressure drop values and higher μmax were found. Finally, a
response surface model by using a central composite design was generated and
validated at optimal conditions (saturated airflow at 0.9 m3/h, C/N ratio at 18.1, incubation
temperature at 28°C, bed height at 5 cm and an inoculum ratio of 1.0x107 conidia/g) with
a mean adjustment of 91.2% compared to the expected productivity of 3.16x107
conidia/d.s.h.

Keywords: Solid state fermentation, modelling, productivity, pressure drop, central


composite design
Contenido

Contenido
Pág.

Resumen ......................................................................................................................... VI

Lista de figuras ............................................................................................................... XI

Lista de tablas ............................................................................................................... XII

Introducción .................................................................................................................... 1

1. Marco teórico ............................................................................................................ 5


1.1 Fermentación en fase sólida .............................................................................. 5
1.2 Aplicaciones de los procesos de SSF................................................................. 7
1.2.1 Producción de enzimas.................................................................................... 8
1.2.2 Producción de polimeros ................................................................................. 8
1.2.3 Producción de biosurfactantes ......................................................................... 9
1.2.4 Producción de bioplaguicidas y biofertilizantes ................................................ 9
1.3 Biorreactores empleados en los procesos SSF .................................................. 9
1.3.1 Fermentadores de bandejas (Tray biorreactor) .............................................. 10
1.3.2 Fermentadores rotatorios (Rotatory drum biorreactor - stirred-drum
biorreactor) ............................................................................................................... 10
1.3.3 Fermentadores mezclados (Mixed bed biorreactor) y con aireación forzosa
(Forcefully aereated biorreactor) .............................................................................. 11
1.3.4 Fermentadores de lecho fijo o empacado (Packed bed biorreactor) .............. 11
1.4 Principales factores que inciden en los procesos SSF ..................................... 13
1.4.1 El soporte sólido y/o sustrato ......................................................................... 14
1.4.2 La Humedad y la actividad del agua .............................................................. 15
1.4.3 La temperatura .............................................................................................. 15
1.4.4 La aireación ................................................................................................... 17
1.4.5 El tamaño de partícula y la porosidad ............................................................ 17
1.4.6 La concentración y disponibilidad del sustrato ............................................... 18
1.4.7 El pH.............................................................................................................. 19
1.4.8 El inóculo ....................................................................................................... 19
1.5 El caso de estudio: Fermentadores de lecho empacado fijo (PBB) .................. 19
1.5.1 Gradientes de temperatura axiales en fermentadores PBB ........................... 21
1.5.2 La evaporación de la fase acuosa en fermentadores PBB ............................. 21
1.5.3 La caída de presión a través del sustrato en fermentadores PBB .................. 22
1.6 Monitoreo de la condiciones en los procesos SSF ........................................... 22
1.7 Fermentación sólida con soportes inertes ........................................................ 24
1.7.1 Tipos de soportes inertes ............................................................................... 25
1.8 El género Trichoderma sp. y los procesos SSF ................................................ 27
1.8.1 Trichoderma asperellum Th204 ..................................................................... 28

2. Materiales y métodos ............................................................................................. 29


2.1 Equipo utilizado: Fermentador PROPHYTA® L05 ............................................ 29
2.2 Microorganismo ................................................................................................ 29
Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

2.3 Determinación del soporte de crecimiento y los factores que tiene mayor efecto
sobre la producción de T. asperellum Th204 en el fermentador de lecho fijo
PROPHYTA® L05 ....................................................................................................... 30
2.3.1 Preparación del inóculo ..................................................................................30
2.3.2 Preparación del soporte inerte y de la suspensión nutritiva ............................30
2.3.3 Adecuación del fermentador PROPHYTA® L05 .............................................31
2.3.4 Inoculación e incubación ................................................................................32
2.3.5 Diseño experimental para la selección del soporte sólido y determinación de
los factores críticos (efectos fijos) .............................................................................32
 Determinación de la productividad..................................................................34
 Determinación del contenido de humedad......................................................34
 Monitoreo de consumo de O2 y producción de CO2 ........................................34
 Monitoreo de la Temperatura .........................................................................35
 Caída de Presión............................................................................................36
2.4 Generación de un modelo de productividad de T. asperellum Th204 ................ 36
2.4.1 Diseño experimental utilizando los factores críticos ........................................36
Para la generación de un modelo de respuesta de la concentración final de T.
asperellum Th204 en función de los factores críticos seleccionados (X1, X2), se realizó
un diseño factorial compuesto central con tres repeticiones en el punto central,
definiendo un espacio experimental rotacional con 11 tratamientos en el fermentador
PROPHYTA® L05 (Tabla 2.3). .................................................................................... 36
2.4.2 Validación del modelo estadístico...................................................................38

3. Resultados y discusión ..........................................................................................39


3.1 Determinación del soporte de crecimiento y los factores que tienen mayor efecto
sobre la producción de T. asperellum Th204 en el fermentador de lecho fijo
PROPHYTA® L05 ....................................................................................................... 39
3.1.1 Productividad .................................................................................................46
3.1.2 Contenido de humedad en el lecho ................................................................47
3.1.3 Producción de CO2 .........................................................................................49
3.1.4 Consumo de O2 ..............................................................................................53
3.1.5 Perfiles de temperatura en fermentaciones utilizando espuma de poliuretano53
3.1.6 Perfiles de temperatura en fermentaciones utilizando cascarilla de arroz .......56
3.1.7 Caída de presión en el lecho ..........................................................................59
3.2 Generación de un modelo de respuesta de la concentración final de T.
asperellum Th204 en función de los factores críticos .................................................. 63
3.2.1 Influencia de los factores críticos sobre la productividad de T. asperellum
Th204 63
3.2.2 Influencia de los factores críticos sobre el gradiente de humedad del lecho ...67
3.2.3 Influencia de los factores críticos sobre el gradiente de temperatura axial
promedio ...................................................................................................................69
3.2.4 Influencia de los factores críticos sobre el gradiente de concentración relativo71
3.2.5 Influencia de los factores críticos sobre la caída de presión relativa ...............73
3.2.6 Influencia de los factores críticos sobre la velocidad específica máxima de
crecimiento de T. asperellum Th204 .........................................................................75
3.2.7 Validación del modelo estadístico...................................................................79

4. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................83


4.1 Conclusiones ......................................................................................................... 83
4.2 Recomendaciones ............................................................................................ 84
Contenido

5. Bibliografía ............................................................................................................. 85
Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

Lista de figuras
Figura 1.1: Tipo de fermentadores en procesos SSF. ___________________________ 12
Figura 1.2: Regimenes de flujo de aire en un fermentador PBB ___________________ 21
Figura 2.1: Esquema del fermentador de lecho fijo PROPHYTA® L05 ______________ 30
Figura 3.1: Diagrama de Pareto para los 7 factores evaluados, determinación de efectos
fijos (Diseño fraccionado 1/16) ____________________________________________ 40
Figura 3.2: Detalle a nivel micro (10X) del crecimiento de T. asperellum Th204 sobre el
soporte espuma de poliuretano ____________________________________________ 43
Figura 3.3: Detalle a nivel micro (10X) del crecimiento de T. asperellum Th204 sobre el
soporte cascarilla de arroz _______________________________________________ 44
Figura 3.4: Detalle del crecimiento de T. asperellum Th204 en el soporte espuma de
poliuretano (Fotografías tomadas al nivel superior del fermentador) _______________ 46
Figura 3.5: Detalle del crecimiento de T. asperellum Th204 en el soporte Cascarilla de
arroz (Fotografías tomadas al primer nivel del fermentador) ______________________ 47
Figura 3.6: Contenido final de humedad de la espuma de poliuretano en las corridas del
diseño (1/16) __________________________________________________________ 48
Figura 3.7: Contenido final de humedad de la cascarilla de arroz en las corridas del
diseño (1/16) __________________________________________________________ 49
Figura 3.8: Perfiles de producción de CO2 de T. asperellum Th204 en el soporte espuma
de poliuretano _________________________________________________________ 50
Figura 3.9: Perfiles de producción de CO2 de T. asperellum Th204 en el soporte
Cascarilla de arroz (Diseño Fraccionado 1/16) ________________________________ 51
Figura 3.10: Perfil de producción de CO2 de T. asperellum Th204 en el soporte natural a
base de arroz __________________________________________________________ 52
Figura 3.11: Perfiles de Temperatura: Tres niveles (1, 2,4); aire de salida para las
fermentaciones en el soporte espuma de poliuretano ___________________________ 54
Figura 3.12: Perfiles de Temperatura del fermentador PROPHYTA® L05 para los
tratamientos con espuma de poliuretano (T1, T2, T3 y T5) _______________________ 56
Figura 3.13: Perfiles de Temperatura del aire de salida para las fermentaciones en el
soporte Cascarilla de arroz _______________________________________________ 57
Figura 3.14: Perfiles de Temperatura del fermentador PROPHYTA® L05 para los
tratamientos con Cascarilla de arroz (T4, T6, T7 y T8) __________________________ 59
Figura 3.15: Caída de presión del aire a través del sustrato natural estándar y los
soportes inertes cascarilla de arroz y espuma de poliuretano _____________________ 62
Figura 3.16: Diagrama de Pareto y superficie de respuesta para la variable Log
productividad, para los 2 factores críticos (relación C/N y caudal de aire) ___________ 65
Figura 3.17: Diagrama de Pareto y superficie de respuesta para la variable gradiente de
humedad, para los 2 factores críticos (relación C/N y caudal de aire)_______________ 68
Figura 3.18: Diagrama de Pareto y superficie de respuesta para la variable gradiente de
temperatura axial promedio, para los 2 factores críticos (relación C/N y caudal de aire) 70
Figura 3.19: Diagrama de Pareto y superficie de respuesta para la variable gradiente de
concentración relativa, para los 2 factores críticos (relación C/N y caudal de aire) ____ 72
Contenido

Figura 3.20: Diagrama de Pareto y superficie de respuesta para la caída de presión, para
los 2 factores críticos (relación C/N y caudal de aire) ___________________________ 74
Figura 3.21: Perfiles de acumulación de CO2 producido durante la fermentación de T.
asperellum Th204 ______________________________________________________ 76
Figura 3.22: Diagrama de Pareto y superficie de respuesta para la velocidad específica
máxima de crecimiento, para los 2 factores críticos (relación C/N y caudal de aire) ____ 77

Lista de tablas
Tabla 1.1: Tipos de fermentadores sólidos y productos. ................................................. 13
Tabla 1.2: Ejemplos de procesos SSF utilizando soportes inertes .................................. 25
Tabla 2.1: Factores y niveles evaluados en la fermentación sólida de T. asperellum
Th204 ............................................................................................................................. 33
Tabla 2.2: Tratamientos evaluados para la producción de T. asperellum Th204 (Diseño
experimental fraccionado 1/16-Efectos fijos). ................................................................. 33
Tabla 2.3: Niveles de los factores críticos (X1, X2) en los tratamientos evaluados en la
fermentación sólida de T. asperellum Th204 (Diseño de experimentos Central
Compuesto).................................................................................................................... 37
Tabla 3.1: Productividad de T. asperellum Th204 (conidios/g.s.h) después de 7 días
(Diseño fraccionado 1/16). ............................................................................................. 40
Tabla 3.2: Velocidades específicas máximas de crecimiento para los tratamientos del
diseño fraccionado (1/16) ............................................................................................... 52
Tabla 3.3: Temperatura promedio del lecho y gradientes promedio de temperatura axiales
en las fermentaciones con espuma de poliuretano ......................................................... 55
Tabla 3.4: Temperatura promedio del lecho y gradientes promedio de temperatura en las
fermentaciones con cascarilla de arroz .......................................................................... 57
Tabla 3.5: Caídas de presión (ΔP) promedio y máxima encontradas en las
fermentaciones del diseño fraccionado 1/16................................................................... 60
Tabla 3.6: Productividad de T. asperellum Th204 en la fermentación sólida en el
fermentador PROPHYTA® L05 (Diseño Central Compuesto). ....................................... 64
Tabla 3.7: Gradiente de humedad del lecho de los tratamientos del diseño central
compuesto...................................................................................................................... 67
Tabla 3.8: Gradiente de temperatura promedio de los tratamientos del diseño central
compuesto...................................................................................................................... 69
Tabla 3.9: Gradiente de concentración relativo (%) de los tratamientos del diseño central
compuesto...................................................................................................................... 72
Tabla 3.10: Caída de presión relativo de los tratamientos del diseño central compuesto 74
Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

Tabla 3.11: Velocidades específicas de crecimiento máximas (h-1) para T. asperellum


Th204 en el fermentador PROPHYTA® L05 ................................................................... 76
Tabla 3.12: Validación de la combinación óptima para el crecimiento de T. asperellum
Th204 en espuma de poliuretano .................................................................................... 80
Tabla 3.13: Comparación de medios de cultivo en cuanto a los costos asociados por
gramo seco de biomasa de T. asperellum Th204............................................................ 81
Introducción
En la actualidad, el control en cultivos de enfermedades, plagas y malas hierbas se
realiza principalmente con un sin número de productos químicos, muchos de los cuales
tienen un alto poder contaminante en el suelo y agua, así como riesgos en la salud
pública (Pimentel, 2005). El uso de estos agentes químicos en la agricultura, fomentado
por el sostenimiento de la población en crecimiento, podría agravar la situación ambiental
mundial, lo que ha conllevado a que la producción de insumos como bioplaguicidas,
promotores de crecimiento entre otros a base de microorganismos sea una respuesta
potencialmente sostenible a esta problemática (Glare et al, 2012). Sin embargo, el
mercado global de estos bioproductos a nivel mundial no supera el 5% comparado con
productos de síntesis química. No obstante, con la mejora y el escalamiento de los
procesos productivos, se podría fomentar la apropiación de estas alternativas biológicas
que se estiman crezcan en un 12% para el año 2017 (Global Biopesticides Market, 2012).

Los procesos productivos de microorganismos con interés biológico suelen involucrar


procesos de fermentación sumergida y fermentación sólida (SSF). Una de las técnicas de
fermentación sólida mayormente utilizadas ha sido la utilización de biorreactores de lecho
empacado, no obstante son relativamente pocos los estudios que involucran el análisis
de la incidencia de los factores sobre el rendimiento final en escalas superiores a 16
litros. La información existente en muchos casos se encuentra bajo secreto industrial y
raramente es publicada (Mitchell et al, 2006).

Diferentes estudios han demostrado como factor limitante en el escalamiento de


procesos SSF la pobre remoción de calor producto de las actividades metabólicas del
microorganismo (Mitchell et al, 2003), ocasionando problemas en el control de la
temperatura y la humedad (gradientes), así mismo en la transferencia de oxígeno (Maurel
et al, 2003; Santos et al, 2004). Los procesos de fermentación en estado sólido han
utilizado en gran medida sustratos de origen vegetal (Prabhakar et al, 2005), estos
materiales son generalmente lignocelulósicos con algún contenido de almidón,
2 Introducción

provenientes de la agricultura como granos, caña de azúcar, frijoles y pulpas (Pandey,


1992). Los sustratos naturales poseen grandes desventajas, siendo la principal que la
fuente de carbono hace parte de su estructura, lo que conlleva a que cuando el
microrganismo crece, el medio sólido es degradado, dando como resultado cambios en
características físicas del soporte como la porosidad. Estos cambios físicos del sustrato
sólido reducen en la mayoría de los casos su capacidad de transferir calor y masa
(Barrios, 2012; Manpreet et al, 2005; Barrios y Mejia, 1996). La utilización del arroz y
otros cereales como la cebada, el frijol, la lenteja han sido parte de los procesos de
fermentación en estado sólido (Pandey, 1992), estos materiales tienen un alto valor como
fuente alimenticia, siendo imprescindible la investigación en el desarrollo de nuevos
sustratos que sean inertes, económicos y que no compitan con la alimentación humana o
animal. En los últimos años, ha crecido el interés por el desarrollo de medios de cultivo
utilizando soportes inertes en donde los nutrientes están disueltos en una solución líquida
definida que es absorbida en el soporte. Igualmente, se ha demostrado que la utilización
de este tipo de soportes permite un mejor control del proceso, mayor reproducibilidad y
facilidad para el modelamiento que con los soportes naturales (Ooijkaas et al, 2000;
Chen, 2013).

Corpoica ha trabajado por más de 15 años en la producción de bioplaguicidas y


promotores de crecimiento a base de hongos filamentosos como Trichoderma sp
utilizando como sistemas de producción cuartos calientes o fermentadores de bandejas
perforadas monitoreando condiciones como la temperatura y la humedad relativa (Cruz et
al, 2011; Cruz, 2007). Sin embargo, estos procesos no han sido favorables en lo que se
refiere a la utilización de los recursos naturales, ya que se han utilizado sustratos a base
de cereales como arroz, avena y cebada entre otros, generando adicionalmente
problemas en cuanto a la residualidad, homogeneidad y repetitividad de los procesos. Es
así como surge la necesidad de profundizar en la investigación con los soportes inertes
naturales o sintéticos que sean una alternativa sostenible a la utilización de sustratos
naturales en procesos SSF y que sirvan para la producción masiva de microorganismos
con interés biológico y finalmente, contribuir en los campos del modelamiento de los
factores críticos del proceso y su optimización.

Recientemente en un proyecto de investigación conjunta entre Corpoica y la Universidad


de Rostock en Alemania, se seleccionó la cepa T. asperellum Th204 por sus
Introducción 3

características como solubilización de fósforo y promoción de crecimiento en plantas. Por


tal razón se decidió seleccionar este microorganismo como modelo para estudiar la
utilización de soportes inertes como alternativas para su producción y la evaluación de su
comportamiento a nivel piloto en un fermentador de lecho fijo (PROPHYTA® L05), el cual
permite el monitoreo de los gases de salida, la caída de presión y el control de la
temperatura de incubación.

En el presente trabajo se evaluaron dos soportes inertes, uno natural como la cascarilla
de arroz y otro sintético como la espuma de poliuretano, siendo los dos materiales
económicos y de fácil acceso. Para el proceso de fermentación de T. asperellum Th204
en el fermentador PROPHYTA® L05 se evaluaron factores operacionales como el caudal
de aire, la humedad del aire, la temperatura de incubación, la altura del lecho, la relación
C/N y la relación de inoculación sobre la productividad de hongo y el comportamiento a
nivel de gradientes de temperatura, de humedad del lecho, de concentración y caída de
presión.

Por último, los objetivos del trabajo de investigación fueron el determinar el mejor soporte
sólido inerte para el crecimiento de T. asperellum Th204, entre cascarilla de arroz y
espuma de poliuretano. Así mismo, identificar los factores que tienen mayores efectos
sobre la producción de conidios del hongo en el fermentador de lecho fijo (PROPHYTA®
L05) y finalmente, generar un modelo que describa la productividad de los conidios del
hongo en función de los factores críticos.
1. Marco teórico

1.1 Fermentación en fase sólida


Los procesos de fermentación en fase sólida o por sus siglas en inglés SSF (Solid State
Fermentation), han existido de manera natural desde los inicios del planeta. La
fermentación sólida existe en forma natural desde el comienzo de la vida, y es
considerado el método más antiguo usado por el hombre para hacer que los
microorganismos trabajen para él (Bhargav et al, 2007). Los procesos SSF han sido
empleados de forma artesanal en los países del Sudeste Asiático, África y América
Central desde hace siglos para la elaboración de alimentos a partir de cereales, siendo
utilizado por los egipcios aproximadamente 2600 AC para hacer pan, así como para la
preparación de salsa de soya en Asia más conocido como el proceso Koji (Pandey,
1992). Los procesos Koji consisten en el crecimiento de hongos como Aspergillus oryzae
en arroz u otros cereales cocidos al vapor para obtener una preparación enzimática.
Otros procesos SSF que han existido durante siglos incluyen los alimentos fermentados
como tempeh, miso y pozol, el queso madurado con mohos (queso Roquefort) y los
cultivos iniciadores para cervezas fermentadas (Moo Young et al, 1983). Desde sus
inicios con los procesos SSF se busca aumentar el contenido proteico de los alimentos,
mejorar las capacidades de conservación y cambiar características como el color, el olor
o el sabor.

Hesseltine (1972) definió a la fermentación en estado sólido como la fermentación en


donde el sustrato no es líquido. Posteriormente, en 1980 Raimbault propuso otra
definición en donde enuncia que la fermentación sólida es aquella donde el sustrato no
está disuelto ni en suspensión en un gran volumen de agua. Por otro lado, Lonsane et al
(1985), definieron la fermentación sólida como el cultivo de microrganismos que se
desarrollan sobre una superficie o en el interior de una matriz sólida en ausencia de
agua. Autores como Auria et al (1995) definieron la fermentación sólida en un proceso de
cuatro fases, la primera una fase gaseosa (estática o dinámica), un fase sólida insoluble
6 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

que contiene una fase estática líquida donde los nutrientes se encuentran solubles y por
último una fase biológica formada por el microrganismo en crecimiento. Mitchell et al
(2000) definieron la fermentación sólida como los procesos donde los microorganismos
son cultivados en presencia de una fase acuosa en una concentración máxima de
sustrato. Finalmente, una definición ampliamente acogida ha sido la expuesta por
Pandey et al (2000) quienes definieron a la fermentación en estado sólido como “El
cultivo de microorganismos sobre un soporte sólido humedecido, que puede ser usado
como fuente de carbono y de energía “. En la actualidad se pueden distinguir dos clases
de sistemas de fermentación sólida, la primera utilizando sustratos sólidos naturales y la
segunda con soportes inertes impregnados con suspensiones de nutrientes (Barrios,
2012).

La principal diferencia entre las fermentaciones líquidas (SmF-Submerged fermentation)


y las fermentaciones sólidas es la capacidad de mezcla. Para el caso de las
fermentaciones líquidas, éstas son sistemas de reacción que en general están
perfectamente mezclados, logrando en cada parte del reactor y en un tiempo dado la
misma cantidad de microorganismo, nutrientes, y metabolitos (Gervais y Molin, 2003). El
predominio actual de los procesos de fermentación sumergida (SmF) es evidente. Para la
mayoría de los productos de fermentación, generados con este tipo de tecnologías se
obtienen mejores rendimientos y son más fáciles de aplicar por su avanzado desarrollo
en comparación a las tecnologías SSF.

Frente a las técnicas de fermentación sumergida, la fermentación en estado sólido


presenta rendimientos más altos para el caso de hongos filamentosos, esto se atribuye
principalmente a que la fermentación sólida simula el hábitat natural del microorganismo
(Pandey, 2003). Asimismo, los procesos SSF son generalmente menos costosos al
demandar menos energía que los procesos SmF (Pandey et al, 2008; Thomas et al,
2013; Holker y Lenz, 2005). En cuanto a la producción de esporas de hongos
filamentosos como Trichoderma sp., las tecnologías de fermentación en estado sólido
poseen ventajas sobre las tecnologías de fermentación sumergida, ya que en estas se
obtienen mayores productividades y se producen conidios con una mayor estabilidad
biológica, resistencia a la deshidratación, germinación y una pared celular más rígida
(Pandey et al, 2008; Larroche et al, 1992; Feng et al, 2002; Holker y Lenz, 2005). El
Marco teórico 7

crecimiento de los hongos filamentosos puede favorecerse en condiciones de SSF, ya


que permite un mayor crecimiento de las hifas que penetran los espacios libres del
sustrato colonizándolo completamente (Santos et al, 2004).

Los procesos SSF suelen utilizar como sustratos los productos de desecho o
subproductos de la agricultura y del procesamiento de alimentos. Esos desechos y
subproductos incluyen salvado de trigo, salvado de arroz, tortas de filtración en la
industria de los aceites, orujo de manzana, orujo de uva, cáscaras de plátano, cáscaras
de cítricos, paja de trigo, cascarilla de arroz, pulpa de café, pulpa de cítricos, pulpa de
remolacha de azúcar, cáscara de café y melaza de remolacha azucarera entre muchos
otros. En varios casos se han utilizado materiales con un alto valor agrícola y alimentario,
tales como la leche cuajada, las remolachas forrajeras, el arroz y la yuca. Recientemente,
ha surgido una gran interés en el uso de soportes inertes impregnados con soluciones
nutritivas, como el bagazo de la caña de azúcar o como la espuma de poliuretano
(Mitchell et al, 2006; Thomas et al, 2013).

1.2 Aplicaciones de los procesos de SSF

Las técnicas de los procesos SSF son utilizadas en varios bioprocesos como
bioremediación, biodegradación de compuestos tóxicos, biotransformación de residuos
agrícolas, así como en la producción de metabolitos secundarios como antibióticos,
alcaloides, factores de crecimiento de plantas, enzimas, ácidos orgánicos,
biocombustibles y bioplaguicidas (Pandey et al, 2008; Pandey, 1992; Hackett et al, 1999;
Tuomela et al, 2000). Los procesos SSF se han aplicado ampliamente en la producción
de bioproductos agroindustriales como bioplaguicidas (producción de esporas) (Feng et
al, 2002), biofertilizantes y biocombustibles; en la industria química se ha usado para la
producción de colorantes y aromas; en la industria de alimentos, para la producción de
enzimas como a-amilasa, fructosil transferasa, lipasas, pectinasas, ácidos orgánicos,
ácido láctico, ácido cítrico y gomas de xantano (Pandey et al, 2008). Adicionalmente, los
procesos SSF son usados en actividades de biodegradación, como el compostaje y el
ensilaje (Thomas et al, 2013; Mohammad et al, 2012).

A pesar de este potencial, pocos de los muchos procesos de SSF que se estudian en el
laboratorio llegan a escala de producción industrial. Esto se debe a la dificultad en el
8 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

control de las variables claves del proceso a gran escala en los biorreactores, y la
dificultad para encontrar los valores óptimos para el crecimiento y/o la formación del
producto (Dalsenter et al, 2005).

1.2.1 Producción de enzimas

La producción de enzimas usando los procesos SSF han contribuido en los campos de
los biocombustibles, alimentos y fabricación de detergentes (Thomas et al, 2013).
Muchos son los ejemplos que incluyen las tecnologías de fermentación sólida para la
producción de enzimas, por ejemplo en la producción de amilasas por Roses y Guerra
(2009) y Sharma y Satyanarayana (2012), utilizando Aspergillus niger y Bacillus acidicola
respectivamente, celulasas como la β-glucosidasa (Singhania et al, 2010; Li et al, 2013)
secretada por Neurospora sitophila, quitinasas por Colletotrichum lindemuthianum
(Suresh et al, 2011), quitosanasas secretadas por el hongo Trichoderma koningii (Da
silva et al, 2012), exo- y endo-glucanasas secretadas por Aspergillus fumigatus en
salvado de trigo (Mahmood et al, 2013), polisacáridos como las inulinas producidas por
Kluyveromyces marxianus utilizando cachaza como sustrato (Dilipkumar et al, 2013),
invertasas por fermentación de Aspergillus caespitosus (Alegre et al, 2009), lacasas
secretadas por Pleurotus ostreatus (Karp et al, 2012), lipasas producidas por
Trichoderma harzianum utilizando residuos agroindustriales (Coradi et al, 2013) y por
último fitasas extraidas de Aspergillus niger cultivado en cascaras de cítricos (Rodríguez
et al, 2013) entre otras.

1.2.2 Producción de polimeros

La fermentación sólida ha sido explorada para la producción de biopolímeros como los


exopolisacáridos (EPSs) (Seesuriyachan et al, 2012), polihidroxialcanoatos (PHAs)
(Castilho Y Mitchell, 2009) y otros como el dextrano utilizando Saccharomyces cerevisiae
(Moussa Y Khalil, 2012). Los EPSs producidos por los microorganismos son de gran
importancia industrial, siendo producidos por varios hongos y bacterias tales como las
bacterias acido lácticas (Thomas et al, 2013).
Marco teórico 9

1.2.3 Producción de biosurfactantes

En los últimos años ha existido un gran interés en la aplicación de los procesos SSF en la
producción de biosurfactantes debido a su amplia aplicabilidad en las áreas de la salud y
el medio ambiente. Particularmente para la producción de soforolipidos secretados por
algunas levaduras, estos son surfactantes que tienen propiedades emulsificantes e
inhibidoras del crecimiento de microorganismos (Thomas et al, 2013). También se ha
usado en la producción de lipopéptidos producidas por Bacillus amyloliquefaciens para la
remoción de derrames de aceite (Zhu et al, 2013).

1.2.4 Producción de bioplaguicidas y biofertilizantes

Son varios los estudios realizados utilizando la fermentación sólida para la producción de
ingredientes activos (hongos, levaduras y bacterias) en la industria de los bioplaguicidas
y biofertilizantes. Soccol et al (1997) desarrollaron un proceso SSF basado en varios
sustratos agro-industriales para producir esporas del hongo entomopatógeno Beauveria
bassiana para el control biológico de plagas en plátano, caña de azúcar, soya y café.
Desgranges et al (1993) también utilizaron los procesos SSF para producir B. bassiana
para el control del barrenador europeo del maíz. Por otra parte, Chen et al (2011)
describieron la producción de Trichoderma harzianum SQR-T037 como fertilizante y
biocontrolador de Fusarium sp. en el cultivo del pepino así mismo, Zhang et al (2013)
describieron la producción de un bioplaguida a base de Bacillus thuringiensis usando
residuos de cocina como sustrato

1.3 Biorreactores empleados en los procesos SSF

Sobre la base de las similitudes en el diseño y de operación en cuanto al mezclado y


aireación, los biorreactores SSF se pueden dividir en 5 grupos. El primer grupo
corresponde a los biorreactores donde el lecho es fijo y el aire circula alrededor de él,
como los fermentadores de bandejas (Pandey et al, 2008; Dhillon et al, 2011; Vaseghi et
al, 2013). El segundo grupo son los biorreactores donde el lecho es fijo o el mezclado es
poco frecuente y el aire es forzado a atravesar el lecho, estos son los lechos empacados
(Durand et al, 1993; Raimbault, 1998; Rodríguez et al, 2000; Fanaei y Vaziri, 2008;
Karimi et al, 2014). En el tercer grupo, el mezclado del sustrato es continuo o intermitente
10 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

y el aire circula alrededor de él, dentro de estos están los tambores rotatorios (Prado et
al, 2004; Rodríguez et al, 2013; Dhillon et al, 2013). Por último, los biorreactores donde
el sustrato es agitado y el aire es forzado a atravesarlo son calificados como los
biorreactores de lecho fluidizado y variaciones de los lechos agitados y aireados (Mitchell
et al, 2006). También es considerado un quinto grupo que corresponde a los cuartos de
incubación con el sustrato en bandejas o bolsas plásticas donde se puede controlar la
temperatura y la humedad relativa (Durand, 2003; Leza et al, 2007).

1.3.1 Fermentadores de bandejas (Tray biorreactor)

Los fermentadores de bandejas representan el tipo más sencillo de biorreactores que se


utilizan para los procesos SSF. Este tipo de fermentadores han sido utilizados durante
siglos en la producción alimentos fermentados tradicionales como el tempeh, miso, el koji
y la salsa de soya (Durand et al, 1993; Mitchell et al, 2006).

La cámara del fermentador consta de un gran número de bandejas individuales una


encima de la otra con un vacío entre ellas para la aireación. La altura del sustrato puede
variar entre 5 y 15 cm. Este tipo de fermentadores pueden ser utilizados a escala de
laboratorio o industrial. La bandeja puede estar construida de varios materiales, tales
como madera, bambú, metal (el metal debe pintarse para evitar la corrosión), o plástico
(Ali y Zulkali, 2011). En escala de laboratorio se pueden emplear cajas de Petri, frascos,
bolsas de plástico y frascos Erlenmeyer.

No obstante, la principal desventaja de los fermentadores de bandejas es el alto


requerimiento de espacio y una menor carga de sustrato por bandeja. Sin embargo, sigue
siendo éste sistema de SSF el preferido para la producción de enzimas industriales, tales
como fitasas, pectinasas y celulasas entre otras (Binod et al, 2013; Thomas et al, 2013).

1.3.2 Fermentadores rotatorios (Rotatory drum biorreactor -


stirred-drum biorreactor)
En este tipo de fermentadores, el sustrato es mezclado de forma continua o intermitente
con una frecuencia desde minutos hasta horas, haciendo circular el aire en el interior del
biorreactor. La agitación del sustrato se obtiene por dos métodos, el primero por rotación
Marco teórico 11

del tambor del biorreactor (Rotatory drum biorreactor), o el segundo por agitación directa
en interna del sustrato en el tambor (stirred-drum biorreactor) (Ali Y Zulkali, 2011) (Figura
1.1 B). Los fermentadores rotatorios son más costosos que los fermentadores de
bandejas ya que requieren más mantenimiento y su uso se limita a los microorganismos
que son tolerantes al esfuerzo cortante (Grajales et al, 2012). Sin embargo, ofrecen
ventajas en el sentido que permiten el control de la mezcla del sustrato, evitando la
canalización del aire, mediante la velocidad de rotación (normalmente muy baja)
(Thomas et al, 2013).

1.3.3 Fermentadores mezclados (Mixed bed biorreactor) y con


aireación forzosa (Forcefully aereated biorreactor)
En este grupo de fermentadores, el sustrato es agitado mientras que el aire se sopla con
fuerza a través de él. Este tipo de biorreactores típicamente puede ser operado de dos
formas, de acuerdo con la manera de mezclar, los biorreactores que mezclan de forma
continua o los biorreactores que mezclan intermitentemente. La combinación de la
mezcla y la aireación forzada puede ayudar a evitar gradientes tanto de temperatura
como de humedad. Es así como durante la mezcla es posible añadir agua al lecho del
sustrato, reduciendo la necesidad de utilizar una alta tasa de evaporación como un
mecanismo de enfriamiento. La elección entre la operación continua ó intermitente
dependerá de la sensibilidad del microorganismo a las fuerzas de corte y a las
propiedades de las partículas del sustrato tales como su resistencia mecánica y rigidez.
Varios diseños cumplen con estos criterios, como los lechos fluidizados, el tambor
oscilante y varios biorreactores-aireados y agitados (Ali y Zulkali, 2011) (Figura 1.1 D).

1.3.4 Fermentadores de lecho fijo o empacado (Packed bed


biorreactor)
Se consideran biorreactores de lecho fijo (Packed bed biorreactor) aquellos en donde el
sustrato yace horizontalmente en una columna y el aire atraviesa el lecho de abajo hacia
arriba ó en sentido contrario (Mitchel et al, 2006). Estos biorreactores tienen ventajas en
relación con una mayor carga de sustrato por volumen de biorreactor y a la sencillez y
precisión para medir los gases a la salida del proceso (CO2 y O2), aspectos que han
permitido desarrollar fácilmente modelos cinéticos de crecimiento (Thomas et al, 2013)
(Figura 1.1 C).
12 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

Sobre la base de las consideraciones de eliminación de calor, la columna puede estar


cubierta con una camisa de agua, como el tradicional biorreactor de lecho empacado
(Figura 1.1 C), o usar una placa de transferencia de calor insertada en el lecho, como el
fermentador tipo "Zymotis”.

Figura 1.1: Tipo de fermentadores en procesos SSF.

A. Biorreactor de Bandejas (TB)


B. Biorreactor rotatorio (BDR)

C. Biorreactor de lecho fijo (PBB)


D. Biorreactor de lecho fluidizado;
Biorreactor de lecho agitado
(Adaptado de Mitchell et al, 2006).

En la tabla 1.1 se muestran algunos ejemplos de aplicación de los biorreactores SSF


para diversos productos.
Marco teórico 13

Tabla 1.1: Tipos de fermentadores sólidos y productos.

Tipo de Sustrato Microorganismo Producto Referencia


Biorreactor
PBB Cebada Penicillium Ácido micofenólico Alani et al, 2009
brevicompactum
PBB Bagazo de caña Kluyver omyces Inulinasa Mazutti et al,
marxianus 2010
PBB Espuma de Aspergillus niger Tanasa Rodriguez et al,
poliuretano 2011
TB Bagazo de caña Rhizopus oryzae Lipasas Vaseghi et al,
2013
TB Arroz Aspergillus niger Pectinasas Ruiz et al, 2012
RDB Algas Aspergillus niger Fucoidanasas Rodriguez Jasso
et al, 2013
RDB Pulpa de manzana Aspergillus niger Ácido cítrico Dhillon et al, 2013
(Thomas et al, 2013)

1.4 Principales factores que inciden en los procesos


SSF
En los procesos SSF, las condiciones como la temperatura, el pH, la humedad, la
concentración del inóculo, la disponibilidad de los nutrienes, la tasa de aireación, el
tamaño de partícula del soporte o sustrato afectan significativamente tanto el crecimiento
como la formación del producto (Pandey et al, 2008). Igualmente, para alcanzar una
producción eficiente es de gran importancia determinar la relación óptima entre las
fuentes de carbono y nitrógeno (C/N), que permita mantener la actividad de los complejos
enzimáticos como quitinasas, celulasas y proteasas entre otros, secretados por el
microorganismo para la asimilación de los nutrientes del sustrato (Pandey, 2003). Por
otra parte, en este tipo de procesos se debe brindar el suministro efectivo de oxígeno
durante el crecimiento del hongo, el cual influye en la colonización completa del sustrato
y posterior esporulación (Harman y Kubicek, 1998).

En el cultivo líquido agitado o fermentación sumergida (SmF) el control de las diferentes


condiciones es relativamente simple, ya que estos sistemas son homogéneos desde el
punto de vista de la concentración celular, nutrientes y productos. Sin embargo, en los
sistemas sólidos se presentan algunos problemas con el mezclado, la transferencia de
oxígeno, el intercambio de calor, el control de la humedad y el pH, debido principalmente
a la heterogeneidad del sistema (Doelle et al, 1992, Pandey, 2003). Para el caso de
14 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

hongos filamentosos crecidos en SSF, los diferentes estudios no han permitido sintetizar
claramente la dependencia de los parámetros fisicoquímicos y termodinámicos con el
resultado final del proceso.

1.4.1 El soporte sólido y/o sustrato


Los sustratos para los procesos SSF se puede dividir en tres grupos, los sustratos ricos
en almidón, los sustratos compuestos principalmente por celulosa o lignocelulosa y los
sustratos que contienen azúcar soluble. Entre los sustratos de almidón se incluyen el
arroz, la yuca, el salvado de trigo, salvado de arroz, harina de maíz y harina de plátano.
En cuanto a los sustratos lignocelulósicos se incluyen la paja de trigo y de maíz, la pulpa
de remolacha azucarera y la madera. Por último, los sustratos que contienen azúcares
solubles incluyen el orujo, el sorgo dulce, la remolacha azucarera, los desechos de piña y
la pulpa de café entre otros (Manpreet et al, 2005).

Por otro lado, los soportes pueden ser materiales naturales como el bagazo de caña y la
cascarilla de arroz, ó sintéticos como la espuma de polietileno, espuma de poliuretano ó
minerales porosos como la vermiculita. Los sustratos naturales poseen grandes
desventajas en su uso, siendo la principal que la fuente de carbono hace parte de su
estructura, lo que conlleva a que cuando el microrganismo crece, el medio sólido es
degradado, dando como resultado cambios en las características físicas de la misma
como la porosidad, y la capacidad de transferir calor y masa (Barrios y Mejia, 1996;
Mitchell et al, 2006).

En contrataste, la utilización de soportes sólidos inertes permite un mejor control del


proceso, mayor reproducibilidad y facilidad para el modelamiento que con los soportes
naturales (Ooijkaas et al, 2000). Son varios los ejemplos de utilización de soportes
inertes sólidos para el crecimiento de hongos, como Lecanicillium lecanii en espuma de
poliuretano (Marin et al, 2008), Colletotrichum truncatum en vermiculita (Silman et al,
1993), Beauveria bassiana en granos de arcilla (Desgranges et al, 1993) y Coniothyrium
minitans en bagazo de caña (Weber et al, 1999) entre otros.

Por último, al ser el sustrato el principal componente en los procesos SSF, estos
determinan los efectos de transferencia (calor y masa) del proceso, afectan la elección de
Marco teórico 15

del microrganismo o metabolito a producir y el diseño del equipo de fermentación (Chen,


2013).

1.4.2 La Humedad y la actividad del agua


El papel del agua en los procesos de SSF es múltiple. El agua es el componente
dominante en la composición de la biomasa, el agua sirve además de vehículo para las
enzimas y los nutrientes, además de facilitar los intercambios gaseosos. El contenido de
humedad del sustrato o del soporte en la fermentación sólida puede variar entre el 30 y
80% (Oriol et al, 1988), y depende del sólido utilizado, el microorganismo y el objetivo del
proceso (producción de metabolitos o crecimiento de la biomasa).

Una humedad elevada en el sustrato causa una disminución de la porosidad del sustrato,
una baja difusión de oxígeno y una mayor probabilidad de contaminación. Al contrario,
una baja humedad conduce a un crecimiento limitado y disminuye la disponibilidad del
sustrato (Oriol et al, 1988). El contenido de agua del soporte sólido está relacionado con
la capacidad de retención de agua, valores que pueden alcanzar hasta 10 gramos de
agua por gramo de materia seca en el caso de fibras de celulosa (Gervais y Molin, 2003)
o 30 gramos de agua por gramo de soporte inerte en el caso de la espuma de poliuretano
(Marin et al, 2008).

La actividad del agua (aw) es el parámetro que se ha utilizado para caracterizar el agua
que realmente está disponible para el microrganismo. La actividad del agua se define
como la relación entre la presión parcial del vapor de agua en la solución gaseosa en el
estado de equilibrio, con el agua adsorbida en el sólido y la presión de vapor del agua
pura a la misma temperatura. Por lo general, las bacterias necesitan un aw de 0,90 a
0,99; las levaduras de 0,80 a 0,90, y los hongos necesitan 0,60 a 0,70 (Gervais y Molin,
2003).

1.4.3 La temperatura
La temperatura se considera como uno de los factores críticos de control en los procesos
SSF debido a la alta concentración del sustrato por unidad de volumen y a la baja
conductividad térmica del sistema heterogéneo compuesto por una fase sólida (sustrato o
soporte) una fase líquida (agua, suspensión de nutrientes) y una fase gaseosa (aire,
16 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

volátiles). A causa de la baja conductividad térmica de los sustratos utilizados en


procesos SSF y los pequeños contenidos de humedad, se generan problemas
considerables con la transferencia de calor. Esta transferencia de calor depende también
de otros parámetros del soporte sólido como el tamaño de partícula y la porosidad.
Igualmente, de parámetros del proceso como el tipo de microrganismo (calor metabólico),
flujo y temperatura de aire de entrada y tipo del material de fabricación del fermentador
(Mitchell et al, 2002; Mitchell et al, 2006). El aumento descontrolado de la temperatura se
traduce principalmente en una desaceleración de la actividad del microrganismo y la
deshidratación del sustrato (Gutiérrez et al, 1995). El control de la temperatura se ha
tratado a través de mecanismos de conducción y convección forzada. Por otro lado, los
métodos de extracción de calor por convección requieren de elevadas tasas de aireación
que con frecuencia deshidratan al medio. No obstante, se puede controlar la temperatura
mediante la utilización del calor latente de vaporización del agua, que permite eliminar el
calor metabólico de manera rápida y efectiva (Sargantanis et al, 1993).

Son muchos los trabajos que se han centrado en este aspecto, ya que el control de
temperatura es uno de los problemas que se ha detectado desde siempre en los
procesos SSF y que actualmente no tiene una solución clara. Se han reportado diversos
gradientes de temperatura dentro del lecho de fermentación: 30°C cm-1 (Rathbun y
Schuler, 1983); 2,50°C cm-1 (Raimbault, 1980); 4,50°C cm-1 (Saucedo et al, 1990;
González et al, 1990). Adicionalmente, no existe mucha información acerca de la
magnitud del calor metabólico generado en un proceso SSF, sin embargo Rathbun y
Schuler (1983) reportaron una producción hasta de 15,9 J/kg de materia seca, mientras
que la velocidad de generación de calor es del orden de 3,3x105 J/kg.h de materia seca
(Raimbault, 1980). En un proceso de SSF a nivel industrial el seguimiento y el control de
la temperatura y la humedad son fundamentales por lo que se requiere tomar la humedad
del medio, la humedad relativa del aire y la temperatura. Por otra parte, el tipo de reactor
utilizado (con o sin agitación) juega un papel fundamental en la eficiencia del control de la
temperatura, que se puede controlar normalmente por aire forzado a través del lecho,
con la agitación o por evaporación de la humedad.
Marco teórico 17

1.4.4 La aireación

En la mayoría de los procesos de fermentación en estado sólido participan


microorganismos aerobios, por lo tanto la aireación es un factor fundamental para el
desarrollo del proceso. La aireación se utiliza para suministrar el oxígeno necesario, para
extraer el CO2 formado, así como para extraer el calor metabólico evolucionado (Chen,
2013; Mitchell et al, 2006). El flujo óptimo de aire debe tomar en consideración la
naturaleza del microorganismo utilizado, los requerimientos de oxígeno para su
crecimiento y/o la formación del producto deseado, la velocidad de generación de calor
metabólico, la concentración crítica del dióxido de carbono y otros metabolitos volátiles,
el espesor del sustrato sólido, entre otros. En varios casos la aireación de los procesos
de fermentación sólida es más fácil que en las fermentaciones sumergidas, porque la
superficie de contacto es mayor entre el aire y el líquido que está absorbido en las
partículas (Viniegra et al, 2003).

1.4.5 El tamaño de partícula y la porosidad

El tamaño de partícula está muy ligado a la transferencia de masa en el sistema de


fermentación en estado sólido. La transferencia de masa puede ser intrapartícula e
interpartícula (Moo Young et al, 1983). Para la transferencia de masa intrapartícula
influye el tamaño, la porosidad, la forma del poro, y el tamaño de la partícula (Krishna,
2005). Mientras que en el segundo caso, el espacio interpartícula es lo más importante y
éste es afectado por el tamaño de la partícula, su forma y la humedad (Bernard et al,
1992). Otro aspecto que influye en la transferencia de masa durante el proceso, es el
cambio de estructura de las partículas del sustrato resultado de la acción de los
microorganismos (Moo Young et al, 1983). En general, el tamaño de partícula en los
procesos SSF tiende a disminuir como resultado de la degradación y actividad
metabólica del microrganismo, asimismo la mayoría de los soportes sólidos son pre
tratados por molienda, buscando disminuir el tamaño de partícula y aumentando el área
superficial (Pandey et al, 2008).

En general una alta porosidad total significa más agua y aire entre los poros de la matriz
sólida. Generalmente, poros con un diámetro equivalente menor a 0,002 mm son
inactivos, ya que estos poros se ven afectados por la película de agua delimitada entre
18 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

las partículas, impidiendo el efecto capilar (las fuerzas intramoleculares predominan). Los
poros con un diámetro equivalente de 0,002 mm hasta 0,2 se conocen como poros
capilares de porosidad; ya que estos poros pueden mantener el agua por fuerzas
capilares. Finalmente, los poros de ventilación son poros con diámetros equivalentes
mayores a 0,02 mm (Chen, 2013).

Los valores de porosidad sólo reflejan la suma de agua y el espacio ocupado por el aire
(gas) dentro de la matriz sólida, pero no las cantidades relativas de agua y aire (gas) de
forma independiente. La relación de la porosidad de aireación (poros de ventilación) y la
porosidad de retención de agua (poros capilares) conocido como R es un parámetro
importante que refleja en la matriz las condiciones del agua y aire. Los valores R altos
significan menos capacidad de retención de agua y una ventilación más grande,
sugiriendo un exceso de ventilación que obliga a aumentar el suministro de agua en el
proceso SSF. Por otro lado, si R es pequeño sugiere un volumen de aire pequeño y una
gran capacidad de retención de agua en la matriz sólida, lo que conllevaría fácilmente a
un almacenamiento excesivo de agua dentro de la matriz (Chen, 2013).

1.4.6 La concentración y disponibilidad del sustrato


El medio de cultivo debe tener todos los nutrientes necesarios de forma balanceada para
favorecer el crecimiento y/o expresión metabólica del microrganismo. Las relaciones
entre algunos de sus elementos son de particular importancia, por ejemplo, la relación
carbono-nitrógeno (C/N) es relevante en la eficiencia de conversión energética y en la
respiración celular (Cannel y Moo Young, 1980).

Al igual que en los cultivos sumergidos, la concentración del sustrato ejerce una
influencia sobre el desarrollo del microorganismo. Sin embargo, esta influencia no está
caracterizada en términos de limitación o inhibición como en los cultivos sumergidos; no
obstante, los efectos de limitación pueden ser mayores en las fermentaciones sólidas,
debido a la baja velocidad de difusión de los nutrientes en su fase líquida (Moo Young et
al, 1983; Gervais y Molin, 2003). Se ha encontrado que la relación C/N tiene una gran
importancia y su valor óptimo puede variar en el intervalo de 10 a 100 dependiente del
proceso de fermentación y del microorganismo. Para el caso de hongos filamentosos
como Trichoderma sp. diversos estudios con diferentes cepas han generado valores
óptimos entre 6 y 26 (Aceh, 2007; Martin et al, 1997).
Marco teórico 19

1.4.7 El pH
El pH es otra variable que afecta el desarrollo de los procesos SSF, al igual que lo hace
en los cultivos sumergidos. Sin embargo, en el caso de la fermentación sólida, su control
es prácticamente imposible, debido a la ausencia de instrumentos capaces de medir el
pH en la capa de líquido que rodea el sólido (Mitchell et al, 2002). Sin embargo, algunos
autores sugirieron el uso de un electrodo de pH estándar, después de suspender la
muestra sólida en agua destilada (Durand y Chereau, 1988). El pH cambia por diferentes
razones; normalmente disminuye por la secreción de ácidos orgánicos como el ácido
acético y el ácido láctico durante el proceso, o por la hidrólisis de proteínas (Gervais y
Molin, 2003). No obstante, Domenech (2000) demostró que la fuente de nitrógeno
utilizada influye mucho en la tendencia que sigue el pH. Durante el proceso, el pH puede
ser controlado mediante la adición de ácidos o bases en el agua suministrada para el
enfriamiento del lecho (Durand y Chereau, 1988). Igualmente, el pH se puede mantener
utilizando soluciones buffer, para el caso de hongos entre 3,5 y 6,0, para levaduras entre
4,5 y 7,0 y para bacterias entre 2 y 8 (Pandey et al, 2008).

1.4.8 El inóculo
Otro factor que influye en los procesos de SSF lo representa el tipo de inóculo y la forma
de inoculación. En general se usan dos tipos de inoculantes, la microflora natural o
endógena del sustrato o los inoculantes controlados. En los procesos de compostaje y de
ensilado se prefiere la microflora natural, mientras que en los procesos de producción de
enzimas y de alimentos fermentados se utilizan inóculos puros o inóculos mixtos. Por
ejemplo, para la producción industrial de varios bioplagucidas se utilizan las esporas o
conidios de los hongos antagonistas como Trichoderma sp. ó entomopatógenos como
Lecanicillium sp. Metarhizium sp. Beauveria sp. (Pandey et al, 2008).

1.5 El caso de estudio: Fermentadores de lecho


empacado fijo (PBB)
Los fermentadores sólidos de lecho empacado se caracterizan principalmente por tener
el sustrato o soporte fijo en una columna, con una sección transversal constante, en
donde el aire es forzado a travesar el lecho comúnmente de abajo hacia arriba. La
columna puede tener un tubo perforado insertado dentro de su centro axial que mejora el
20 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

suministro de aire. Adicionalmente, la columna del lecho puede estar enchaquetada o


puede tener platos de transferencia de calor insertados (Mitchell et al, 2006).

Dentro de las principales variables de control en un fermentador sólido PBB se


encuentran la velocidad de aireación y la temperatura del aire de entrada. Por otro lado,
en los fermentadores PBB se han descrito tres fenómenos importantes que son
afectados por la escogencia del diseño y las variables de control, como son:

 Los gradientes de temperatura axiales y radiales generados dentro del lecho.


 La evaporación de la fase acuosa del lecho (gradientes de humedad).
 La caída de presión a través del lecho.

Los últimos estudios en fermentadores de lecho empacado se han centrado en la


optimización del proceso mediante el uso de diversos soportes inertes buscando mejorar
la transferencia de calor y masa y promoviendo el flujo de oxígeno (Chen, 2013). Es así
como Baños et al (2009) utilizaron la espuma de poliuretano (trozos de 1-3 cm3) con
Aspergillus terreus para producir lovastatina en un fermentador PBB con un diámetro de
0,021 m y una longitud de columna de 0,15 m. Los resultados mostraron una producción
de lovastatina significativamente superior a las encontradas con otras tecnologías de
SSF y SmF.

Otro fenómeno que es de gran importancia controlar en los fermentadores PBB es la


canalización del aire o “Channelling” (Figura 1.2) este fenómeno puede ocurrir
principalmente por las características del soporte, la fase de crecimiento del
microorganismo, la velocidad de aireación y la velocidad de pérdida de humedad de la
matriz.

En la Figura 1.2 se describe el fenómeno de la canalización donde (a) es la situación


deseable, con un flujo uniforme a través de toda la sección transversal del lecho. En el
caso (b) existe un flujo preferencial entre el lecho y la pared del fermentador cuando el
lecho se aleja de la pared. En (c) existe un flujo preferencial a través de una “grieta” en el
lecho. Finalmente, en (d) se muestra una vista a microescala de un canal, que describe
cómo un flujo preferencial surge debido a dos fuentes de resistencia al flujo, como la
trayectoria tortuosa a través del lecho y el hecho de que el espacio entre las partículas se
llenan parcialmente con biomasa. En casos extremos de canalización, puede no existir
Marco teórico 21

flujo a través de los espacios entre las partículas, por lo que la transferencia de materia
se limita a la difusión y la transferencia de calor a la conducción (Tomado y adaptado de
Mitchell et al, 2006).

Figura 1.2: Regimenes de flujo de aire en un fermentador PBB

d)

1.5.1 Gradientes de temperatura axiales en fermentadores PBB


El flujo de aire a través del lecho en los fermentadores PBB es considerado mayormente
como un flujo pistón, esta característica más la ausencia de un mezclado provocan la
generación de gradientes de temperatura axiales. Estudios realizados por Ghildyal et al.
(1994), Gowthaman et al (1993) y Weber et al (2002), sugieren que los gradientes de
temperatura axiales aumentan linealmente con el aumento de la altura del lecho y con la
disminución de la velocidad de aireación. El aumento de la temperatura del aire a medida
que fluye a través del lecho aumenta la capacidad de transporte de agua en el aire y por
lo tanto la evaporación se producirá, incluso si se utiliza aire saturado en la entrada
(Mitchell et al, 2006).

1.5.2 La evaporación de la fase acuosa en fermentadores PBB


La evaporación es un mecanismo eficaz para la eliminación del calor metabólico
producido durante el cultivo en un biorreactor de SSF a mayor escala. Sin embargo, la
evaporación afecta la actividad de agua (aw) en el soporte ocasionando un efecto
22 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

adverso sobre la actividad del microorganismo. Adicionalmente, la evaporación también


puede causar la contracción del soporte-sustrato, lo que conlleva a la canalización en el
lecho del sustrato y por lo tanto a un pobre control del proceso. De esta forma, la
reposición del agua pérdida es requerida. En los sistemas no mezclados como en los
biorreactores PBB, esto es imposible, y como resultado se presentan fuertes gradientes
de humedad. No obstante, aunque el contenido total de humedad del medio se puede
medir, la detección y el control en línea son difíciles (Chen, 2013; Mitchell et al, 2006).

1.5.3 La caída de presión a través del sustrato en fermentadores


PBB
La caída de presión ha sido relativamente poco estudiada en los procesos SSF en
general, sin embargo varias aproximaciones se han hecho en los fermentadores PBB. Se
conoce que las variaciones en la presión entrante y saliente del aire pueden ser usadas
como modelo para determinar las fases de crecimiento de los hongos, así mismo se
pueden correlacionar con la evolución de CO2 (Auria et al, 1995). El fenómeno de la
caída de presión se ha descrito que surge debido a la viscosidad del aire, ya que este
tiende a pegarse a las superficies de las partículas del lecho y de las biopelículas
formadas, retardando el flujo de aire y ocasionado la pérdida de la energía por la fricción
viscosa entre las diversas capas de aire. El aire debe fluir a través de la columna a una
velocidad constante, por lo que esta resistencia al flujo no disminuye la energía cinética
del aire, sino que disminuye su presión (Mitchell et al, 2006).

Caídas de presión del aire fueron estudiadas por Auria et al (1995) en la fermentación de
A. niger sobre un soporte inerte (Amberlite IRA-900) en un fermentador PBB (2 cm
diámetro interno y 8 cm de longitud de columna), determinado que la estructura sólida del
soporte no cambia con caídas de presión de 0,4 mmHg. Recientemente, en
fermentadores de 2,5 cm de diámetro y 20 cm de longitud, Karimi et al (2014)
determinaron la caída de presión máxima durante el crecimiento de A. niger sobre
salvado con valores cercanos a 80 mmbar (60 mmHg) después de 40 horas de proceso.

1.6 Monitoreo de la condiciones en los procesos SSF


A causa de que los procesos SSF involucran hasta cuatro fases, la determinación de los
parámetros del proceso son generalmente difíciles. Contrario a lo que ocurre con las
Marco teórico 23

fermentaciones sumergidas donde la concentración de la biomasa se puede monitorear


continuamente, en los procesos SSF esta medición es casi imposible. La estimación del
crecimiento de microorganismos en SSF tiene grandes dificultades, debido a que las
células permanecen sujetas al soporte y son difíciles de separar completamente. Para el
caso de hongos el problema se acentúa ya que el micelio penetra los poros del sustrato
(Pandey, 2003).

Por lo tanto, el monitoreo del crecimiento del microrganismo en SSF es generalmente


obtenido por métodos indirectos, mediante la determinación de proteínas, enzimas,
ácidos nucleicos ó glucosamina entre otras (Roussos y Gaime, 1996; Tomaselli et al,
2001). Recientemente, y en particular con fermentadores de lecho empacado la
determinación de la velocidad de O2 consumido y de CO2 generado son considerados
como los métodos más exactos para determinar el crecimiento de microorganismos en
SSF (Pandey et al, 2008). La importancia en determinar el flujo de aire de entrada radica
en que para los procesos de SSF en lechos empacados la transferencia de O 2 y calor
ocurren simultáneamente, el aire se calienta unidireccionalmente a través del lecho,
perdiendo su capacidad de enfriamiento, ocasionando gradientes de temperatura y
evaporación excesiva de la humedad contenida en el sustrato (Saucedo et al, 1990).

La medición de estos gases de salida está directamente correlacionada con las


actividades metabólicas del microrganismo y permiten determinar el rendimiento de la
fermentación. La determinación de la biomasa por métodos indirectos se ha empleado
por diferentes investigadores, como Sato et al (1983), Rodríguez et al (1986) y
Desgranges et al (1991) quienes basaron su metodología en el metabolismo respiratorio
de los microorganismos. El O2 consumido y el CO2 producido son el resultado de los
procesos metabólicos a través de los cuales los microorganismos aeróbicos obtienen la
energía necesaria para su crecimiento. Por tanto, estas actividades metabólicas están
asociadas al crecimiento del microorganismo y pueden usarse para estimar la biomasa
sintetizada. Por tal razón es posible relacionar en términos diferenciales el O 2 consumido
(dO2/dt) y el CO2 producido (dCO2/dt) tanto con el crecimiento como al mantenimiento
celular.

Estos modelos de correlación son resueltos con el uso de técnicas numéricas y la


solución de ecuaciones diferenciales. Con el empleo de computadoras y software
adecuados y cromatógrafos o analizadores de gases (CO2 y O2) acoplados a la salida de
24 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

los gases del fermentador, es posible estimar de forma continua la biomasa sintetizada y,
de esta manera, estimar el calor metabólico generado. Esta metodología a gran escala
puede aplicarse en el control de parámetros de la fermentación en un proceso industrial.
Otros parámetros que se pueden correlacionar con la actividad metabólica incluyen la
evolución del pH y la caída de presión a través del lecho (Auria et al, 1995).

1.7 Fermentación sólida con soportes inertes

A pesar del potencial de los procesos SSF, algunos aspectos físicos relacionados con la
heterogeneidad de los sustratos provocan graves limitaciones. Las desventajas de la
utilización de sustratos naturales en los procesos SSF radica principalmente en tres
aspectos: En primer lugar, el sustrato es la fuente de nutrición para el crecimiento de los
microorganismos y, al mismo tiempo, proporciona un microambiente para el crecimiento
microbiano, provocando la descomposición gradual del sustrato formando aglomerados,
de esta forma la porosidad disminuye, generando limitaciones en la transferencia de
masa y calor. Segundo, las impurezas en los sustratos se integran fácilmente en los
extractos de fermentación, lo que no beneficia la separación y purificación de los
productos. Por último, debido a la heterogeneidad del sustrato y su constante cambio se
dificulta la medición precisa y reproducible de las variables, ocasionando problemas de
control en el biorreactor y en los procedimientos de escalado (Chen, 2013).

Para superar estos problemas, es conveniente utilizar soportes que tengan propiedades
bien caracterizadas y un mínimo de interacción con la biología del proceso. La utilización
de soportes inertes contribuye a generar condiciones homogéneas en los fermentadores
asimismo a disminuir la presencia de impurezas (Aidoo et al, 1982; Nampoothiri Y
Pandey 1996). Se han reportado varias investigaciones en el campo de la fermentación
sólida utilizando soportes inertes, como el descrito por Auria et al (1995) utilizando una
resina Arberlita IRA 900 para el crecimiento de Aspergillus niger. Igualmente, la espuma
de poliureteano (PUF) fue utilizada por Fujishima et al (1972) para la producción de
enzimas por diferentes hongos. Kobayashi et al (1991) utilizaron PUF como vehículo
inerte para la producción de glucoamilasa con Aspergillus oryzae, y sugirieron que la
utilización de PUF en fermentación sólida permite alcanzar una composición del medio
controlado y un mejor proceso de separación del producto. Se ha demostrado que la
utilización de este tipo de soportes permite un mejor control del proceso, una mayor
Marco teórico 25

reproducibilidad y facilidad para el modelamiento que con los soportes naturales


(Ooijkaas et al, 2000).

1.7.1 Tipos de soportes inertes

En la actualidad, los soportes inertes utilizados en los procesos SSF se pueden dividir en
tres tipos. Los naturales, como los lignocelulosicos bagazo de caña de azúcar, cascarilla
de arroz (Mohan Kumar et al, 2013), residuos de yuca, coco, cacao y otros residuos
agrícolas (Pandey et al, 2000). Los minerales como la vermiculita y la perlita (Meyrath,
1965). Por último los sintéticos, como las resinas de intercambio iónico (Richard et al,
1990), el poliestireno (Nagendra Prabhu y Chandrasekaran, 1995), el poliuretano (Marin
et al, 2008; Lareo et al, 2006) y la silica (SiO2) (Peralta et al, 2001). En la tabla 1.2 se
resumen algunos estudios de fermentación sólida utilizando soportes inertes.

Tabla 1.2: Ejemplos de procesos SSF utilizando soportes inertes

Soporte Inerte Microorganismo Producto Referencia


Bagazo Aspergillus niger Ácido Citrico Cahn (1935)
Aspergillus niger Pectinasa Huerta et al (2004)
Penicillium chrysogeniium Penicilina Barrios et al (1993)
Vermiculita Aspergillus niger Amilasa Meyrath (1965)
Cascarilla de arroz Cladosporium sp. L-Asparaginasa Mohan Kumar et al (2013)
Poliestireno Vibrio costicola L-Glutaminasa Nagendra Prabhu (1995)
Aspergillus niger Fitasa Gautam et al (2002)
Espuma de Poliuretano Trichoderma viride Quitinasas Marin et al, (2008)
Aspergillus oryzae Proteasas alcalinas Ozawa et al (1996)
Mucor bacilliformis Esporas Lareo et al (2006)
Aspergillus terreus Lovastina Baños et al (2009)
Acetobacter xylinum Celulasas Weng y Chen (2010)
SiO2 Xerogel Aspergillus niger Esporas Peralta et al (2001)

Soporte inertes naturales

Los soportes inertes naturales son generalmente subproductos agrícolas los cuales en su
mayoría son abundantes y fáciles de manejar, siendo menos costosos que otros
sustratos utilizados en procesos SSF (Chen, 2013; Pandey, 2003). Sin embargo,
presentan algunas desventajas como la baja porosidad con insuficientes estructuras
26 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

internas que perturban la aireación, la baja remoción de calor y la captación de


nutrientes. Adicionalmente, estos soportes se pueden contaminar fácilmente. Es así
como, utilizando bagazo de caña de azúcar Marin et al (2008) encontraron problemas de
esterilización del sustrato, por problemas con el control de la temperatura.

La cascarilla de arroz

El exterior de la cascarilla de arroz se compone de elementos rectangulares dentados,


compuestos principalmente de sílice recubiertos con una gruesa cutícula. La región
central y la epidermis contienen poca sílice (Bronzeoak, 2003). Jauberthie et al (2000)
confirmaron que la presencia de sílice amorfa está concentrada en las superficies de la
cáscara de arroz y no dentro de la propia cáscara. La composición química de la
cascarilla de arroz es similar a la de muchos subproductos agrícolas e incluye celulosa
entre 40 a 50%, lignina entre 25 a 30%, cenizas entre 15 a 20% y un contenido de
humedad entre 8 y 15% (Hwang y Chandra, 1997). La cascarilla de arroz se ha utilizado
como soporte inerte en diferentes estudios SSF, como el elaborado por Ramos et al
(2008) quienes crecieron Trichoderma sp. llegando a obtener concentraciones hasta de
2,3x108 conidios/g después de 8 días de fermentación.

Soporte inertes sintéticos

Los soportes inertes sintéticos en los procesos SSF son generalmente polímeros de
síntesis química como el poliuretano, poliestireno, polietileno entre otros. Estos polímeros
tienen propiedades intrínsecas en cuanto a un alto nivel de porosidad, capacidad de
absorción de agua, permeabilidad y homogeneidad en su estructura (Chen, 2013). Las
desventajas de estos soportes radican principalmente en su costo, no obstante se puede
minimizar esta diferencia al utilizar materiales provenientes de residuos industriales.

Espuma de poliuretano

Entre los soportes inertes sintéticos comúnmente estudiados se encuentra la espuma de


poliuretano o PUF por sus siglas en inglés, la cual se ha usado como un soporte
adecuado para los procesos SSF porque presenta una alta porosidad, baja densidad, y
una relativamente alta absorción de agua. La espuma de poliuretano tiene un tamaño de
poro adecuado, que proporciona un entorno satisfactorio para el crecimiento de los
Marco teórico 27

hongos (Chen, 2013). La capacidad absorbente de la espuma de poliuretano puede ser


de hasta 20 ml/g, conteniendo pequeños poros de aproximadamente 700 micras de
diámetro, generando un área superficial especifica cercana a 4,5x103 m2/m3.

La producción de la compañía alemana PROPHYTA GmbH se estima en cerca de 150


kilogramos de sustrato por fermentador de 600 litros de capacidad. Con una capacidad
instalada de cerca de 60 fermentadores se podrían generar hasta 9 toneladas de
residuos después del proceso de cosecha. Según comunicación personal este tipo de
sustratos no es reutilizable y la mayoría de los residuos generados son usados como
activos en abonos.

1.8 El género Trichoderma sp. y los procesos SSF


Los hongos del género Trichoderma sp. son un grupo de microorganismos que habitan
naturalmente en un número importante de suelos, con abundante materia orgánica en
descomposición y altas densidades de raíces. Trichoderma sp. se encuentra
ampliamente distribuido en todo el mundo en diferentes zonas, además se suele hallar
asociado a la superficie de las plantas y cortezas de madera descompuesta, en
diferentes zonas y hábitats (Harman, 2004).

El interés científico despertado por los hongos de este género, se debe a las
características antagónicas que presentan frente a hongos fitopatógenos. Entre los
mecanismos de control referenciados para Trichoderma sp. está la competencia por
nutrientes o espacio, el micoparasitismo y la antibiosis entre otros. Estos mecanismos no
son excluyentes sino que actúan sinérgicamente en el control de los patógenos (Harman
y Kubicek, 1998; Chet et al, 1997; Belanger et al, 1995).

La producción de Trichoderma sp. a nivel industrial y semindustrial se ha propuesto


empleando diferentes sustratos sólidos como zanahoria (Castillo, 2001), bagazo de caña,
cascarilla de café, arroz o mezclas de las misma fuente de carbono. La fermentación
solida de Trichoderma sp. ha sido estudiada en diferentes escalas, en donde se ha
evaluado el tipo de sustrato, la temperatura, los efectos de luz y la oscuridad sobre la
esporulación o conidiogenis del hongo (Garcia et al, 2009). Es así como Cruz (2007)
utilizando fermentación bifásica (airlift y fermentador de bandejas) para una cepa de
Trichoderma koningiopsis (Th003) reportó concentraciones finales de 8,44x109 conidos/g
28 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

después de 9 días de fermentación. Así mismo, Cruz et al (2011) con la misma cepa de
Trichoderma sp. estudiaron su producción masiva mediante dos métodos de
fermentación sólida, el primero disponiendo el sustrato en bolsas de polietileno en
incubadas en cuarto de incubación y el segundo utilizando un fermentador de bandejas
llegando a obtener productividades de 4.70x106 conidios/g.h y 1,42x107 conidios/g.h
respectivamente.

1.8.1 Trichoderma asperellum Th204

La especie Trichoderma asperellum ha recibido considerable atención de la investigación


en cuanto a su potencial como un agente de control biológico (Tipán, 2013; Carvajal et al,
2008). En particular, la cepa T. asperellum Th204 ha demostrado características
biológicas de interés como solubilización de fósforo y promoción de crecimiento en
plantas. Sin embargo, en la planta de bioproductos de Corpoica la propagación de T.
asperellum Th204 se realiza mediante SSF, utilizando sustratos naturales a base de
arroz, dispuestos en bandejas perforadas que son inoculadas e incubadas en cuartos
calientes o fermentadores de bandejas. Sin embargo, las limitantes en el control del
proceso, hacen que el uso de este tipo de sistemas de fermentación conduzca a lotes
heterogéneos y por tanto con baja repetibilidad y reproducibilidad (Cruz et al, 2011; Cruz,
2007).
2. Materiales y métodos

2.1 Equipo utilizado: Fermentador PROPHYTA® L05


Fermentador sólido diseñado por la multinacional alemana PROPHYTA® GmbH modelo
L05 (United States Patent 6620614) construido en acero inoxidable con dimensiones de
68 cm de altura, 25 cm de ancho y 25 cm de profundidad.

El fermentador cuenta con cuatro niveles para soportar el sustrato, cada uno con un
serpentín de dos brazos para enfriamiento o calentamiento utilizando un baño
termostático externo para controlar la temperatura. Adicionalmente, en la parte inferior
cuenta con distribuidor de aire rectangular y un soporte para un material humidificador
(Figura 2.1). En el exterior posee líneas con sistemas de filtración Sartorious de 0,2 µm
para la alimentación de agua y aire. La inoculación del sustrato se realizó por inyección
desde la parte superior utilizando una bomba peristáltica Heidolph 8314. El cierre del
fermentador se realizó desde la parte superior mediante el ajuste de cuatro clavijas y
empaques siliconados. El fermentador PROPHYTA® L05 permitió un monitoreo de las
condiciones de procesos SSF, tales como la temperatura usando puertos para
termocuplas al interior de cada nivel. Por otra parte, mediante instrumentación externa se
adecuó el fermentador para la determinación de la composición y el registro de los gases
de salida en tiempo real (Figura 2.1).

2.2 Microorganismo
La cepa del hongo de estudio T. asperellum Th204 fue suministrada por el Banco de
Germoplasma de microorganismos con interés en control biológico de CORPOICA. Las
cepa se crioconservó a -70+/-2°C. El hongo se mantuvo en cajas Petri con medio agar
papa dextrosa (PDA) y se incubó a 25±2ºC por 7 días. Las cajas Petri con el hongo
esporulado se utilizaron en la preparación de las suspensiones de conidios que sirvieron
como inóculos.
30 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

Figura 2.1: Esquema del fermentador de lecho fijo PROPHYTA® L05

2.3 Determinación del soporte de crecimiento y los


factores que tiene mayor efecto sobre la producción
de T. asperellum Th204 en el fermentador de lecho
fijo PROPHYTA® L05

2.3.1 Preparación del inóculo


A partir de cultivos en medio PDA con el hongo esporulado, se removieron los conidios
mediante la adición de 10 mL de Tween 80 al 0,1% (v/v). La suspensión de conidios
obtenida se dispuso en un frasco Falcon estéril, para luego homogeneizarla en un
agitador vibratorio Vortex durante 30 segundos. A partir de esta suspensión (1x108
conidio/mL) se realizaron las diluciones requeridas para obtener 2 litros de inóculo en las
concentraciones a evaluar (107 y 108 conidios/mL). Las concentraciones se determinaron
mediante el recuento en cámara de NeuBauer (16 celdas por triplicado) (Bastidas, 2013).

2.3.2 Preparación del soporte inerte y de la suspensión nutritiva


Soporte 1: Espuma de poliuretano:

Se utilizó espuma de poliuretano flexible de origen comercial (Espumas Santafé), de 40 y


50 ppi (poros por pulgada). La espuma fue cortada en cubos de 2 cm de arista
Materiales y métodos 31

aproximadamente. Según la altura del lecho a evaluar 5 cm o 8 cm se utilizaron 25 o 30


gramos de espuma seca previamente cortada respectivamente.

Soporte 2: Cascarilla de arroz:

Se utilizó cascarilla de arroz cruda proveniente de Cascarillas de Colombia con un


tamaño de partícula entre 0,5 y 12 mm.

Preparación de la suspensión nutritiva

La suspensión nutritiva se utilizó para humectar el soporte inerte a razón de un litro de


suspensión por nivel en el fermentador PROPHYTA® L05. Para la preparación de la
suspensión nutritiva como fuente principal de carbono se utilizó puré de papa en polvo de
origen comercial marca VanGuy y extracto de levadura Tecna como fuente de nitrógeno.

En función de la relación C/N a evaluar se pesaron las cantidades requeridas de puré de


papa en polvo y de extracto de levadura. Los dos componentes fueron suspendidos en 4
litros de agua y homogeneizados utilizando un emulsificador industrial DYNAMIC a 300
rpm durante 5 minutos. El pH inicial de la suspensión para todos los tratamientos
experimentales se mantuvo constante en 5,5 ± 0,3.

2.3.3 Adecuación del fermentador PROPHYTA® L05


En soporte inferior debajo del nivel 4 fue llenado con sepiolita seca sirviendo como filtro
por su capacidad absorbente. Una vez cargado los cuatro niveles del fermentador con el
soporte inerte humectado con la suspensión nutritiva, se procedió a cerrar el fermentador
asegurando parcialmente las clavijas de seguridad de la cubierta. Posteriormente, se
acopló una manguera siliconada de un cuarto de pulgada (Masterflex®), la cual se utilizó
para la operación de inoculación, el extremo de la manguera se selló con algodón y papel
aluminio para su protección. Posteriormente, se ajustó un filtro de aire (Sartorius 0,2 µm)
a la acometida de aire de entrada, dejando las válvulas del filtro en posición de abertura
previniendo sobrepresiones en el proceso de esterilización. Finalmente, el fermentador
PROPHYTA® L05 se sometió a una operación de esterilización en una autoclave vertical
LEQUEUX (París) 863706 a 121ºC y 20 psi de presión durante 30 minutos.
32 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

2.3.4 Inoculación e incubación


Dos litros del inóculo de T. asperellum Th204 se alimentaron bajo condiciones de asepsia
al fermentador a razón de 15 L/h utilizando una bomba peristáltica Heildolph 8314. Al
finalizar la alimentación del inóculo, se adicionaron 22 litros de Tween 80 (0,1%v/v)
previamente estéril con el propósito de permitir la homogeinización del inóculo en todo el
sustrato y el ajuste de la humedad por inundación. Después de una hora la válvula
inferior de desagüe del fermentador se abrió hasta completar el vaciado. La válvula de
desagüe se cerró y la manguera de inoculación se selló con una abrazadera metálica.

Con el propósito de ajustar los niveles de la temperatura de incubación a evaluar se


utilizó un baño termostático MEMMERT WNB 7. El agua del baño (7 litros) se ajustó a
30°C y 36°C según los niveles de temperatura evaluados de 23°C y 28°C
respectivamente (Tabla 2.1). Los niveles de la temperatura de fermentación se
controlaron con un flujo de agua proveniente del baño termostático utilizando una bomba
sumergible Evans12W que alimentó continuamente los serpentines del fermentador a
razón de 1,5 L/min. De esta forma, el agua de calentamiento circuló continuamente en un
circuito cerrado entre el baño termostático y el fermentador.

Por último, se acopló la línea de aire al sistema de filtración y humidificación (Erlenmeyer


con desprendimiento lateral) y se ajustó con un rotámetro el caudal de aire a evaluar. El
fermentador PROPHYTA® L05 se mantuvo cerrado con suministro continuo de aire por
el tiempo de fermentación definido (7 días).

2.3.5 Diseño experimental para la selección del soporte sólido y


determinación de los factores críticos (efectos fijos)
El diseño experimental utilizado fue fraccionado 1/16 con siete factores evaluados a dos
niveles cada uno, nivel alto (1) y nivel bajo (-1) con resolución III y dos repeticiones en el
punto central (C1-C2). Los factores a evaluar fueron: El soporte inerte sólido (A), la
relación C/N de la suspensión de nutrientes (B), la relación de inoculación (C), la
humedad del aire entrante (D), la temperatura de incubación (E), la altura del lecho del
sustrato (F) y el caudal de aire entrante (G) (Tabla 2.1). En total, el experimento consistió
en la evaluación de 10 tratamientos experimentales y un control positivo (E1) utilizando el
medio de cultivo estándar para la producción de otras cepas de Trichoderma sp. en la
Materiales y métodos 33

planta de bioproductos de CORPOICA (Tabla 2.2). Las variables de respuesta en cada


tratamiento fueron la productividad medida como los conidios producidos de Th204 por
gramo seco de sustrato por hora (conidios/g.s.h) después de 7 días de fermentación, el
contenido de humedad final del sustrato, la evolución de la producción de CO2 (ppm) y
consumo de O2 (%v/v) , la velocidad específica máxima de crecimiento (µmax, h-1), la
temperatura de tres niveles (°C), y la caída de presión (mmHg) a través del lecho del
sustrato.

Tabla 2.1: Factores y niveles evaluados en la fermentación sólida de T. asperellum


Th204

Nivel

Código Factor -1 1

A Soporte sólido CA* EP*

B Relación C/N 6 8

C Relación de inoculación (conidios/g seco) 107 108

D Humedad del aire (%) 15 95

E Temperatura (°C) 23 28

F Altura de lecho (cm) 5 8

G Flujo de aire entrante (m3/h) 0,42 1,13

*C.A (Cascarilla de arroz); E.P (Espuma de poliuretano).

Tabla 2.2: Tratamientos evaluados para la producción de T. asperellum Th204 (Diseño


experimental fraccionado 1/16-Efectos fijos).

Soporte C/N Inóculo Humedad Temperatura Altura Caudal


Tratamiento
del aire (°C) del de aire
3
(%) lecho (m /h)
(cm)
T1 Espuma 8 -1 95 23 8 1,13
T2 Espuma 8 -1 15 28 5 1,13
T3 Espuma 6 1 15 23 8 0,42
T4 Cascarilla 6 1 95 23 5 1,13
T5 Espuma 6 1 95 28 5 0,42
T6 Cascarilla 6 -1 95 28 8 0,42
34 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

T7 Cascarilla 8 1 15 28 8 1,13
T8 Cascarilla 8 -1 15 23 5 0,42
C1 Cascarilla 7 0 95 25 7 0,77
C2 Espuma 7 0 95 25 7 0,77
E1 Arroz 1 -1 95 28 8 1,13

 Determinación de la productividad
Una vez terminado el tiempo de fermentación, el sustrato crecido con Th204 se sometió a
un lavado con Tween 80 (0,1%v/v) en una relación 2:1 (Tween:Soporte) utilizando una
batidora Oster 2612-012 durante 5 minutos. Al extracto resultante se le determinó la
concentración de conidios por recuento en cámara de Neubauer (Bastidas, 2013). Esta
concentración del extracto se utilizó para determinar los valores de productividad de cada
tratamiento en términos de conidios producidos por gramo de sustrato seco inicial por
hora (conidios/g.s.h). El sustrato seco se determinó como la suma de los pesos del
soporte seco (espuma-cascarilla) y los nutrimentos (puré de papa y extracto de levadura).

 Determinación del contenido de humedad


Al inicio (tiempo cero) y al finalizar el tiempo de fermentación definido (7 días), se
tomaron tres muestras de 1 g del soporte sólido en cada nivel para determinar el
contenido de humedad utilizando una balanza Kern MLS-50. Los resultados se
sometieron a un análisis de varianza (ANOVA), prueba de homogeneidad de varianzas
(Test de Bartlett), normalidad (Test de Shapiro-Wilk) y comparación de medias (Tukey
α=0,05). Cuando algunos de los supuestos no se cumplió los datos se sometieron a una
prueba no paramétrica de Kruskall-Wallis (α=0,05).

 Monitoreo de consumo de O2 y producción de CO2


El monitoreo de la concentración de O2 (%v/v) a la salida del fermentador se realizó
utilizando un sensor Ox-01 tomando en promedio 4 lecturas por día.

Para cada tratamiento de fermentación, se monitoreó la concentración del CO 2 (ppm) de


la corriente de aire de salida, la temperatura (°C) y la humedad del aire (%) mediante un
datalogger CO2 EXTECH CO210. Con los datos obtenidos de respirometría de CO2 cada
Materiales y métodos 35

20 minutos se estimaron las velocidades de producción medidas en miligramos de CO2


por gramo de soporte por hora (mg CO2/g soporte.h). Adicionalmente, se estimó para
cada tratamiento la velocidad específica máxima de crecimiento de T. asperellum Th204
(Figura 2.1).

Determinación de la velocidad especifica máxima de crecimiento

En función de los resultados de respirometría para el crecimiento de T. asperellum Th204


en el fermentador PROPHYTA® L05 se utilizó el modelo logístico de crecimiento
(Ecuaciones 2.1 y 2.2).

dX 1 X 
 X   (2.1)
dt  X max 

Xm (2.2)
X 
 X  
1   m   1 e  t
 X 0  

Donde  es la velocidad específica de crecimiento (h-1), Xm y Xo la concentración de


biomasa máxima e inicial respectivamente medida en kg biomasa seca por kg de sustrato
seco (kg X /kgs.s).

Siguiendo el método descrito por Gelmi et al (2000) las velocidades específicas máximas
de crecimiento para T. asperellum Th204 se estimaron utilizando los resultados de
respirometría específicamente los de producción de CO2. En todos los tratamientos cada
20 minutos se determinó la concentración de CO2 medida como los gramos de CO2
acumulados producidos por gramo de sustrato seco. Tomando el logaritmo natural de la
concentración de CO2 y graficándola en función del tiempo se determinó la pendiente
(intervalo de mayor pendiente, 20-40 horas aproximadamente) siendo esta la velocidad
especifica máxima de crecimiento (h-1).

 Monitoreo de la Temperatura
El monitoreo de la temperatura al interior del fermentador se realizó en tres niveles
(niveles 1, 2 y 4) tomando una lectura cada 20 minutos utilizando un datalogger TESTO
AG 735-2 (Figura 2.1). Se determinó el gradiente de temperatura axial (promedio y
36 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

máximo) como la relación entre la diferencia entre las temperaturas del nivel 1 (superior)
y el nivel 4 (inferior) y la altura del lecho (cm).

 Caída de Presión
De la misma forma para cada tratamiento de fermentación, se midió la caída de presión
cada 20 minutos mediante la adecuación de un manómetro diferencial EXTECH HD755
de 0,5 psi entre la entrada (inferior) y salida (superior) de la corriente del aire del
biorreactor (Figura 2.1).

Los resultados obtenidos se sometieron a un análisis de normalidad de Shapiro-Wilk y de


homogeneidad de varianza. Se ajustó un modelo lineal de los efectos, así mismo se
analizaron gráficamente los efectos mediante diagramas de Pareto para determinar la
significancia de los factores. El análisis de resultados permitió evidenciar que soporte
sólido es mejor en comparación con el otro, en función de la productividad final
alcanzada (conidios/g.s.h), la velocidad específica máxima de crecimiento, la presencia
de gradientes de humedad del lecho, de temperatura axial y la caída de presión.
Adicionalmente, se seleccionaron los dos factores críticos (X1, X2) diferentes al soporte
inerte con mayor influencia positiva o negativa según el grado del efecto sobre la variable
respuesta productividad de Th204.

2.4 Generación de un modelo de productividad de T.


asperellum Th204

2.4.1 Diseño experimental utilizando los factores críticos

Para la generación de un modelo de respuesta de la concentración final de T. asperellum


Th204 en función de los factores críticos seleccionados (X1, X2), se realizó un diseño
factorial compuesto central con tres repeticiones en el punto central, definiendo un
espacio experimental rotacional con 11 tratamientos en el fermentador PROPHYTA® L05
(Tabla 2.3).
Materiales y métodos 37

Tabla 2.3: Niveles de los factores críticos (X1, X2) en los tratamientos evaluados en la
fermentación sólida de T. asperellum Th204 (Diseño de experimentos Central
Compuesto)

Tratamiento X1 X2

1 -1 -1

2 -1 1

3 1 -1

4 1 1

5 -1.4142 0

6 1.4142 0

7 0 1.4142

8 0 -1.4142

9 0 0

10 0 0

11 0 0

Las repeticiones en el punto central permitieron determinar el error experimental.

Se mantuvieron como variables respuesta en cada tratamiento: La productividad final de


Th204 (conidios/g.s.h), la velocidad especifica máxima de crecimiento (Gelmi et al, 2000),
el contenido de humedad final del soporte (gradiente de humedad relativo), la
temperatura entre niveles (gradiente de temperatura axial promedio) y la caída de presión
(caída de presión relativo) a través del lecho del sustrato.

Utilizando el software STATGRAPHICS Centurion XVI.II se ajustó un modelo de segundo


orden para la productividad de Th204 (conidios/g.s.h) en función de los factores X1 y X2.
Con el modelo encontrado se determinó una relación óptima de X1 y X2 maximizando la
productividad.

El gradiente de humedad del lecho al finalizar la fermentación se determinó como la


diferencia de contenido de humedad del lecho entre el nivel 1 y el nivel 4, siguiendo la
metodología descrita previamente en el numeral 2.3.5.

El gradiente de temperatura axial del fermentador se determinó como el valor promedio


de la diferencia de temperatura entre el nivel 1 y el nivel 4 registrada cada 20 minutos. Se
38 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

utilizó el datalogger TESTO AG 735-2 para el registro de la temperatura del lecho entre
niveles.

La caída de presión relativa se determinó tomando como base la presión de aire entrante
en cada fermentación. La variable se expresó como porcentaje (caída de presión
máxima/ presión entrante). Tanto la presión del aire entrante como la caída de presión
del aire a través del lecho se determinaron con el manómetro diferencial EXTECH
HD755.

El gradiente de concentración relativo se determinó para los logaritmos de las


concentraciones en base seca de T. asperellum Th204 entre los niveles 1 y 4 en relación
al nivel 1 expresada como porcentaje.

Por último, los resultados de los gradientes de temperatura axial, de humedad del lecho,
de concentración relativa y de caída de presión relativa, se analizaron mediante
diagramas de Pareto (significancia α=0,05) y superficies de respuesta.

2.4.2 Validación del modelo estadístico


El punto óptimo generado para la productividad en el diseño central compuesto se validó
mediante 3 fermentaciones manteniendo los demás factores en los niveles que
favorecieron el crecimiento de Th204. Al finalizar del tiempo de cada fermentación se
determinó la productividad (numeral 2.3.5) y se calculó su ajuste con el valor de
productividad óptimo encontrado con el diseño. El ajuste se determinó como la relación
porcentual entre la productividad experimental y la óptima teórica esperada.
3. Resultados y discusión

3.1 Determinación del soporte de crecimiento y los


factores que tienen mayor efecto sobre la producción
de T. asperellum Th204 en el fermentador de lecho
fijo PROPHYTA® L05
Con el análisis elemental de la suspensión nutritiva se determinó que el puré de papa
contiene un 39,23% de carbono y un 1,30% de nitrógeno. Para el caso del extracto de
levadura se determinó un contenido de carbono y nitrógeno de 36,40% y 11,28%
respectivamente (Anexo A). Estos valores permitieron ajustar con mayor exactitud la
relación Carbono/Nitrógeno (C/N) requeridas en los diferentes tratamientos. El nivel C/N
de 8 se ajustó en la suspensión nutritiva utilizando 250 g de puré de papa y 125 g de
extracto de levadura. Por otro lado, la relación C/N de 6, se ajustó con 250 g tanto para el
puré de papa como para el extracto de levadura.

Después de llevar a cabo las fermentaciones propuestas en el diseño experimental


fraccionado (1/16) con dos repeticiones en el punto central C1 y C2, se pudo evidenciar
que con el soporte espuma de poliuretano se obtuvieron las mayores productividades
expresadas en conidios producidos por gramo de sustrato seco por hora (conidios/g.s.h)
después de 7 días de fermentación en comparación al soporte cascarilla de arroz y al
sustrato control (E1) (Tabla 3.1). El diagrama de Pareto de la la figura 3.1 expone solo los
efectos principales de los factores, en donde se evidencia que los factores con mayor
incidencia positiva y significativa sobre la variable respuesta (Logaritmo de la
productividad) son el soporte inerte (P=0,0094), el caudal de aire (P=0,0411) y la
relación C/N (P=0,0296) (Anexo B). Los factores humedad del aire y temperatura de
incubación tambien tienen un efecto positivo sobre la productividad de Th204, aunque
estos efectos no fueron significativos en el espacio experimental evaluado.
40 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

Tabla 3.1: Productividad de T. asperellum Th204 (conidios/g.s.h) después de 7 días


(Diseño fraccionado 1/16).
C1 y C2. Fermentaciones en el punto central, E1 Tratamiento sustrato control

Tratamiento Soporte C/N Inóculo Humedad Temperatura Altura Caudal Productividad Log
del aire (°C) del del aire (Conidios/g.s.h) (Prod.)
3
(%) lecho (m /h)
(cm)
7
T1 Espuma 8 -1 95 23 8 1,13 1,96x10 7,29
7
T2 Espuma 8 -1 15 28 5 1,13 2,57x10 7,41
5
T3 Espuma 6 1 15 23 8 0,42 9,38 x10 5,97
6
T4 Cascarilla 6 1 95 23 5 1,13 1,61x10 6,21
6
T5 Espuma 6 1 95 28 5 0,42 2,88x10 6,46
5
T6 Cascarilla 6 -1 95 28 8 0,42 9,35x10 5,97
6
T7 Cascarilla 8 1 15 28 8 1,13 2,83x10 6,45
6
T8 Cascarilla 8 -1 15 23 5 0,42 2,65x10 6,42
6
C1 Cascarilla 7 0 95 25 7 0,77 2,75x10 6,44
6
C2 Espuma 7 0 95 25 7 0,77 7,08x10 6,85
6
E1 Arroz 1 -1 95 28 8 1,13 8,87x10 6,95

Figura 3.1: Diagrama de Pareto para los 7 factores evaluados, determinación de efectos
fijos (Diseño fraccionado 1/16)
Resultados y discusión 41

El modelo y los resultados tuvieron un alto grado de ajuste con un valor de R2 de 0,9754,
un valor de regresión relativamente alto para este tipo de procesos multivariable. De esta
forma se puede inferir que más del 97% de la variabilidad del sistema en el espacio
experimental evaluado se podría modelar con los 7 factores evaluados, dejando menos
de un 3% al error aleatorio y experimental. A continuación se presenta la ecuación
ajustada del modelo para la variable Log (productividad) en función de los 7 factores
evaluados.

Log (Productividad) = 4,1016 + 0,248*soporte + 0,259153*C/N - 0,108716*inóculo +


0,00281029*humedad de aire + 0,0186098*Temperatura - 0,0650273*Altura del lecho +
0,495941*Caudal de aire
En esta ecuación, los valores de las variables se encuentran especificados en sus
unidades originales, excepto para
2 el factor relación de inoculación (-1; 1) y el factor
R (ajustada por g.l.) = 97,61%
categórico (Soporte) que toma valores de –1 (cascarilla) para el nivel bajo y +1 (espuma)
para el nivel alto.

 Efecto del soporte inerte

El efecto significativo del soporte inerte sobre la productividad de T. asperellum Th204


podría radicar en dos aspectos como son la porosidad y la capacidad de retención del
agua. Para el caso de las espuma de poliuretano diversos estudios han demostrado
valores relativamente altos de retención de agua entre 20 y 30 mL/g y porosidades de
partícula superiores a 0,912 (Marin et al. 2008), mientras que para la cascarilla de arroz
la capacidad de retención de agua es baja con valores entre 0,4 y 0,92 mL/g (Saenz y
Calderon, 2001) y una porosidad aparente del lecho de 0,6 (Srinives et al, 2010).

Según Marin et al (2008) la capacidad de retención de agua de la espuma de poliuretano


mantendría los valores de aw entre 0,985 y 0,999 condiciones favorables para el
crecimiento de los hongos. Es así como, menores cantidades de agua retenida para el
caso de la cascarilla de arroz podrían haber ocasionado inicialmente rápidas velocidades
de evaporación ocasionando disminución en las actividades de agua (aw), gradientes de
humedad y gradientes de temperatura, aspectos altamente desfavorables para el
crecimiento y la esporulación de T. asperellum Th204. Adicionalmente, una mayor
densidad del lecho, con menor porosidad aparente ocasionaría menores transferencias
de O2 y desorción de CO2 (Mitchell et al, 2006; Chen, 2013).
42 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

Por otro lado, los soportes en procesos SSF tienen en su mayoría una estructura porosa
con una gran área superficial, entre 103-106 m2/cm3 (Chen Y Xu, 2004), para el caso de la
espuma de poliuretano usada en la fermentación de Th204, con una distribución de
cubos de 2 cm3 y utilizando las medidas a nivel micro, se estimó esta relación en 6x104
m2/cm3 estando en los promedios reportados para soportes inertes, favoreciendo los
fenómenos de transferencia en general (Chen, 2013).

Según los descrito por Oostra et al (2001) y citado por Barrios (2012) se distinguen tres
capas de micelio para hongos filamentosos en procesos SSF. En primer lugar una
biopelícula de hifas que cubren las superficies de las paredes del soporte con un alto
contenido de humedad (poros capilares). Diversos autores han descrito esta capa como
la capa crítica en donde el oxígeno y los nutrimentos deben ingresar, siendo el principal
lugar para los fenómenos de transferencia de masa (Thibault, et al, 2000; Mitchell et al,
2000). En segundo lugar, las hifas aéreas las cuales se encuentran en mayor contacto
con la fase de gas, siendo importante para la colonización de otras zonas dentro de la
matriz (poros de ventilación). Por último, las hifas penetrativas con capacidad para
colonizar al interior del soporte y asimilar los nutrimentos.

El buen crecimiento de T. asperellum Th204 sobre la espuma de poliuretano sugiere que


esta matriz provee microambientes favorables para la solubilización del oxígeno y la
disponibilidad de nutrientes para el crecimiento del hongo, resultados similares
encontrados por Rodríguez et al (1997).

En la figura 3.2 se evidencia el crecimiento a nivel micro de la cepa Th204 sobre el


soporte espuma de poliuretano, en donde se puede observar la presencia de la tensión
superficial del agua en los poros de la espuma, el crecimiento de Th204 sobre las
paredes y en la película de agua con fracciones de gas disueltas (Figura 3.2 A-B). No
obstante, se ha descrito que una alta tensión superficial impediría la elongación de las
hifas para los hongos aeróbicos como T. asperellum causado por una baja solubilidad del
oxígeno, siendo la tasa de difusión de oxígeno en el agua aproximadamente 10000 veces
menor que en el aire, por lo que la tensión de la película de agua se convertiría en el
principal factor limitante que afectaría la extensión del micelio (Chen, 2013). Este
fenómeno se podría haber presentado en el tratamiento T3 para el cual se obtuvieron los
menores valores de productividad.
Resultados y discusión 43

Figura 3.2: Detalle a nivel micro (10X) del crecimiento de T. asperellum Th204 sobre el
soporte espuma de poliuretano

(A) Detalle crecimiento en EP (B) Detalle crecimiento y tensión superficial

(C) Detalle dimensiones del poro en EP (D) Detalle longitud paredes de EP

Utilizando un microscopio AXIO Lab. A1 de campo oscuro se determinaron las


dimensiones del poro pentagonal de la espuma. De esta forma la espuma de poliuretano
evaluada se podría considerar como un panal de polímero con paredes entre 140 y 300
µm de grosor y perímetros entre 4000 y 5100 µm (Figura 3.2 C-D), estando clasificados
estos poros como tanto capilares (menor a 200 µm) como de ventilación (mayores a 200
µm) según los descrito por Chen (2013). La presencia de poros de ventilación podría
haber favorecido la elongación de las hifas de T. asperellum Th204 al interior de la
partícula de espuma, en zonas con oxígeno disuelto permitiendo la asimilación de parte
de los nutrimentos absorbidos.
44 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

En contraste a lo observado con la espuma de poliuretano en cuanto a la absorción de


los nutrimentos, en la cascarilla de arroz la mayor cantidad de agua con los nutrimentos
suspendidos y disueltos se encontraría en la superficie de la partícula de cascarilla, ya
que a pesar de que se ha reportado que el 54% de la cascarilla como partícula es
porosa, estos poros se encuentran cerrados a bajas temperaturas para las fuerzas
capilares (Kaupp, 1987) y se podría clasificar como poros inactivos según lo descrito por
Chen (2013). Es así como, en la figura 3.3 se observa el crecimiento de Th204 a nivel
micro sobre la cascarilla de arroz, en donde se puede distinguir la naturaleza rígida de la
cascarilla recubierta con una gruesa cutícula, con un exterior compuesto por elementos
rectangulares y dentados (aprox. 200 µm), que según Bronzeoak (2003) y Jauberthie et
al (2000) están compuestos principalmente de sílice.

De esta forma se podría inferir que el crecimiento de T. asperellum Th204 fue


predominantemente sobre la superficie de la cascarilla como partícula con una baja
presencia de elongación de las hifas del hongo al interior, causadas posiblemente por las
condiciones de hipoxia dentro de las partícula ya que generalmente el oxígeno presenta
bajas concentraciones en soportes sólidos en profundidades mayores a 100 micras
(Chen, 2013).

Figura 3.3: Detalle a nivel micro (10X) del crecimiento de T. asperellum Th204 sobre el
soporte cascarilla de arroz

 Efecto del caudal de aire


Por otro lado, el caudal de aire entrante en los fermentadores de lecho empacado ha sido
encontrado anteriormente como determinante en el proceso fermentativo SSF, estando
Resultados y discusión 45

directamente relacionado con las velocidades de transferencia (agua, oxígeno, dióxido de


carbono) y calor por convección y evaporación (Mitchell et al, 2006; Durand, 2003;
Gowthaman et al, 1993).

 Efecto de la relación C/N


El efecto de la relación C/N en los procesos SSF ha sido levemente estudiado en
comparación a los procesos SmF, sin embargo se sabe que la relación C/N es un factor
determinante en el desarrollo y esporulación del hongo durante la fermentación (Elson et
al, 1998), es así como Gao y Liu (2009) para el caso de Trichoderma viride TV-1
formularon un amplio intervalo de crecimiento para relaciones C/N y sugirieron que el
crecimiento de la cepa de Trichoderma se ve más afectada por la relación C/N que por
las concentraciones de C y N independientes. De esta forma varios estudios se han
centrado en la optimización de la relación C/N en procesos SSF (Santos et al, 2012; Shi
et al, 2009).

 Efecto de la altura del lecho y relación de inoculación


Por otra parte, para los factores altura del lecho y la relación de inoculación el diagrama
de Pareto determinó un efecto negativo sobre la productividad de Th204, aunque estos
efectos no fueron estadísticamente significativos (Figura 3.1, Anexo B). La altura de lecho
se ha descrito como determinante sobre los fenómenos de transferencia de calor
principalmente en el retiro del calor metabólico y la generación de gradientes de
temperatura. Es así como varios autores han determinado en los fermentadores de lecho
empacado que a mayor altura de lecho el incremento en la temperatura a la salida del
fermentador disminuye el comportamiento favorable del biorreactor (Fanaei y Vaziri,
2008).

En cuanto a la relación de inoculación, los resultados sugirieron que una relación más
cercana a 1,0x107 que a 1,0x108 conidios/g seco sería más favorable para el crecimiento
del hongo, siendo consistente con los reportado por Raimbault (1980) y citado por
Roussos y Gaime (1996) quien determinó para una cepa de Trichoderma harzianum un
tasa de inoculación óptima de 2,0 x107 conidios/g seco en un proceso SSF.
46 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

3.1.1 Productividad
La mayores productividades para el crecimiento de T. asperellum Th204 se obtuvieron
con los tratamientos de espuma T2 y T1 con valores de 2,57x107 y 1,96x107
respectivamente, siendo considerablemente superiores al valor encontrado con el
sustrato control de 8,87x106 conidios/g.s.h (Tabla 3.1).

Figura 3.4: Detalle del crecimiento de T. asperellum Th204 en el soporte espuma de


poliuretano (Fotografías tomadas al nivel superior del fermentador)

(T2)
(T1)

(T3) (T5)

En la figura 3.4 se muestra el crecimiento de T. asperellum Th204 en los tratamientos


con espuma de poliuretano, en donde se evidencian los mejores resultados para T1 y T2,
con productividades mayores a 1,0x107 conidios/g.s.h. Para estas fermentaciones, se
observa el crecimiento uniforme de T. asperellum Th204 en todo el soporte con un
característico color verde que indica la esporulación del hongo. Por otro lado, se observa
para T3 y T5 un crecimiento parcial y heterogéneo del hongo, encontrándose para el
tratamiento T3 la menor productividad con un valor de 9,38x105 conidios/g.s.h.

Para el caso del soporte inerte natural cascarilla de arroz, las productividades fueron
cercanas entre sí, con valores desde 1,61x106 conidios/g.s.h (T4) al mayor valor para el
tratamiento T7 con 2,83 x106 conidios/g.s.h. Sin embargo, en todos los casos se observó
que la colonización no fue completa en toda la matriz (Tabla 3.1; Figura 3.5).
Resultados y discusión 47

Figura 3.5: Detalle del crecimiento de T. asperellum Th204 en el soporte Cascarilla de


arroz (Fotografías tomadas al primer nivel del fermentador)

(T4)
(T6)

(T8)
(T7)

3.1.2 Contenido de humedad en el lecho


Las humedades iniciales de los soportes espuma de poliuretano y cascarilla de arroz
antes de los procesos de fermentación se determinaron en promedio en 97,5% y 76,9%
respectivamente. Al finalizar el día 7 de fermentación el contenido final de humedad de
los soportes se determinó para cada nivel. Los resultados evidenciaron que se
presentaron pérdidas en el contenido de humedad en ambos soportes en las condiciones
evaluadas, siendo mayores con el soporte cascarilla de arroz.

La mayor pérdida de humedad entre los tratamientos de espuma de poliuretano se


determinó en 10,23% para el tratamiento T2, mientras que para la cascarilla de arroz la
mayor pérdida de humedad fue de 32,1% para el caso del tratamiento T7 (Figura 3.6 y
3.7). A pesar de que muchos factores cambiaron entre tratamientos, se podría inferir que
una combinación de flujo de aire en el nivel superior (1,13 m3/h), un contenido de
humedad del aire inferior (15%) y una temperatura de 28°C, favorecerían la capacidad de
48 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

del aire para arrastrar el agua presente en el lecho, fenómeno que se observó en los
tratamientos T2 y T7.

Figura 3.6: Contenido final de humedad de la espuma de poliuretano en las corridas del
diseño (1/16)

El análisis estadístico permitió encontrar que para todos los tratamientos en espuma de
poliuretano (T1, T2, T3, T5 y C2) existió una diferencia significativa en comparación con
la humedad inicial (T1:P=0,0001; T2:P=0,0035; T3:P=0,0036; T5:P=0,0036 y
C2:P=0.0205 α=0,05), mientras que no existieron diferencias entre los contenidos de
humedad del sustrato entre niveles (T1:P=0,199; T2:P=0,0698; T3:P=0,1087;
T5:P=0,1027; C2:P=0.0821; α=0,05) (Figura 3.6).

En contraste a lo encontrado en los tratamientos con espuma, para los tratamientos


llevados a cabo en cascarilla de arroz se encontraron diferencias significativas en los
contenidos de humedad entre niveles, así como con entre éstos y el contenido de
humedad inicial. Es así como tanto para T4, T7 y C1 se determinaron diferencias
significativas entre niveles (T4:P=0,0152; T7:P=0,0328; C1:P=0.0398: α=0,05)
observandose diferencias superiores al 20% entre el nivel 1 (superior) y el nivel 4
(inferior).
Resultados y discusión 49

Por otro lado, para los tratamientos T6, y T8 no se encontraron diferencias significativas
entre niveles para el contenido de humedad final del sustrato (T6: P=0,0556; T8:
P=0,1457; α=0,05) ( Figura 3.7).

Aunque entre los tratamientos T6 y T8 variaron otros factores, se podría inferir que el
flujo de aire entrante relativamente pequeño de 0,42 m3/h podría haber influido en la
homogeneidad encontrada en el contenido de humedad final del sustrato, en contraste
con los tratamientos T4 y T7 para los cuales el flujo de aire fue superior con 1,13 m3/h
(Tabla 3.1).

Figura 3.7: Contenido final de humedad de la cascarilla de arroz en las corridas del
diseño (1/16)

3.1.3 Producción de CO2


Analizando los perfiles de CO2 producidos para los tratamientos llevados a cabo con
espuma de poliuretano se evidenció que se presentaron los mayores picos de producción
para las fermentaciones T1, T2 y C2 para las cuales se alcanzaron concentraciones
superiores a los 2000 ppm de CO2 con valores máximos de 2170, 2780 y 2283 ppm
respectivamente (Figura 3.8). Por otro lado, para los tratamientos T3 y T5 la producción
de CO2 y los rendimientos fueron relativamente bajos con valores máximos de 1260 y
1130 ppm. Adicionalmente, las velocidades máximas de producción de CO2 fueron de
50 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

15,12, 23,01, 4,22, 6,35 y 13,17 mg CO2/g soporte.h para los tratamientos T1, T2, T3, T5
y C2 respectivamente.

Los resultados de producción de CO2 y de productividad encontrados permitieron


evidenciar una relación directa y proporcional, es así como en los tratamientos con los
mayores valores tanto de concentración y como de velocidad de producción de CO2, T1,
T2 y C2 se encontraron las mayores productividades con 1,96x107, 2,57x107 y 7,08x106
conidios/g.s.h respectivamente (Tabla 3.1).

Figura 3.8: Perfiles de producción de CO2 de T. asperellum Th204 en el soporte espuma


de poliuretano

Los perfiles de CO2 encontrados en las evaluaciones con cascarilla de arroz se


presentan en la figura 3.9, de igual forma a lo encontrado con espuma de poliuretano se
evidencian las mayores concentraciones de CO2 en los tratamientos con las mayores
productividades, en este caso T7, T8 y C1 con valores de 2917, 2104 y 1599 ppm
respectivamente. Por otro lado, los tratamientos con bajas productividades (T4: 1,61 x106
y T6: 9,35x105) los picos máximos de concentración de CO2 fueron relativamente bajos
con valores de 1530 y 802 ppm.

Las velocidades máximas de producción de CO2 utilizando cascarilla de arroz como


soporte fueron sustancialmente inferiores a las encontradas con el soporte espuma de
poliuretano, con valores de 0,963, 2,21, 0,745, 0,506 y 0,619 mg CO2/g soporte.h para
Resultados y discusión 51

los tratamientos T4, T6, T7, T8 y C1 respectivamente. El excesivo valor de producción de


CO2 encontrado en T6 podría radicar en una baja desorción de CO2 desde la matriz
sólida, fenómeno que se podría haber acentuado con un bajo caudal de aire y una altura
de lecho de 8 cm.

Figura 3.9: Perfiles de producción de CO2 de T. asperellum Th204 en el soporte


Cascarilla de arroz (Diseño Fraccionado 1/16)

En la figura 3.10 se muestra el perfil de CO2 generado durante la fermentación de T.


asperellum Th204 creciendo en el sustrato control estándar a base de arroz (E1), en
donde se hace evidente la mayor producción de CO2 durante el tiempo de proceso en
comparación con los soportes inertes, llegando a un valor máximo de concentración a la
salida de 9098 ppm a las 75 horas.

En general, los perfiles de producción de CO2 son similares a otros estudios


desarrollados en fermentadores de lecho fijo, con valores pico en la salida del gas del
fermentador hasta del 4% después de 20 horas de fermentación de Aspergillus niger
(Saucedo et al, 1989) o los determinados por Lareo et al (2006) quienes encontraron
velocidades de producción de CO2 hasta de 33,4 (mg CO2/ g soporte.h) después de 30
horas en la fermentación de Mucor bacilliformis sobre espuma de poliuretano.
52 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

Figura 3.10: Perfil de producción de CO2 de T. asperellum Th204 en el soporte natural a


base de arroz

 Determinación de la velocidad especifica máxima de crecimiento

Siguiendo el método descrito por Gelmi et al (2000) las velocidades específicas máximas
de crecimiento para T. asperellum Th204 se estimaron utilizando los resultados de
respirometría de CO2 (Anexo C). En la Tabla 3.2 se resumen los resultados de las
velocidades específicas de crecimiento para todos los tratamientos llevados a cabo en
los dos soportes y el sustrato control.

A pesar de que varios factores cambiaron entre tratamientos, la mayor velocidad


específica de crecimiento para T. asperellum Th204 se encontró en el tratamiento T2
(0,1631 h-1) utilizando espuma de poliuretano.

Tabla 3.2: Velocidades específicas máximas de crecimiento para los tratamientos del
diseño fraccionado (1/16)

Velocidad específica
Soporte Tratamiento máxima de
crecimiento (µmax, h-1)
T1 0,0467
Espuma de T2 0,1631
Poliuretano T3 0,0424
T5 0,0453
Resultados y discusión 53

C2 0,0781
T4 0,0863
T6 0,1027
Cascarilla de
T7 0,0756
Arroz
T8 0,1282
C1 0,0547
Natural (Arroz) E1 0,1401

3.1.4 Consumo de O2
En todos los tratamientos utilizando tanto espuma de poliuretano como cascarilla de
arroz, la evolución del oxígeno consumido se consideró poco variante, puesto que las
determinaciones estuvieron en la gran mayoría de los casos superiores a 20,5%v/v e
inclusive cercanas al 22%v/v, sugiriendo que durante las fermentaciones el oxígeno se
encontró en exceso y no fue una factor limitante. Varios estudios en fermentadores de
lecho fijo han coincidido en que la concentración de oxígeno a la salida del biorreactor
permanece en valores razonablemente altos, por encima del 18%v/v, incluso a tasas de
flujo de aire bajos (Gowthaman et al, 1993; Mitchell et al, 2006).

Los resultados de consumo de oxígeno en las fermentaciones corroboran los resultados


reportados por (Gowthaman et al, 1993), quienes determinaron para Aspergillus niger
concentraciones de oxígeno a la salida no inferiores a 19,8%v/v, utilizando flujos de aire
entre 0,9 y 1,2 m3/h. Por otro lado, Bajracharya (1980) y más recientemente Chen en
2013 reportaron que las velocidades de transferencia de oxígeno en los procesos SSF
son relativamente superiores a las encontradas en la mayoría de los procesos SmF, a
causa de una mayor relación de área interfacial por volumen de agua, haciendo más
efectiva la transferencia gas-liquido.

3.1.5 Perfiles de temperatura en fermentaciones utilizando


espuma de poliuretano
Los perfiles de temperatura encontrados en las fermentaciones con espuma de
poliuretano presentaron un comportamiento periódico cada 24 horas con temperaturas
entre 20 y 37°C, siendo similares a los hallados por Fernández y Pérez (2007) utilizando
un modelamiento real de un biorreactor (200 kg) de lecho fijo creciendo Gibberella
fujikuroi en salvado de trigo y almidón. Igualmente, la mayoría de los picos de
54 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

temperatura del lecho se encontraron entre las primeras 30 y 50 horas de fermentación,


resultados similares a otros perfiles de temperatura del lecho reportados en otros
estudios de fermentación sólida en lecho empacado (Fanaei y Vaziri, 2008; Chen et al,
2005; Mitchell et al, 1999).

Para el caso de la espuma de poliuretano, los resultados de temperatura promedio


encontrados después de los 7 días de fermentación permitieron inferir que la temperatura
se mantuvo cerca de la temperatura de evaluación. Adicionalmente, los valores de los
gradientes axiales de temperatura promedio estuvieron entre 0,028 y 0,1045 °C/cm, con
un gradiente de temperatura máximo encontrado en el tratamiento T2 de 3,65°C
(0,18°C/cm) (Tabla 3.3).

En cuanto a la fermentación T3, en donde la productividad fue la más baja utilizando


espuma de poliuretano como soporte, las temperaturas dentro de los niveles 1, 2 y 3 del
fermentador promediaron los 23,95°C, 23,96°C y 23,1°C respectivamente. Mientras que
la temperatura del aire varió entre un mínimo de 19,7°C y un máximo de 28,8°C, con un
comportamiento periódico de 24 horas (Figura 3.11 T3).

Por último, para el tratamiento T5 se encontró el mayor gradiente axial de temperatura


utilizando espuma de poliuretano como soporte, con un valor de 4,45°C (0,22°C/cm) a las
109,6 horas de fermentación. Resultados similares encontraron Gutiérrez et al (1996)
quienes determinaron para el crecimiento de Aspergillus niger sobre el soporte inerte
Amberlita en un fermentador de lecho fijo gradientes de temperatura axiales de
0,42°C/cm.

Figura 3.11: Perfiles de Temperatura: Tres niveles (1, 2,4); aire de salida para las
fermentaciones en el soporte espuma de poliuretano

T1 (23°C) T2 (28°C)
Resultados y discusión 55

T3 (23°C) T5 (28°C)

Tabla 3.3: Temperatura promedio del lecho y gradientes promedio de temperatura


axiales en las fermentaciones con espuma de poliuretano

Tratamiento Nivel Gradiente de T (°C/cm)


1 (Superior)
Promedio: 0,077°C/cm
T1 2
Max. 0,13°C/cm
4 (Inferior)
1 (Superior)
Promedio: 0,072°C/cm
T2 2
Max. 0,18°C/cm
4 (Inferior)
1 (Superior)
Promedio: 0,028°C/cm
T3 2
Max. 0,11°C/cm
4 (Inferior)
1 (Superior)
Promedio: 0,1045°C/cm
T5 2
Max. 0,22°C/cm
4 (Inferior)

La figura 3.12 demuestra que para todos los tratamientos independientemente de la


temperatura evaluado (23-28°C serie punteada) los perfiles generales de temperatura del
lecho dentro del fermentador aumentaron desde la parte inferior (Nivel 4) hacia la parte
superior (Nivel 1), adicionalmente, este análisis sugiere la presencia de un gradiente de
temperatura permanente durante del proceso. Por último, teniendo en cuenta las barras
de error se podría inferir que la temperatura del lecho dentro del fermentador su mantuvo
bajo control en función de la temperatura de incubación deseada (serie punteada) ya que
esta siempre se mantuvo dentro de las tolerancias ( ±1σ).
56 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

Figura 3.12: Perfiles de Temperatura del fermentador PROPHYTA® L05 para los
tratamientos con espuma de poliuretano (T1, T2, T3 y T5)

T1 T2

T3 T5

3.1.6 Perfiles de temperatura en fermentaciones utilizando


cascarilla de arroz
En la figura 3.13 se muestra el comportamiento de las temperaturas del lecho en los
diferentes niveles para los tratamientos con cascarilla de arroz, en donde se observa un
comportamiento similar a lo descrito para el soporte espuma de poliuretano. A pesar de
que cada tratamiento es distinto en cuanto a los valores de los otros factores, como la
humedad del aire, la relación de inoculación, la relación C/N y el flujo de aire, se puede
inferir que el comportamiento térmico del fermentador en cuanto al lecho tienen la misma
tendencia de calentamiento desde la parte inferior hacia la parte superior.

Para el tratamiento T4 las temperaturas de los niveles promediaron 24,83°C, 24,23°C y


23,07°C para los niveles 1, 2 y 4 respectivamente, con el mayor gradiente de temperatura
de 4,6°C (0,23 °C/cm) después de 50 horas de fermentación con una temperatura del
aire de salida promedio de 23,7 ± 2,05°C. Para el tratamiento T6 se encontraron los
Resultados y discusión 57

menores gradientes axiales de temperatura promedio (0,005 °C/cm) y máximo


(0,018°C/cm) indicando una relativa homogeneidad en esta variable (Tabla 3.4).

Resultados similares con otro soporte natural inerte fueron encontrados por Chen et al
(2005), quienes utilizando salvado de trigo para la fermentación de Penicillium decumbes
determinaron un gradiente máximo de temperatura de 0,12°C/cm en un lecho de 9 cm.
En otro estudio, Fanaei y Vaziri (2008) determinaron por modelamiento gradientes
axiales de temperatura superiores a 0,29°C/cm en un fermentador de lecho de 17 cm de
altura teniendo como modelo el crecimiento de Aspergillus niger.

Figura 3.13: Perfiles de Temperatura del aire de salida para las fermentaciones en el
soporte Cascarilla de arroz

T4 (23°C) T6 (28°C)

T7 (28°C) T8 (23°C)

Tabla 3.4: Temperatura promedio del lecho y gradientes promedio de temperatura en las
fermentaciones con cascarilla de arroz

Tratamiento Nivel Gradiente de T (°C/cm)


1 (Superior)
Promedio: 0,087°C/cm
T4 2
Max. 0,23°C/cm
4 (Inferior)
1 (Superior)
Promedio: 0,005°C/cm
T6 2
Max. 0,018°C/cm
4 (Inferior)
58 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

1 (Superior)
Promedio: 0,14°C/cm
T7 2
Max. 0,18°C/cm
4 (Inferior)
1 (Superior)
Promedio: 0,13°C/cm
T8 2
Max. 0,19°C/cm
4 (Inferior)

En la figura 3.14 se puede destacar el tratamiento T6 donde la temperatura promedio del


lecho se mantuvo muy cercana a la del control, caso contrario a lo encontrado en los
tratamientos T7 y T8, donde para el nivel 4 la temperatura promedio del lecho se
encontró por fuera de las tolerancias (Barras de error ±1σ) indicando que esta
combinación de factores tendría un efecto negativo sobre las velocidades de
transferencia de calor entre el baño termostático y el lecho del fermentador, posiblemente
por el significativo gradiente en el contenido de humedad del sustrato encontrado en este
tratamiento (Figura 3.7).

En general, los gradientes axiales de temperatura son imposibles de evitar en los


fermentadores de lecho fijo debido a la utilización de la refrigeración por convección
utilizando el flujo unidireccional del aire (Aslhey et al, 1999). De hecho, estos gradientes
de temperatura pueden ser considerados como de pseudo-estado estacionario ya que
dependen de la tasa de crecimiento del microorganismo y pueden cambiar relativamente
de forma lenta durante la fermentación (Weber et al, 1999). Por otro lado, la velocidad
superficial del aire es una variable clave para la operación en un fermentador de lecho
fijo, ya que permite una disminución en la diferencia de temperaturas entre la entrada y la
salida (Mitchell et al, 1999). Fenómeno que se observó en los tratamientos T6 con una
combinación de flujo de aire bajo y saturado del mismo impidiendo una alta tasa de
evaporación del agua del soporte en especial en el nivel 4 (inferior) del fermentador
(Figura 3.14 T6).
Resultados y discusión 59

Figura 3.14: Perfiles de Temperatura del fermentador PROPHYTA® L05 para los
tratamientos con Cascarilla de arroz (T4, T6, T7 y T8)

T4 T6

T7 T8

3.1.7 Caída de presión en el lecho


En la tabla 3.5 se observa que en general los valores de caída de presión encontrados
fueron mayores al utilizar cascarilla de arroz como soporte, llegando a tener un valor
máximo de 13,77 mmHg (T6), mientras que para la espuma de poliuretano el máximo
valor registrado fue de 4,69 mmHg (T1). A pesar de que entre los tratamientos otros
factores como las relaciones de inoculación y C/N fueron diferentes se podría inferir
sobre la existencia de una correlación entre el flujo de aire alimentado y las pequeñas
caídas de presión. Es el caso de los tratamientos T3 (espuma) y T8 (cascarilla) para los
cuales se encontraron caídas de presión relativamente pequeñas inferiores a 2 mmHg,
teniendo como factor común la alimentación de un flujo de aire bajo y seco (0,42 m3/h).
60 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

Tabla 3.5: Caídas de presión (ΔP) promedio y máxima encontradas en las


fermentaciones del diseño fraccionado 1/16

ΔP promedio ΔP máximo
Tratamiento
(mmHg) (mmHg)
T1 1,86 ± 0,94 4,69
T2 2,36 ± 0,25 2,58
T3 1,19 ± 0,40 2,01
T4 3,96 ± 0,48 5,21
T5 3,41 ± 0,29 3,47
T6 11,47 ± 2,07 13,77
T7 5,93 ± 0,78 7,11
T8 1,20 ± 0,34 2,10
C1 3,58 ± 0,18 3,89
C2 2,34 ± 0,12 2,54
E1 12,91 ± 5,53 15,92

Con el propósito de comparar el comportamiento de la caída de presión entre los


soportes y el sustrato control (E1) se decidió escoger los tratamientos con condiciones
similares como fueron la misma altura del lecho y el caudal de aire (presión de aire
entrante). Es así como se escogieron los tratamientos T2 y T4 por presentar una altura
de lecho de 5 cm y un caudal de aire saturado de 1,13 m3/h, equivalentes a una presión
de entrada de 24,2 mbar (Línea superior) (Figura 3.15).

Los perfiles de caída de presión son sustancialmente diferentes en especial el del


soporte natural en comparación con los soportes inertes. La caída de presión utilizando el
sustrato natural (E1) alcanzó valores hasta de 15,92 mmHg o 21,17 mbar (1,05 mbar/cm)
a las 128,4 horas de fermentación. Este resultado permitió inferir que con el sustrato
natural estándar se podría llegar a perder hasta el 87,5% de la presión del aire de
entrada al finalizar la fermentación. Estos valores son excesivamente altos, teniendo un
riesgo alto de taponamiento total generando una aireación nula en los niveles superiores.

Por otro lado, con el soporte natural cascarilla de arroz (T4) la máxima caída de presión
registrada fue de 5,21 mmHg equivalentes a 6,94 mbar (0,347 mbar/cm) a las 145,3
horas de proceso, siendo ésta caída de presión el 28,2% de la presión del aire de
entrada. Este valor es cercano al reportado por Srinives et al (2010), quienes utilizando
un lecho de cascarilla de arroz de 0,5 metros encontraron caídas de presión hasta de
8,04 mbar.
Resultados y discusión 61

Por último, utilizando la espuma de poliuretano (T2) el perfil de caída de presión se


comportó linealmente con una pequeña pendiente, siendo el valor máximo registrado de
2,58 mmHg (3,44 mbar, 0,172 mbar/cm) a las 92,8 horas de fermentación, equivalentes
al 13% de la presión de aire entrante (Figura 3.15). Karimi et al (2014) reportaron perfiles
de caída de presión muy similares para la fermentación de A. niger en salvado, con los
máximos valores finalizando el proceso, utilizando biorreactores de 2,5 cm de diámetro y
20 cm de altura registraron una máxima caída de presión de 80 mbar (4 mbar/cm). Chen
(2013) reportó estudios con caídas de presión en resinas macroporosas de 0,637
mbar/cm en fermentadores de 6,5 cm de altura y 2 cm de diámetro, y hasta de 2,18
mbar/cm en el mismo fermentador utilizando bagazo de caña.

Los perfiles de caída de presión sugieren que utilizando el sustrato natural la altura
máxima permitida del lecho en las condiciones evaluadas (velocidad superficial de aire
0,005 m/s) no superaría los 0,5 m, con alturas superiores existiría un alto riesgo de nula
aireación en la parte superior del biorreactor, fenómeno descrito por Mitchell et al (1999)
quienes determinaron una relación directa entre la altura crítica del lecho y la velocidad
superficial del aire. Para el caso de los soportes inertes, la altura crítica del lecho sería
significativamente superior a la del sustrato estándar, de esta forma para estos casos la
altura crítica dependería de los gradientes de humedad y de temperatura permitidos para
el proceso.

Con la utilización de soportes inertes como la cascarilla de arroz o la espuma de


poliuretano se reducirían los problemas ocasionados por la caída de presión, como la
reducción del flujo de aire, la poca trasferencia de masa (O2 y CO2) en la parte superior
del lecho y el desfavorable fenómeno de canalización (Mitchell et al, 2006; Mitchell et al,
2000; Karimi et al, 2014). Es conocido que la caída de presión se ha convertido en uno
de los más importantes parámetros en los fermentadores de lecho empacado, siendo
creciente su importancia con la escala de trabajo a nivel técnico y económico
(Khanahmadi et al. 2006), de esta forma para la selección del medio de cultivo la
evolución de la caída de presión de aire a través de lecho deberá ser considerada. Las
menores caídas de presión encontradas en las fermentaciones utilizando espuma de
poliuretano sugieren a este material como promisorio para operar en mayores escalas en
fermentadores de lecho empacado con elevadas alturas.
62 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

Figura 3.15: Caída de presión del aire a través del sustrato natural estándar y los
soportes inertes cascarilla de arroz y espuma de poliuretano

Teniendo en cuanta los resultados encontrados con el diseño fraccionado 1/16 se


seleccionó a la espuma de poliuretano como el mejor soporte para el crecimiento y
producción de conidios de T. asperellum Th204. Con la espuma de poliuretano se
obtuvieron las mayores productividades de Th204 en conidios, con los menores
gradientes de humedad, temperatura del lecho controlable y las menores caídas de
presión en comparación con el soporte cascarilla de arroz y el sustrato estándar a base
de arroz. Adicionalmente, con una mayor relación de conidios producidos por peso seco
de soporte, con la espuma de poliuretano se necesitaría un menor peso en comparación
a la cascarilla de arroz para una determinada cantidad de conidios de T. asperellum
Th204, ventaja que a nivel logístico podría ser muy importante.

Finalmente, se determinó para este espacio experimental los factores relación C/N y el
caudal de aire como los dos factores a optimizar para maximizar la producción de
conidios de Th204. De esta forma, para la optimización de los factores críticos, los
factores cuyos efectos fijos no fueron significativos se mantuvieron en los valores para
los cuales favorecieron la productividad de Th204. Es así como los factores con efectos
positivos sobre la productividad como la temperatura y el contenido de humedad del aire
se mantuvieron para las fermentaciones de optimización en 28°C y 95%
respectivamente. Por otro lado, para los factores con efecto negativo sobre la
productividad, sus valores se mantuvieron en los niveles inferiores anteriormente
Resultados y discusión 63

evaluados, de esta forma la altura de lecho se mantuvo en 5 cm y la relación de


inoculación en 1,0x107 conidios/ g seco de soporte.

3.2 Generación de un modelo de respuesta de la


concentración final de T. asperellum Th204 en
función de los factores críticos
Una vez seleccionado la espuma de poliuretano como el mejor soporte para la
producción de T. asperellum Th204, se planteó la optimización de la productividad en
función de los factores críticos determinados anteriormente (relación C/N y el caudal de
aire), generando un modelo de superficie de respuesta utilizando un diseño central
compuesto con 11 tratamientos incluyendo tres repeticiones en el punto central. Se
evaluaron 5 niveles de la relación C/N: (9,2, 10,5 13,6 (punto central), 16,8 y 18,1) y 5
niveles para el caudal de aire (0,33, 0,56, 1,13 (punto central), 1,70 y 1,93 m3/h) (Tabla
3.6).

Igualmente al diseño experimental fraccionado (numeral 3,1), las variables respuesta


fueron el logaritmo de la productividad de conidios de Th204 (conidios/g.s.h), la velocidad
especifica máxima de crecimiento (Gelmi et al, 2000), el contenido de humedad final del
soporte (gradiente de humedad relativo), la temperatura entre niveles (gradiente de
temperatura axial promedio) y la caída de presión (caída de presión relativo) a través del
lecho del sustrato.

Para todos los tratamientos se mantuvieron las siguientes condiciones: temperatura de


incubación 28°C, altura de lecho 5 cm y una relación de inoculación de 1,0x107 conidios/
g soporte.

3.2.1 Influencia de los factores críticos sobre la productividad de


T. asperellum Th204
En la tabla 3.6 se evidencia que la mayor productividad (3,89x107 conidios/g.s.h) se
alcanzó en el tratamiento 8 con la mayor relación C/N (18,1) y el nivel central del caudal
de aire 1,13 m3/h. Mientras que la menor productividad se encontró en el tratamiento 11
con un valor de 6,17x107 conidios/g.s.h al trabajar con un caudal de aire de 1,70 m3/h y
una relación C/N de 10,5.
64 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

Los resultados del diseño de optimización fueron en promedio superiores a los


encontrados con el diseño fraccionado, demostrando que las condiciones de trabajo en
estas fermentaciones realizadas fueron en general más favorables.

Tabla 3.6: Productividad de T. asperellum Th204 en la fermentación sólida en el


fermentador PROPHYTA® L05 (Diseño Central Compuesto).
Caudal de aire saturado
Productividad
Tratamiento C/N entrante Log (Productividad)
3 (conidios /g.s.h)
(m /h)
7
1 13,6 1,13 1,20x10 7,08
7
2 16,8 0,56 2,24x10 7,35
7
3 9,20 1,13 1,17x10 7,07
7
4 16,8 1,70 1,58x10 7,20
7
5 13,6 1,13 1,55x10 7,19
7
6 13,6 0,33 1,86x10 7,27
6
7 10,5 0,56 8,91x10 6,95
7
8 13,6 1,13 3,89x10 7,59
6
9 13,6 1,93 7,08x10 6,85
7
10 18,1 1,13 3,16x10 7,50
6
11 10,5 1,70 6,17x10 6,79

En cuanto a la ecuación ajustada del modelo, se encontró una relación de segundo nivel
con un ajuste de regresión superior a 0,72. De esta forma se puede inferir que cerca del
72% de la variabilidad del sistema en cuanto a la productividad de conidios de Th204 se
podría predecir con la evaluación de los dos factores críticos, la relación C/N y el caudal
de aire de entrada (m3/h). Resultados similares en cuanto al ajuste del modelo para este
tipo de diseños en procesos de fermentación sólida en lecho fijo fueron encontrados por
Cavalcanti et al (2005) quienes en estudios para la optimización de la producción de
lipasa por Penicillium simplicissimum con la temperatura y el flujo de aire como variables
reportaron un ajuste del 72%.

El ajuste del modelo central compuesto es sustancialmente inferior al primer modelo


generado con el diseño fraccionado, en el cual su ajuste fue superior al 97% (numeral
3.1). No obstante, el primer modelo era más restrictivo en cuanto a los factores críticos
caudal de aire y relación C/N, con caudales de aire entre 0,425 y 1,13 m3/h y relaciones
C/N entre 6 y 8. Por otro lado, para el segundo modelo la productividad se podría
modelar en un espacio experimental más grande con un menor ajuste, con valores de
caudal de aire entre 0,33 y 1,93 m3/h y relaciones C/N entre 9,2 y 18,1.
Resultados y discusión 65

La ecuación de ajuste del diseño central compuesto se presenta a continuación:

Log (Productividad) = 5,72813 + 0,757741*Caudal aire + 0,125764*C/N - 0,43105*Caudal aire^2 +


0,00140097*Caudal aire*C/N - 0,00260352*C/N^2
2
R = 72,09 porciento

El diagrama de Pareto de la figura 3.16 evidencia que para el diseño de optimización el


factor C/N tiene una incidencia significativa sobre la variable respuesta (productividad)
(P=0,0045). Por otro lado, en el espacio experimental evaluado, el factor caudal de aire
tiene un efecto negativo, sin embargo este no es significativo sobre la variable respuesta
(Anexo B).

En la figura 3.16 se muestra la superficie de respuesta generada, en donde se evidencia


el efecto entre los dos factores críticos, sobre la productividad de Th204. Se puede
observar que la producción de conidios de T. asperellum Th204 se favorece con
caudales de aire entre 0,8 y 1,4 m3/h y con relaciones C/N superiores a 16.
Adicionalmente, los resultados permiten predecir que se obtendrían bajas
productividades con las combinaciones de relaciones C/N bajas (inferiores a 8) con
caudales de aire tanto altos (superiores a 1,8 m3/h) como bajos (inferiores a 0,3 m3/h).
Utilizando el software STATGRAPHICS Centurion XVI.II se encontró un óptimo de Log
productividad de 7,50 equivalente a 3,16x107 conidios/g.s.h utilizando la
combinación de flujo de aire de 0,90 m3/h y una relación C/N de 18,1.

Figura 3.16: Diagrama de Pareto y superficie de respuesta para la variable Log


productividad, para los 2 factores críticos (relación C/N y caudal de aire)

Diagrama de Pareto Estandarizada para Productividad

+
B:C/N
-

AA

A:Caudal aire

BB

AB

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3


Efecto estandarizado
66 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

Superficie de Respuesta Estimada

Log productividad (Conidios/ g seco sustrato.h)


Productividad
6,5
6,6
6,7
7,6 6,8
7,4 6,9
7,0
7,2 7,1
7,2
7 7,3
6,8 7,4
6,6
20
6,4 18
16
14
0 0,4 12
0,8 1,2 10
1,6 2 8 C/N
Caudal de aire (m3/h)

En cuanto a la relación C/N, resultados similares fueron encontrados por Santos et al


(2012) quienes estudiaron el efecto de la relación C/N y el contenido de humedad sobre
la fermentación sólida de T. asperellum T8a con cáscaras de mango y espuma de
poliuretano como matrices sólidas. Es este estudio se determinó una relación optima de
C/N de 26, alcanzando concentraciones máximas en ambos casos de 7,6x109 conidios/g
equivalentes a 3,97x107 conidios/g.s.h.

Según los estudios de Gao y Liu (2009) con diferentes géneros de hongos, el valor
óptimo de la relación C/N para la esporulación es diferente al valor óptimo para el
crecimiento micelial, siendo estos dependientes de la especie y el aislamiento. Para el
caso de Trichoderma viride TV-1 formularon un amplio intervalo de crecimiento para
relaciones C/N entre 10 y 40 encontrando el óptimo en una relación C/N de 10, no
obstante sugirieron que el crecimiento de la cepa de Trichoderma se ve más afectada por
la relación C/N que por las concentraciones de C y N independientes. De esta forma se
puede inferir que mayores relaciones C/N utilizando concentraciones altas de carbono no
tendrían mayor efecto en la producción de conidios de Th204, pero si en los costos
asociados para preparar el medio de cultivo.

Para el caudal de aire de entrada el efecto deletéreo en valores superiores a 1,8 m 3/h se
podría deber a los daños causados por el estrés de cizallamiento en el hongo y
principalmente a la reducción del contenido de humedad de la matriz sólida,
disminuyendo la aw e impidiendo el crecimiento del hongo, fenómeno que ha sido
Resultados y discusión 67

descrito en fermentadores de lecho fijo por otros autores (Lonsane et al, 1985; Lu et al,
1997).

3.2.2 Influencia de los factores críticos sobre el gradiente de


humedad del lecho
Para el gradiente de humedad del lecho se encontraron valores desde 1,1% (T2) hasta
90,7% (T9) (Tabla 3.7). El factor crítico caudal de aire resultó tener un efecto significativo
y positivo sobre esta variable (P=0,00001), contrario a lo encontrado con la relación C/N
donde su efecto fue negativo y no significativo (P=0,1927) (Figura 3.17). Este resultado
coincide con lo expresado por Mitchell et al (2006) quienes concluyen que el aire que
atraviesa el lecho en los fermentadores PBB sumado a la presencia de gradientes de
temperatura axiales favorecen el arrastre de la humedad de abajo hacia arriba, inclusive
cuando éste se alimenta saturado. Este fenómeno se acentúa con mayores caudales de
aire como se evidencia en la figura 3.17 donde con caudales superiores a 1,6 m3/h se
podrían ocasionar gradientes de humedad superiores al 60% en el lecho de espuma.
Este fenómeno fue evidenciado en el tratamiento 9 (flujo de aire 1,93 m3/h) donde el
gradiente de humedad fue superior al 90%. Por otro lado, con caudales de aire entre 0,4
y 1 m3/h los gradientes de humedad al finalizar la fermentación de Th204 serían
inferiores al 5% (Figura 3.17).

Tabla 3.7: Gradiente de humedad del lecho de los tratamientos del diseño central
compuesto
Caudal de aire
Gradiente H
Tratamiento C/N entrante
3 (%)
(m /h)
1 13,7 1,13 8,6
2 16,8 0,56 1,1
3 9,20 1,13 14,8
4 16,8 1,70 51,1
5 13,7 1,13 7,2
6 13,7 0,33 2,5
7 10,5 0,56 5,2
8 13,7 1,13 8,9
9 13,7 1,93 90,7
10 18,1 1,13 13,8
11 10,5 1,70 61,1
68 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

Figura 3.17: Diagrama de Pareto y superficie de respuesta para la variable gradiente de


humedad, para los 2 factores críticos (relación C/N y caudal de aire)

Diagrama de Pareto Estandarizada para Gradiente de H (% )

+
A:Caudal aire
-

AA

BB

B:C/N

AB

0 4 8 12 16 20 24
Efecto estandarizado

Superficie de Respuesta Estimada

Gradiente de Humedad (%)


Gradiente de humedad (%)

0,0
100 5,0
10,0
80 15,0
60 20,0
25,0
40 30,0
35,0
20 40,0
45,0
0 50,0
20 55,0
18 60,0
16
14 2
12 1,6
10 0,8 1,2
C/N 0,4
8 0
Caudal de aire (m3/h)

Gowthaman et al (1993); Ghildyal et al (1994) reportaron resultados similares para el


gradiente de humedad en el lecho, en la fermentación de A. niger en salvado de trigo
para lechos de 28 cm, con pérdidas del contenido de humedad entre el 20% y el 60%
para caudales de aire desde 0,9 hasta 1,5 m3/h respectivamente.
Resultados y discusión 69

3.2.3 Influencia de los factores críticos sobre el gradiente de


temperatura axial promedio
Para el gradiente de temperatura axial se encontraron valores desde -1,13°C (T6) hasta
5,6°C (T4 y T11) (Tabla 3.8). Con el análisis de Pareto se determinó para el factor caudal
de aire entrante un efecto significativo sobre la variable gradiente de temperatura
(P=0,0030) y un efecto negativo pero no significativo del factor relación C/N (P=0,6321)
(Figura 4.18: Anexo B). Estos resultados se pueden relacionar con la tasa de
evaporación de humedad, la cual es directamente proporcional al caudal de aire
alimentado. Con mayores caudales de aire el contenido de humedad del nivel 4 cae
rápidamente mientras que el calor latente retirado es acumulado en la parte superior,
generando una diferencia de temperatura que puede ser hasta de 8,8°C (0,44°C/cm).
Diversos autores han descrito este fenómeno utilizando sustratos naturales con
gradientes de temperatura de 2,50°C/cm (Raimbault, 1980); 4,50°C/cm (Saucedo et al,
1990; González et al, 1990) y hasta 30°C/cm (Rathbun y Schuler, 1983). De esta forma,
los gradientes encontrados en este estudio utilizando espuma de poliuretano se
consideran relativamente pequeños, sugiriendo que la naturaleza de la capacidad de
absorción de agua de la espuma podría minimizar el retiro excesivo de humedad lo que
disminuiría la magnitud de los gradientes de temperatura axial.

En la figura 3.18 se puede evidenciar que el gradiente de temperatura axial promedio se


favorecería con caudales de aire desde 1,2 a 2 m3/h, siendo independiente de la relación
C/N. Para minimizar la probabilidad de gradientes de temperatura altos (inferiores a 3°C),
el modelo sugiere trabajar con flujos de aire menores a 0,8 m3/h.

Tabla 3.8: Gradiente de temperatura promedio de los tratamientos del diseño central
compuesto
Caudal de aire
Gradiente T
Tratamiento C/N entrante
3 promedio (°C)
(m /h)
1 13,7 1,13 4,1
2 16,8 0,56 2,3
3 9,20 1,13 4,0
4 16,8 1,70 5,6
5 13,7 1,13 4,2
6 13,7 0,33 -1,3
7 10,5 0,56 3,2
70 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

8 13,7 1,13 3,9


9 13,7 1,93 5,4
10 18,1 1,13 3,6
11 10,5 1,70 5,6

Figura 3.18: Diagrama de Pareto y superficie de respuesta para la variable gradiente de


temperatura axial promedio, para los 2 factores críticos (relación C/N y caudal de aire)

Diagrama de Pareto Estandarizada para Gradiente de T (°C) Promedio

+
A:Caudal aire
-

AA

B:C/N

AB

BB

0 1 2 3 4 5 6
Efecto estandarizado

Superficie de Respuesta Estimada

Gradiente T
-2,0
Gradiente de T (°C) Promedio

-1,0
0,0
7 1,0
6 2,0
5 3,0
4
3 4,0
2 5,0
1 6,0
0
-1
-2
20 2
18 1,6
16 1,2
14 0,8
12
C/N 10 0,4 Caudal de aire (m3/h)
8 0
Resultados y discusión 71

Resultados similares para el gradiente de temperatura axial fueron reportados por


Ghildyal et al (1994) y descritos por Mitchell et al (2006), quienes en estudios de
fermentación sólida de A. niger en salvado de trigo determinaron gradientes de 3 a 10°C
para alturas de lecho entre 8,4 y 24 cm utilizando flujos de aire desde 0,54 hasta 1,44
m3/h respectivamente.

3.2.4 Influencia de los factores críticos sobre el gradiente de


concentración relativo
Los valores de gradientes de concentración relativos al nivel 1 se encontraron desde 1,7
(T6) hasta el 100% (T4, T9, T11) (Tabla 3.9). Mayores gradientes de concentración
relativos indicarían una mayor heterogeneidad en el crecimiento del hongo entre los
niveles del fermentador, mientras que menores valores indicarían un crecimiento
homogéneo.

El diagrama de Pareto de la figura 3.19 muestra que el factor caudal de aire tiene un
efecto positivo y significativo (P=0,0017) sobre el gradiente de concentración, mientras
que el factor C/N tuvo un efecto negativo pero no significativo sobre esta variable
(P=0,5976) (Anexo B).

En la figura 3.19 el análisis por superfice de respuesta determina que altos caudales de
aire (superiores a 1,6 m3/h) ocasionarían gradientes de concentración en relación al nivel
1 de hasta el 100%, este fenómeno se observó principalmente en el tratamiento 9, donde
con un fluijo de aire de 1,93 m3/h el crecimiento por parte de Th204 en el nivel 4 fue
practicamente nulo. Para obtener una mayor homogeneidad en el crecimiento de Th204
entre los niveles del fermentador con un gradiente menor al 10%, los resultados permiten
sugerir caudales de aire entre 0,3 y 1 m3/h.

Los gradientes de concentración han sido descritos por Chen (2013) y Mitchell et al
(2006), como problemas a resolver en los fermentadores de lecho fijo, atribuyendo su
presencia a fenómenos de gradientes de humedad, y temperatura que desfavoren el
desarrollo efectivo del microorganismo. .
72 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

Tabla 3.9: Gradiente de concentración relativo (%) de los tratamientos del diseño central
compuesto

Caudal de Gradiente de
Tratamiento C/N aire entrante Concentración
3
(m /h) (%)
1 13,7 1,13 15,6
2 16,8 0,56 3,5
3 9,20 1,13 12,5
4 16,8 1,70 100
5 13,7 1,13 7,2
6 13,7 0,33 1,7
7 10,5 0,56 22,1
8 13,7 1,13 5,3
9 13,7 1,93 100
10 18,1 1,13 5,3
11 10,5 1,70 100

Figura 3.19: Diagrama de Pareto y superficie de respuesta para la variable gradiente de


concentración relativa, para los 2 factores críticos (relación C/N y caudal de aire)

Diagrama de Pareto Estandarizada para Gradiente de Concentración Relativo

+
A:Caudal aire
-

AA

BB

B:C/N

AB

0 2 4 6 8
Efecto estandarizado
Resultados y discusión 73

Superficie de Respuesta Estimada

Gradiente (%)

Gradiente de Concentración (%)


-10,0
0,0
130 10,0
110 20,0
90 30,0
70 40,0
50,0
50 60,0
30 70,0
10 80,0
-10 90,0
100,0
20
18
16 2
14 1,6
12 1,2
10 0,8
C/N 0,4
8 0
Caudal de aire (m3/h)

3.2.5 Influencia de los factores críticos sobre la caída de presión


relativa
Para la caída de presión relativa se encontraron valores desde 22,8% (T4) hasta 72,5%
(T6) (Tabla 3.10). Se determinó para el factor caudal de aire entrante un efecto negativo
y significativo sobre esta variable (P=0,0019) y un efecto positivo pero no significativo del
factor relación C/N (P=0,058) (Figura 3.20: Anexo B). En la figura 3.20, el análisis de
superficie de respuesta muestra que las caídas de presión pueden llegar a ser hasta del
100% con caudales de aire bajos (menores a 0,4 m3/h) y relaciones C/N superiores a 14.
Este comportamiento podría radicar en que con flujos de aire pequeños durante la fase
de crecimiento exponencial de Th204 (favorecido por C/N altas), no se tendría la
suficiente presión de entrada de aire para vencer la resistencia al flujo ocasionada por la
disminución de la porosidad del lecho y la menor fracción vacia disponible para el flujo
del aire. Estos fenómenos han sido descritos por Auria et al (1995) y más recientemente
por Karimi (2014), quienes describen la dependencia de la caída de presión con la
densidad del lecho, la cual en procesos SSF estaría en constante crecimiento.
74 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

Tabla 3.10: Caída de presión relativo de los tratamientos del diseño central compuesto
Caudal de aire entrante
Tratamiento C/N 3 Caída de P (%)
(m /h)
1 13,7 1,13 24,9
2 16,8 0,56 61,4
3 9,20 1,13 25,4
4 16,8 1,70 22,8
5 13,7 1,13 36,2
6 13,7 0,33 72,5
7 10,5 0,56 32,9
8 13,7 1,13 34,2
9 13,7 1,93 30,5
10 18,1 1,13 40,6
11 10,5 1,70 32,4

Figura 3.20: Diagrama de Pareto y superficie de respuesta para la caída de presión,


para los 2 factores críticos (relación C/N y caudal de aire)

Diagrama de Pareto Estandarizado Caída de presión relativa

+
A:Caudal de aire
-

AA

AB

B:C/N

BB

0 1 2 3 4 5 6
Efecto estandarizado
Resultados y discusión 75

Superficie de Respuesta Estimada

Gradiente de P
0,0
10,0
20,0
30,0

Gradiente de P relativo (%)


40,0
150 50,0
120 60,0
70,0
90 80,0
60 20 90,0
18 100,0
30
16
0
14
0 12
0,4 C/N
0,8 10
1,2
1,6 8
2
Caudal de aire (m3/h)

3.2.6 Influencia de los factores críticos sobre la velocidad


específica máxima de crecimiento de T. asperellum Th204
En la figura 3.21 se observa el comportamiento de los perfiles de acumulación de CO2
para cada uno de los 11 tratamientos evaluados. Se puede destacar de forma general un
comportamiento del tipo logístico, es decir una fase de adaptación entre 0 y 20 horas,
una fase exponencial de crecimiento entre 20 y 80 horas y una fase estacionaria o de
mantenimiento entre 100 y 160 horas aproximadamente. El modelo logístico en los
procesos SSF se basa en una limitante de superficie durante la fermentación y en un
cantidad máxima de biomasa producida (Mazaheri y Shojaosadati, 2013). La ecuación
logística se ajusta razonablemente bien en alrededor del 75% de los perfiles de la
literatura obtenidos en los sistemas SSF y se prefiere generalmente porque a menudo es
posible utilizarla para describir todo la curva de crecimiento (Viccini et al, 2001).
76 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

Figura 3.21: Perfiles de acumulación de CO2 producido durante la fermentación de T.


asperellum Th204

Las velocidades específicas de crecimiento máximas encontradas para Th204 utilizando


espuma de poliuretano se encontraron entre 0,0336 (T11) y 0,1067 h-1 (T6) (Tabla 3.11).
Estas velocidades específicas de crecimiento máximas y las expuestas en las tabla 4.2
utilizando los otros sustratos fueron en promedio cercanos a los encontrados por Agosin
et al (1997) para cepas de T. harzianum con valores entre 0,05 y 0,12 h-1. Igualmente, a
los reportados en los estudios de Viccini et al (2001) quienes realizaron una compilación
de los modelos de crecimiento en fermentación sólida y reportaron velocidades de
crecimiento para el género Trichoderma entre 0,061 y 0,089 h-1 utilizando sorgo dulce y
remolacha azucarera como sustratos.

Tabla 3.11: Velocidades específicas de crecimiento máximas (h-1) para T. asperellum


Th204 en el fermentador PROPHYTA® L05
Tratamiento C/N Caudal de aire entrante µ máx.
3 -1
(m /h) (h )
1 13,7 1,13 0,0736

2 16,8 0,56 0,0939

3 9,2 1,13 0,0663


Resultados y discusión 77

4 16,8 1,70 0,0746

5 13,7 1,13 0,0825

6 13,7 0,33 0,1067

7 10,5 0,56 0,0616

8 13,7 1,13 0,0726

9 13,7 1,93 0,0362

10 18,1 1,13 0,1001

11 10,5 1,70 0,0336

Se determinó un efecto significativo y negativo del factor caudal de aire (P=0,0080) y un


efecto positivo y significativo de la relación C/N (P=0,0171) sobre la velocidad específica
máxima de crecimiento de T. asperellum Th204. Adicionalmente, mediante la superficie
de respuesta generada se podría inferir que con mayores relaciones C/N (superiores a
16) y menores caudales de aire (menores a 0,6 m3/h) se obtendría unas mayores µ máx
-1
superiores a 0,10 h (Figura 3.22).

Figura 3.22: Diagrama de Pareto y superficie de respuesta para la velocidad específica


máxima de crecimiento, para los 2 factores críticos (relación C/N y caudal de aire)
78 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

Con el fin de determinar el grado de asociación e interdependencia de las variables


respuesta con los factores críticos se estimaron las correlaciones utilizando los rangos de
Sperman (Ortega et al, 2009). Para el factor crítico caudal de aire se determinaron con un
95% de confianza correlaciones significativas con el gradiente de temperatura
(P=0,0036), el gradiente de humedad (P=0,0031), el gradiente de concentración relativo
(P=0,0144) y la caída de presión (P=0,0339) (Anexo B). De esta forma se entiende que
pequeños cambios en el flujo de aire entrante al fermentador PROPHYTA® L05 tendrán
un efecto significativo sobre estas variables durante la fermentación de T. asperellum
Th204. Por otro lado, para el factor C/N no se encontraron correlaciones significativas
con los gradientes de temperatura, de humedad, de concentración relativa y caída de
presión en el espacio experimental evaluado.

En general, el factor operacional caudal de aire entrante ejerció un efecto significativo


sobre los gradientes de humedad, de temperatura, de concentración y caída de presión,
mientras que su efecto fue negativo tanto para la productividad como para la velocidad
específica máxima de crecimiento de T. asperellum Th204. Por otro lado, el factor
relación C/N con mayor afinidad a la preparación del sustrato, no ejerció efectos
significativos sobre los gradientes de humedad, de temperatura, de concentración y caída
de presión pero sí sobre la productividad y la velocidad específica máxima de crecimiento
de T. asperellum Th204 (Anexo B).
Resultados y discusión 79

Se podría inferir que el caudal de aire tendría una influencia directa sobre los fenómenos
de transporte dentro del biorreactor. Es así como esta variable afectaría las dinámicas de
transferencia de masa como el arrastre del contenido de humedad del lecho y la
evaporación. También influiría en los fenómenos de transferencia de calor como el retiro
y/o acumulación de los calores metabólicos y latentes de vaporización. Finalmente,
tendría un efecto sobre las transferencias de cantidad de movimiento como las pérdidas
de presión a través del lecho.

En contraste, el factor relación C/N tendría una mayor influencia sobre los fenómenos
dentro del sustrato como la disponibilidad de nutrientes y sobre el hongo en cuanto a su
cinética de crecimiento.

3.2.7 Validación del modelo estadístico


La validación del modelo se realizó utilizando la combinación óptima de los factores
críticos encontrada en el numeral 3.2.1 (Caudal de aire saturado de 0,9 m3/h y relación
C/N de 18,1). Se utilizó una temperatura de incubación de 28°C, una altura de lecho de 5
cm y una relación de inoculación de 1,0x107 conidios/g.s según lo discutido en el numeral
3.2.

Los valores de logaritmo de la productividad para las validaciones 1 y 2 se encontraron


en 7,49 y 7,48 respectivamente, siendo muy cercanos al valor esperado de 7,50 según el
modelo ajustado. No obstante, para la validación número 3 el valor encontrado de
productividad de 2,53x107 conidios/g.s.h (Log=7,40) se desvió del esperado en un 20%,
Sin embargo, este último resultado se podría explicar teniendo en cuenta que el R2 del
modelo fue de un 72% (numeral 3.2.1) y por lo tanto se podría esperar un error aleatorio y
experimental cercano al 28%. Sin embargo, numéricamente los valores de productividad
para las tres validaciones no fueron muy diferentes al estar entre 2,0x107 y 3,0x107
conidios/g.s.h y se consideraría estos valores de productividad similares a nivel de
procesos de producción masiva de hongos (Tabla 3.12).
80 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

Tabla 3.12: Validación de la combinación óptima para el crecimiento de T. asperellum


Th204 en espuma de poliuretano

Validación Caudal de C/N Productividad Productividad Ajuste al


aire Esperada observada esperado
m3/h (conidios/g.s.h) (conidios/g.s.h) (%)
1 0,90 18,1 3,16x107 3,09x107 97,7
2 0,90 18,1 3,16x107 3,02x107 95,5
7 7
3 0,90 18,1 3,16x10 2,53x10 80,0
7
Promedio 2,88 x10 91,2%

Finalmente, los resultados permitieron desarrollar un sistema de fermentación sólida para


el hongo Th204 utilizando espuma de poliuretano como soporte. Al utilizar este sistema
se encontraron productividades superiores a las del sustrato natural estándar (arroz y
salvado) actualmente usado para la producción masiva de microrganismos con interés
biológico en CORPOICA. Adicionalmente, en un estudio preliminar de costos de
producción asociados al sustrato, se encontró que utilizando el soporte de espuma de
poliuretano el costo por gramo de biomasa seca (determinada experimentalmente para
extractos de los soportes) producida de Th204 sería de 1,51 veces menor al compararlo
con los costos si se utilizará el sustrato natural (Tabla 3.13). Las diferencias en costos
podrían ser mayores si se considera la posibilidad de la reutilización de la espuma para
más de una fermentación, aspecto que se ha descrito en otros estudios utilizando este
tipo de soportes inertes (Marín et al, 2008), sin embargo se deben realizar evaluaciones
adicionales con miras a determinar el máximo número de reutilizaciones del soporte sin
que se vean afectadas sus propiedades fisicoquímicas como la capacidad de absorción
de agua y el área superficial por volumen, entre otras. Adicionalmente, la disminución en
el tamaño de la espuma entre 0,5 a 1 cm de arista podría mejorar los rendimientos
encontrados en el presente trabajo, proporcionando una mayor área por unidad de
volumen en el lecho.
Resultados y discusión 81

Tabla 3.13: Comparación de medios de cultivo en cuanto a los costos asociados por
gramo seco de biomasa de T. asperellum Th204

Costo por gramo


Distribución del Precio por
Componente Costo/kg de biomasa seca
costo fermentación
de Th204
Medio Arroz blanco $ 2.400,00 89,66%
$10.244 $ 179,5
estándar Salvado $ 1.200,00 10,34%
16,47%
Espuma de poliuretano $ 4.000
Medio 63,73%
Puré de papa $ 12.000,00 $2.429 $ 118,49
Espuma
19,80%
Extracto de levadura $ 37.000,00
Fuente costos: Industrias del cultivo, espumas Santafé.
4. Conclusiones y recomendaciones

4.1 Conclusiones
 La mayor productividad para T. asperellum Th204 utilizando el fermentador
PROPHYTA® L05 se encontró con el soporte inerte espuma de poliuretano
(3,89x107 conidios/g.s.h) siendo significativamente mayor en comparación con la
encontrada en el soporte cascarilla de arroz (2,83x106 conidios/g.s.h) y en el
sustrato natural a base de arroz (8,87x106 conidios/g.s.h).

 Los factores críticos con un mayor efecto significativo positivo sobre la


productividad de T. asperellum Th204 en el fermentador PROPHYTA® L05 fueron
el caudal de aire alimentado (m3/h) y la relación C/N.

 El caudal de aire tiene un efecto significativo sobre los gradientes de humedad del
lecho, de temperatura, de concentración final y la caída de presión, mientras que
el factor C/N tiene un efecto significativo sobre la productividad y la velocidad
específica máxima de crecimiento de T. asperellum Th204.

 El modelo generado con el diseño central compuesto determinó una zona en


donde se obtendrían productividades de T. asperellum Th204 superiores a
3,0x107 conidios/g.s.h, con caudales de aire entre 0,5 y 1,13 m3/h y relaciones
C/N superiores a 18.

 Las condiciones óptimas para la fermentación de T. asperellum Th204 en el


fermentador PROPHYTA® L05 (productividad superior a 3,0x107 conidios/g.s.h)
generadas por el modelo y que permitieron la validación de su producción fueron
un caudal de aire saturado de 0,9 m3/h y una relación C/N de 18,1.
84 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

 La utilización de la espuma de poliuretano surge como una alternativa a los


sustratos naturales para la producción de T. asperellum Th204, siendo validada a
nivel de fermentador de lecho fijo de 16 Litros generando un proceso SSF con
bajos gradientes de humedad del lecho, de concentración y caídas de presión.

4.2 Recomendaciones
Evaluar la capacidad de reutilización en el proceso y la disminución del tamaño de
partícula de la espuma de poliuretano, así mismo otras fuentes de carbono y nitrógeno
más económicas para el crecimiento del microorganismo. Estos tres factores podrían
disminuir aún más los costos de operación. Adicionalmente, probar la espuma de
poliuretano en otros sistemas de fermentación como los fermentadores de bandejas o
rotatorios. Por último, profundizar el modelamiento de los fermentadores de lecho fijo
desde el punto de vista analítico de los fenómenos de transporte.
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98 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

A. Anexo A: Análisis elemental de la


suspensión nutritiva y la biomasa de
Th204 seca
Se pesaron en una microbalanza XP6 de Mettler Toledo y se sometieron a estudio en el
Analizador Elemental Flash 2000 de Thermo Scientific, el cual consta de un
automuestreador, un reactor, una columna Porapack de 2 m y un detector de
conductividad térmica, utilizando las siguientes condiciones:

Temperatura del reactor: 950°C


Temperatura de la columna: 65°C
Gas acarreador de Helio AP
Flujo 140 mL/min
Tiempo de corrida 720 s
Patrón estándar certificado Cistina

Análisis elemental de los componentes de la suspensión nutritiva

Resultados
Carbono Nitrógeno Hidrógeno Azufre
Muestra Porcentaje (%) p/p base seca
Puré de Papa (polvo) 39,23 1,30 6,00 0,00
Extracto de levadura 36,40 11,28 5,96 1,86
Biomasa 42,56 4,53 5,93 0,27
99

B. Anexo B: Análisis de varianza de


los diseños experimentales
Análisis de Varianza (α=0,05) para Log Productividad en el Diseño fraccionado
(1/16)

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P


A:Soporte 0,737789 1 0,737789 99,69 0,0099
B:C/N 0,148512 1 0,148512 20,07 0,0464
C:Inóculo 0,0841 1 0,0841 11,36 0,0779
D:Humedad de aire 0,030625 1 0,030625 4,14 0,1789
E:Temperatura 0,0276125 1 0,0276125 3,73 0,1931
F:Altura del lecho 0,10947 1 0,10947 14,79 0,0614
G:Caudal de aire 0,1849 1 0,1849 24,98 0,0378
Error total 0,0148011 2 0,00740057
Total (corr.) 2,71444 9

R-cuadrada = 99,4547 porciento


R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 97,5463 porciento
Error estándar del est. = 0,0860266

Análisis de Varianza (α=0,05) para Log Productividad en el Diseño de compuesto


central

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P


A:Caudal aire 0,102587 1 0,102587 2,86 0,1515
B:C/N 0,251386 1 0,251386 7,01 0,0455
AA 0,108063 1 0,108063 3,01 0,1430
AB 0,000025 1 0,000025 0,00 0,9800
BB 0,00376868 1 0,00376868 0,11 0,7589
Error total 0,179241 5 0,0358483
Total (corr.) 0,642218 10

R-cuadrada = 72,0903 porciento


R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 44,1806 porciento
Error estándar del est. = 0,189336
Error absoluto medio = 0,0935027
Estadístico Durbin-Watson = 2,28659 (P=0,7734)
Autocorrelación residual de Lag 1 = -0,266847

Análisis de Varianza (α=0,05) para producción el gradiente de humedad (%) Diseño


de compuesto central

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P


A:Caudal de aire 6649,0 1 6649,0 492,78 0,0000
B:C/N 30,0867 1 30,0867 2,23 0,1956
AA 2033,68 1 2033,68 150,72 0,0001
AB 8,7025 1 8,7025 0,64 0,4584
BB 45,1334 1 45,1334 3,34 0,1269
100 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

Error total 67,4642 5 13,4928


Total (corr.) 8835,81 10

R-cuadrada = 99,2365 porciento


R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 98,4729 porciento
Error estándar del est. = 3,67326
Error absoluto medio = 2,05705
Estadístico Durbin-Watson = 1,49375 (P=0,3282)
Autocorrelación residual de Lag 1 = 0,241793

Análisis de Varianza (α=0,05) para el gradiente de T en el Diseño de compuesto


central

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P


A:Caudal aire 28,1802 1 28,1802 28,99 0,0030
B:C/N 0,252328 1 0,252328 0,26 0,6321
AA 2,70645 1 2,70645 2,78 0,1561
AB 0,1764 1 0,1764 0,18 0,6878
BB 0,144938 1 0,144938 0,15 0,7153
Error total 4,86005 5 0,972011
Total (corr.) 37,0311 10

R-cuadrada = 86,8757 porciento


R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 73,7515 porciento

Análisis de Varianza (α=0,05) para producción el gradiente de concentración (%)


Diseño de compuesto central

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P


A:Caudal de aire 12278,8 1 12278,8 37,61 0,0017
B:C/N 103,555 1 103,555 0,32 0,5976
AA 4231,22 1 4231,22 12,96 0,0155
AB 86,49 1 86,49 0,26 0,6287
BB 231,149 1 231,149 0,71 0,4385
Error total 1632,57 5 326,515
Total (corr.) 18349,5 10

R-cuadrada = 91,1029 porciento


R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 82,2058 porciento
Error estándar del est. = 18,0697
Error absoluto medio = 10,7788
Estadístico Durbin-Watson = 2,19423 (P=0,7293)
Autocorrelación residual de Lag 1 = -0,216542

Análisis de Varianza (α=0,05) para el gradiente de P en el Diseño de compuesto


central

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P


A:Caudal aire 1209,92 1 1209,92 35,36 0,0019
B:C/N 204,586 1 204,586 5,98 0,0583
AA 422,852 1 422,852 12,36 0,0170
AB 363,665 1 363,665 10,63 0,0224
BB 1,94359 1 1,94359 0,06 0,8211
101

Error total 171,096 5 34,2193


Total (corr.) 2436,45 10

R-cuadrada = 92,9776 porciento


R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 85,9553 porciento

Análisis de Varianza (α=0,05) para la velocidad específica máxima de crecimiento


en el Diseño de compuesto central

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P


A:Caudal de aire 0,0027012 1 0,0027012 18,16 0,0080
B:C/N 0,00183316 1 0,00183316 12,32 0,0171
AA 0,000155153 1 0,000155153 1,04 0,3540
AB 0,0000189225 1 0,0000189225 0,13 0,7359
BB 0,00000226498 1 0,00000226498 0,02 0,9066
Error total 0,000743852 5 0,00014877
Total (corr.) 0,00548154 10

R-cuadrada = 86,4299 porciento


R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 72,8597 porciento
Error estándar del est. = 0,0121972
Error absoluto medio = 0,00666688
Estadístico Durbin-Watson = 2,19131 (P=0,7278)
Autocorrelación residual de Lag 1 = -0,103989

Análisis Multivariado correlaciones de Spearman


Datos/Variables:
C/N
Caudal aire (m3/h)
CO2 (g/kg)
Gradiente de H ((%))
Gradiente de P ((%))
Gradiente T ((°C))
Productividad

Correlación Ordinal de Spearman


C/N Caudal aire CO2 Gradiente de H Gradiente de P Gradiente T Productividad
C/N 0,0000 -0,2998 -0,1485 0,2875 -0,0958 0,6900
(11) (11) (11) (11) (11) (11)
1,0000 0,3431 0,6386 0,3633 0,7619 0,0291
Caudal aire 0,0000 0,7737 0,9343 -0,6708 0,9199 -0,4216
(11) (11) (11) (11) (11) (11)
1,0000 0,0144 0,0031 0,0339 0,0036 0,1824
CO2 -0,2998 0,7737 0,7432 -0,8074 0,8165 -0,7707
(11) (11) (11) (11) (11) (11)
0,3431 0,0144 0,0188 0,0107 0,0098 0,0148
Gradiente de H -0,1485 0,9343 0,7432 -0,6545 0,8000 -0,4545
(11) (11) (11) (11) (11) (11)
0,6386 0,0031 0,0188 0,0385 0,0114 0,1506
Gradiente de P 0,2875 -0,6708 -0,8074 -0,6545 -0,7545 0,5182
(11) (11) (11) (11) (11) (11)
0,3633 0,0339 0,0107 0,0385 0,0170 0,1013
Gradiente T -0,0958 0,9199 0,8165 0,8000 -0,7545 -0,4909
102 Desarrollo de un proceso de fermentación sólida para el hongo Trichoderma
asperellum Th204 en un fermentador de lecho fijo

(11) (11) (11) (11) (11) (11)


0,7619 0,0036 0,0098 0,0114 0,0170 0,1206
Productividad 0,6900 -0,4216 -0,7707 -0,4545 0,5182 -0,4909
(11) (11) (11) (11) (11) (11)
0,0291 0,1824 0,0148 0,1506 0,1013 0,1206

Optimización de Múltiples Respuestas para Log Productividad

Datos/Variables:
Productividad

Mínimo Máximo
Respuesta Observado Observado
Productividad 6,79 7,59

Deseabilidad Deseabilidad Pesos Pesos


Respuesta Baja Alta Meta Primero Segundo Impacto
Productividad 6,79 7,59 Maximizar 1,0 3,0

Deseabilidad Deseabilidad
Fila Productividad Prevista Observada
1 7,08 0,620833 0,3625
2 7,35 0,775325 0,7
3 7,07 0,242889 0,35
4 7,2 0,499084 0,5125
5 7,19 0,620833 0,5
6 7,27 0,474751 0,6
7 6,95 0,338415 0,2
8 7,59 0,620833 1,0
9 6,85 0,07525 0,075
10 7,5 0,869612 0,8875
11 6,79 0,0496741 0,0

Productividad - maximizar

Optimizar Deseabilidad
Valor óptimo = 0,896679

Factor Bajo Alto Óptimo


Caudal aire 0,331348 1,93365 0,908355
C/N 9,19523 18,1048 18,1048

Respuesta Óptimo
Productividad 7,50734
103

C. Anexo: Determinación de la
velocidad especifica máxima de
crecimiento (µ max , h -1 )
Siguiendo el método descrito por Gelmi et al (2000) las velocidades específicas máximas
de crecimiento para T. asperellum Th204 se estimaron utilizando los resultados de
respirometría específicamente los de producción de CO2. En todos los tratamientos (T1 a
T11) cada 20 minutos se determinó la concentración de CO2 medida como los gramos de
CO2 acumulados producidos por gramo de sustrato seco. Tomando el logaritmo natural
de la concentración de CO2 y graficándola en función del tiempo se determinó la
pendiente (intervalo de 20-40 horas) siendo esta la velocidad especifica de crecimiento
máxima (h-1).

Teniendo como ejemplo el tratamiento T10 se determinó para el periodo entre 20 y 40


horas la pendiente correspondiente a la velocidad específica máxima de crecimiento
(µmax) de 0,0736 h-1.

Anexo C Figura 1: Figura 1. Perfil de Acumulación de CO2 producido durante la


fermentación de T. asperellum Th204 y estimación de la velocidad específica máxima de
crecimiento (µmax) (T10)

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