República 

Bolivariana de Venezuela
Ministerio del Poder Popular para la Educación
Universidad Nacional Experimental de los Llanos Occidentales
“Ezequiel Zamora”
UNELLEZ - Guasdualito

Modulo I
Conceptos básicos. Microscopia,
Métodos y Técnicas histológicas.

Docente: Bachilleres:

 Ing. Orelis Pérez.

 Breyner Valero C.I:
Subproyecto:
Sistema de Producción Animal I.

Guasdualito, Abril, 2021

 Introducción.

Daremos inicios al desarrollo del presente trabajo el cual estará dividido en tres
partes principales que las mismas abarcaran unas series de conceptos, los cuales será;
historia, conceptos e importancias de la histología, en este punto daremos un breve
repaso por la historia e inicio de esta ciencia, así como las principales aplicaciones de la
misma; segundo lugar hablaremos sobre los instrumentos de magnificación
microscópica, en este punto en especial trataremos sobre los microscopios, los
diferentes tipos de microscopios que existen, en que se utilizan cada uno de ellos,
partes y funcionalidad de cada uno de sus mecanismos y por último y no menos
importante hablaremos sobre las técnicas histológicas, los conceptos y procedimientos
de las mismas, este tema es de carácter importante debido que en este tema en
especial hablaremos sobre las técnicas, los pasos métodos, insumos y equipos con los
cuales obtendremos las muestras histológicas que serán estudiadas y analizadas para
determinar alguna causa en especial.

Deseando que sea de gran interés este trabajo investigativo, daremos inicio al
desarrollo del mismo.

2
 Índice.
Introducción........................................................................................................................2

Concepto de Histología......................................................................................................8

Historia de la histología......................................................................................................8

Importancia del estudio de la histología.............................................................................9

Instrumento para magnificar imágenes............................................................................10

Conceptos de microscopio...............................................................................................10

Microscopio......................................................................................................................11

Clasificación de los microscopios....................................................................................11

De acuerdo de su fuente luminosa:..............................................................................11

Microscopio de luz visible.........................................................................................11

Microscopio de luz polarizada...................................................................................11

Microscopio óptico compuesto..................................................................................12

Microscopio de contraste de fase.............................................................................12

Microscopio de interferencia.....................................................................................12

Microscopio de campo oscuro..................................................................................13

Microscopio de luz invisible......................................................................................13

Microscopio de rayos X.............................................................................................13

Microscopio de luz ultravioleta..................................................................................13

Microscopio electrónico.............................................................................................14

Microscopio confocal.................................................................................................14

Microscopio de fluorescencia....................................................................................14

Microscopio electrónico de transmisión....................................................................14

Microscopio electrónico de barrido (MEB)................................................................15

Microscopio de acuerdo al número de oculares:..........................................................16

3
 Microscopio monocular.............................................................................................16

Microscopio binocular...............................................................................................16

Microscopio trinocular...............................................................................................16

Microscopio óptico............................................................................................................16

Partes mecánicas del microscopio óptico...................................................................17

El sistema óptico:......................................................................................................17

El sistema mecánico.................................................................................................17

Fenómeno físico óptico asociado a la microscopia.........................................................18

Lente convergente........................................................................................................18

Tipos de lentes convergentes.......................................................................................19

Lentes biconvexas:...................................................................................................19

Lentes planoconvexas:.............................................................................................19

Lentes cóncavoconvexas o meniscos convergentes...............................................19

Formación de imágenes en sus lentes convergentes..................................................20

Distancia superior a dos veces la distancia focal.....................................................20

Distancia entre una y dos veces la distancia focal...................................................21

Distancia inferior a la distancia focal.........................................................................22

Conceptos asociados a la microscopia............................................................................23

Angulo de abertura.......................................................................................................23

Poder de resolución......................................................................................................23

Poder de penetración...................................................................................................24

Distancia focal...............................................................................................................24

Distancia frontal............................................................................................................25

Aumento propio.............................................................................................................25

Formación de la imagen definitiva en el microscopio óptico...........................................25

4
 Fuente de luz................................................................................................................26

Natural.......................................................................................................................26

Artificial......................................................................................................................26

Filtro de luz................................................................................................................26

Tipo de iluminación.......................................................................................................27

Central.......................................................................................................................27

Lateral u oblicua de capo oscuro..............................................................................27

Técnicas Histológicas.......................................................................................................27

Método de examen...........................................................................................................27

Métodos inmediatos......................................................................................................27

In vivo al estado fresco.............................................................................................27

Examen con coloración vital.....................................................................................28

Material.............................................................................................................................28

Origen del material.......................................................................................................28

En la obtención del material histológico hay que cumplir con varias reglas, como ser:
......................................................................................................................................28

Procedimiento...................................................................................................................29

Líquidos indiferentes........................................................................................................29

Naturales.......................................................................................................................29

Artificiales......................................................................................................................29

Examen con coloración vital.............................................................................................30

Coloración intravita.......................................................................................................30

Coloración supravital....................................................................................................30

Clasificación de los colorantes vitales..............................................................................31

Naturales.......................................................................................................................31

5
 Artificiales......................................................................................................................31

Colorantes ácidos:....................................................................................................31

Colorantes básicos:...................................................................................................31

Colorantes neutros:...................................................................................................31

Colorantes indiferentes:............................................................................................31

Métodos mediatos............................................................................................................32

Postmortem...................................................................................................................32

Fijación..........................................................................................................................32

Lavado..........................................................................................................................32

Conservación de la muestra en inclusión de parafina o celoidina...............................33

Proceso de coloración..................................................................................................33

Técnicas de muestreo......................................................................................................33

Mediante citología.........................................................................................................34

Mediante biopsia...........................................................................................................34

Examen post mortem....................................................................................................34

Recomendaciones para la toma de las muestras.....................................................34

Proceso de fijación...........................................................................................................35

Cualidades de un buen fijador......................................................................................35

Relación de la cantidad de fijador y el tamaño de la muestra......................................36

Volumen del fijador...................................................................................................36

Tamaño de la muestra..............................................................................................36

Fijador simple............................................................................................................36

Fijadores compuestos...............................................................................................36

Proceso de lavado de la muestra.....................................................................................39

Proceso de inclusión en parafina celoidina......................................................................39

6
Proceso de microtomía....................................................................................................40

Clasificación de los microtomos.......................................................................................40

Microtomo de rotación tipo Minot.................................................................................40

Microtomo de deslizamiento.........................................................................................41

Proceso de coloración......................................................................................................41

Teoría de la coloración.................................................................................................41

Teoría física...............................................................................................................41

Teoría química..........................................................................................................42

Clasificación de las colorantes.........................................................................................42

Por su origen.................................................................................................................42

Colorantes naturales.................................................................................................42

Colorantes artificiales o sintéticos.............................................................................43

Clasificación de las coloraciones.....................................................................................43

Coloración directa o sustantiva....................................................................................43

Coloración indirecta o adjetiva.....................................................................................43

Coloración progresiva...................................................................................................43

Coloración regresiva.....................................................................................................44

Coloración simple.........................................................................................................44

Coloración compuesta o combinada............................................................................44

Simultánea................................................................................................................44

Sucesiva....................................................................................................................44

Coloración ortocromática..............................................................................................45

Coloración metacromática............................................................................................45

Coloración pancromática..............................................................................................45

Elaboración de láminas histológicas permanentes..........................................................45

7
Montaje.............................................................................................................................46

Conclusión........................................................................................................................47

Bibliografía........................................................................................................................48

8
 Concepto de Histología.

La histología es la rama de la biología que estudia la composición, la estructura y

las características de los tejidos orgánicos de los seres vivos. La histología se relaciona
estrechamente con la anatomía microscópica, pues su estudio no se detiene en los
tejidos, sino que va más allá, observando también las células interiormente y otros
corpúsculos, relacionándose con la bioquímica y la citología. La histología tiene
diversas subdivisiones que permiten mejorar el enfoque de estudio. [ CITATION
wik211 \l 8202 ]

Historia de la histología.

Las primeras investigaciones histológicas fueron posibles a partir del año 1600,
cuando se incorporó el microscopio a los estudios anatómicos. Marcello Malpighi es el
fundador de la histología y su nombre aún está ligado a varias estructuras histológicas.
En 1665 se descubre la existencia de unidades pequeñas dentro de los tejidos y
reciben la denominación de células. En 1830, acompañando a las mejoras que se
introducen en la microscopía óptica, se logra distinguir el núcleo celular. En 1838 se
introduce el concepto de la teoría celular.

En los años siguientes, Rudolf Virchow introdujo el concepto de que toda célula
se origina de otra célula (omnis cellula ex cellula).

El desarrollo tecnológico moderno de las herramientas de investigación permitió

un enorme avance en el conocimiento histológico. Entre ellos podemos citar a la
microscopía electrónica, la inmunohistoquímica, la técnica de hibridación in situ. Las
técnicas recientes sumadas a las nuevas investigaciones dieron paso al surgimiento de
la biología celular.

En el siglo XVII, Marcello Malpighi inventó uno de los primeros microscopios para
el estudio de pequeñas entidades biológicas.
9
 En el siglo XIX, la histología era una disciplina académica por su propio derecho.
El Premio Nobel de 1906 de Fisiología y Medicina se otorgó a los histólogos Camillo
Golgi y Santiago Ramón y Cajal, cada uno de los cuales tenía diferentes
interpretaciones acerca de la estructura neuronal del cerebro, basadas en las mismas
imágenes. Cajal ganó el premio por su teoría y Golgi por su técnica de tinción, que hizo
posibles dichos estudios. En el siglo XVIII, M. F. Xavier Bichat fue designado padre de
la histología moderna, al ser capaz de clasificar los tejidos e identificar el origen
microscópico de las enfermedades.

En el siglo XIX, fue esencial el reconocimiento de la célula como unidad mínima

de los seres vivos (H. Dutrochet, J. P. Müller y P. J. François Turpin) y como unidad
estructural y funcional de los organismos (F. T. Schwann y M. Schleiden).

En el siglo XX, año 1931, Erns Ruska inventó el microscopio electrónico con
aumento de 5000x, lo que expandió la histología a niveles más altos.

Importancia del estudio de la histología.

Los histólogos prestan cada día mayor atención a los problemas químicos. Así
por ejemplo, cunde entre ellos la aspiración a determinar con exactitud la composición
química de determinadas estructuras de la masa viva, al estudiar las enzimas, iones,
proteínas, hidratos de carbono, grasas y lipoides, fermentos, etc. en las células y en los
tejidos con el auxilio del microscopio.

La histología es de vital importancia para conocer el funcionamiento de los

organismos vivos, lo que tiene repercusiones en la investigación médica y científica en
general e, incluso, en la economía.

Por ejemplo,

Identifica las patologías que afectan la salud, bien por medio de patógenos (virus y
bacterias) así como por desequilibrios del organismo como diabetes, colesterol alto,
hemofilia, anemia, leucocitosis, etc.

10
Permite explorar hipótesis, identificar problemas y soluciones mediante el cultivo de
tejidos.

Impulsa el desarrollo de la agricultura.

Colabora en los procesos de investigación criminalística.

Brinda información especializada para la investigación arqueológica. [ CITATION

Sig17 \l 8202 ].

Instrumento para magnificar imágenes.

Los primeros instrumentos ópticos fueron los telescopios, utilizados para la

magnificación de imágenes distantes, y los microscopios, utilizados para magnificar
imágenes muy pequeñas.

En la actualidad, los instrumentos ópticos están constituidos por diversas clases

de lentes, prismas y/o espejos, que aprovechan las propiedades de la luz. Entre ellos se
pueden mencionar: la lupa, los prismáticos, el catalejo, el anteojo astronómico, la
cámara fotográfica, el microscopio compuesto, el proyector de diapositivas, el
periscopio, el retroproyector, el telescopio, etc.[ CITATION FyQ21 \l 8202 ]

Conceptos de microscopio.

Se define la microscopía como la observación de objetos muy pequeños bajo

grandes aumentos. Los aparatos que se usan para ello se denominan microscopios. En
la medicina se usan la microscopía especialmente para analizar tejidos, células,
componentes sanguíneos y microorganismos. Normalmente hay varios trabajos que
preceden la observación de un material bajo el microscopio (p.e. cortes, técnicas de
color) que permiten una mejor observación, como puede ser la estructura de una célula.

11
 Microscopio.

Es una herramienta que permite observar objetos que son demasiado pequeños
para ser observados a simple vista. El tipo más común y el primero que fue inventado
es el microscopio óptico. Se trata de un instrumento que contiene dos lentes que
permiten obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por refracción. La
ciencia que investiga los objetos pequeños utilizando este instrumento se llama
microscopía. [ CITATION wik212 \l 8202 ]

Clasificación de los microscopios.

De acuerdo de su fuente luminosa:

Microscopio de luz visible.

En el microscopio óptico la muestra es iluminada mediante luz visible. Esto

significa que existe un foco de luz apuntando hacia la muestra. Esa misma luz es
conducida a través del objetivo y del ocular hasta llegar a formar la imagen en el ojo del
observador. Este es el tipo de microscopio más habitual pero su resolución está limitada
por la difracción de la luz. El aumento máximo que se puede obtener con este tipo de
microscopio alcanza alrededor de 1500x.

Microscopio de luz polarizada.

También conocido como microscopio petrográfico. Este microscopio es en

realidad un tipo de microscopio óptico al que se la han añadido dos polarizadores. Esto
significa que la onda de luz utilizada para observar la muestra tiene una dirección de
oscilación concreta. Este tipo de microscopio es muy útil para observar estructuras
cristalinas de rocas y minerales.

12
Microscopio óptico compuesto.

Este tipo de microscopio es aquél que dispone de por lo menos dos lentes. Este
es el caso más habitual en todos los microscopios modernos. Normalmente los
microscopios disponen de distintas lentes tanto en el objetivo como en el ocular para
corregir las aberraciones ópticas y alcanzar una imagen con buena calidad. La
invención del microscopio está asociada con la invención del microscopio compuesto.
Este apareció en los Países Bajos a finales del siglo XVI.

Microscopio de contraste de fase.

La luz viaja a distintas velocidades dependiendo del medio de propagación. Esta

propiedad es utilizada en el microscopio de contraste de fases ya que la luz atraviesa la
muestra con distintas velocidades en distintas secciones. Este efecto es amplificado
para generar la imagen de la muestra. Mediante esta técnica no hace falta utilizar tintes
y, por lo tanto, pueden observarse células vivas. El microscopio de contraste de fases
fue inventado por Frits Zernike en 1932 y recibió por ello el premio Nobel de física en
1953.

Microscopio de interferencia.

Es un sistema de microscopio contraste de fases bastante complejo la cual

produce imágenes en blanco y negro en un fondo color gris. De este microscopio se
desprenden tres tipos con características diferentes cada uno, el microscopio de
interferencia diferencial, de interferencia Nomarski y de contraste de interferencia. No
obstante, definiremos estos tres tipos más adelante, al igual que las características que
los diferencian.

Microscopio de campo oscuro.

Esta técnica de microscopía consiste en iluminar la muestra oblicuamente. De

este modo los rayos de luz que llegan al objetivo no provienen directamente del foco de

13
luz sino que han sido dispersados primero por la muestra. Esta técnica permite ver
muestras que de otro modo no serían visibles debido a su transparencia. También tiene
la ventaja que no requiere teñir la muestra para aumentar su contraste y poder
observarla.

Microscopio de luz invisible.

Microscopio de rayos X.

Microscopio de rayos X de súper-resolución permite la observación del interior

celular. ... El poder de penetración de los rayos-x puede ser usado para investigar,
células incrustadas o estructuras subcelulares.

Los nuevos microscopios de rayos X tienen una resolución bastante mejor que la
de los microscopios ópticos. Sirven, además, para trazar mapas de la distribución de
ciertos elementos químicos. Algunos pueden formar imágenes en tiempos brevísimos, y
los hay incluso que prometen capacidades tan especiales como la de obtener imágenes
tridimensionales.

Microscopio de luz ultravioleta.

Los microscopios de luz ultravioleta iluminan la muestra, como el nombre indica,
con luz ultravioleta. Este tipo de luz tiene una longitud de onda más corta que la luz
visible utilizada en los microscopios ópticos. La ventaja principal de utilizar esta técnica
es que puede alcanzarse una resolución mejor que con luz visible. Además, el contraste
obtenido en la muestra es distinto que en los microscopios ópticos. De este modo, con
el microscopio de luz ultravioleta pueden observar muestras que aparecen
transparentes si son observadas con luz visible.

Microscopio electrónico.
En el microscopio electrónico la muestra no es iluminada con luz sino que se
utilizan electrones. Los electrones impactan contra la muestra dentro de una cámara de
vacío. Existen diferentes tipos de microscopio electrónico pero su principio de
14
funcionamiento se basa siempre en capturar los electrones dispersados u omitidos por
la muestra y así poder reconstruir una imagen.

La ventaja principal de este tipo de microscopio es que puede obtenerse un nivel

de aumento muy superior al del resto de microscopios. Sin embargo, es necesario
preparar la muestra y colocarla en una cámara de vacío de modo que no es posible
observar muestras biológicas vivas. Los dos tipos de microscopio electrónicos
principales son el microscopio electrónico de barrido y el microscopio electrónico de
transmisión.

Microscopio confocal.
Este es un tipo de microscopio de fluorescencia. En lugar de iluminar la muestra
de forma global se ilumina punto a punto de forma sucesiva y se reconstruye la imagen
al final del proceso. Este proceso de escaneado de la muestra es similar al que se
produce en los microscopios electrónicos de barrido. Este tipo de microscopio fue
inventado por Marvin Minsky en 1957.

Microscopio de fluorescencia.
Los microscopios de fluorescencia son aquellos que utilizan las propiedades de
fluorescencia para generar una imagen de la muestra. Este microscopio permite
observar sustancias que emiten luz propia cuando son iluminadas con una longitud de
onda determinada. Para ello la muestra es habitualmente iluminada con una lámpara
xenón o con una lámpara de vapor de mercurio. Estos microscopios incorporan además
filtros de luz para aislar la luz correspondiente a la muestra. [ CITATION Mun21 \l 8202 ]

Microscopio electrónico de transmisión.

La principal característica del microscopio electrónico de transmisión es que se
utilizan los electrones que atraviesan la muestra.

En primer lugar los electrones son conducidos hacia la muestra mediante las
lentes electromagnéticas. Cuando los electrones impactan contra la muestra, algunos
de ellos consiguen atravesarla y otros son dispersados. Los electrones que pueden
pasar al otro lado de la muestra son capturados por un detector dando lugar así a una
imagen.

15
 La cantidad de electrones que atraviesa la muestra sin desviarse varía en función
de las características internas de la muestra. Dicho de otro modo, hay partes de la
muestra que presentan más transparencia a los electrones que otras. Esto da lugar a
zonas más oscuras (menos electrones atraviesan la muestra y llegan al detector) y
zonas más claras (más electrones atraviesan la muestra y llegan al detector).

Para utilizar esta técnica es necesario preparar la muestra para que sea muy
delgada (espesor inferior a 2000 ángstroms). De lo contrario, demasiado espesor
impide que los electrones puedan atravesarla.

Microscopio electrónico de barrido (MEB).

En el microscopio electrónico de barrido también es necesario que los electrones
impacten contra la muestra. En este caso, los electrones no iluminan toda la muestra
simultáneamente sino que se hace un escaneado recorriendo los distintos puntos de la
muestra.

Cuando los electrones impactan con la muestra estos pierden parte de su

energía debido a distintas interacciones. Parte de su energía inicial se transforma en
calor o en emisiones de rayos X. Además, se produce también la emisión de electrones
que se desprenden de la superficie de la muestra. Estos electrones se conocen como
electrones secundarios.

El principio de funcionamiento de los microscopios electrónicos de barrido se

basa en medir alguna de estas propiedades para extraer información de la muestra
observada. Generalmente, esto consiste en medir la cantidad de electrones
secundarios que emite la superficie cuando es bombardeada con electrones.

Microscopio de acuerdo al número de oculares:

Microscopio monocular.
Este tipo de microscopio dispone de un solo ocular a través del cual se puede
observar la muestra. Es el tipo más sencillo y es ideal para aficionados a la microscopía
o para alguien que se introduce en este campo. Su desventaja principal es que puede
resultar un poco incómodo si tiene que utilizarse durante largos periodos de tiempo. Por

16
este motivo los microscopios monoculares no son en general utilizados en ámbitos
profesionales.

Microscopio binocular.
Los microscopios binoculares disponen, como indica su nombre, de dos
oculares. Esto permite observar la muestra simultáneamente con los dos ojos
resultando en una mayor comodidad para el usuario. Este es el tipo de microscopio más
utilizado en los laboratorios de investigación. La distancia entre los dos oculares puede
regularse para adaptarse a las necesidades del usuario. No hay que confundir el
microscopio binocular con el microscopio estereoscópico. El microscopio
estereoscópico siempre es binocular. Sin embargo, no todo microscopio binocular es
estereoscópico.

Microscopio trinocular.
El microscopio trinocular está equipado con dos oculares para observar la
muestra además de un tercer ocular para conectar una cámara. En el caso de conectar
una cámara digital esta puede conectarse a un ordenador para ver las imágenes de la
muestra en tiempo real. Con este microscopio es posible observar la muestra y al
mismo tiempo tomar fotografías o videos con la cámara.

Microscopio óptico.

El microscopio óptico es uno de los inventos que ha marcado un antes y un

después en la historia de la ciencia, especialmente en el campo de la biología y la
medicina. Esencialmente se puede definir como un instrumento que permite observar
en un tamaño aumentado elementos que son imperceptibles a simple vista.

Existen varios tipos de microscopio, cada uno con diferentes características y

principios de funcionamiento. El microscopio óptico fue el que inauguró la era de la
microscopía en el siglo XVII. Es el tipo más básico de microscopio, su funcionamiento
está basado en un conjunto de lentes y el uso de luz visible para aumentar la imagen de
una muestra. A continuación podemos ver en más detalle las partes básicas de un

17
microscopio óptico así como una explicación básica de su funcionamiento. [ CITATION
Mun21 \l 8202 ]

Partes mecánicas del microscopio óptico.

El sistema óptico:

Incluye el conjunto de lentes y elementos de manipulación de la luz necesarios

para generar una imagen aumentada.

Dentro del sistema óptico se incluye un foco (también denominado fuente de luz)
que emite rayos de luz dirigidos hacia la muestra. Antes de llegar a la muestra los rayos
atraviesan un condensador, la función del cual es concentrar los rayos de luz sobre la
preparación a observar. Habitualmente el condensador está acoplado con un diafragma
para regular la cantidad de luz incidente. El siguiente elemento óptico es el objetivo.
Esta parte del microscopio consiste básicamente en un conjunto de lentes que reciben
la luz proveniente de la muestra y permiten aumentar la imagen observada. Por último,
el ocular amplía la imagen proveniente del objetivo y es a través de él que se puede
observar finalmente la muestra.

18
 El sistema mecánico.
Proporciona el soporte estructural
a los anteriores elementos. La siguiente
imagen muestra las partes esenciales
del microscopio.

Dentro del sistema óptico se

incluye un foco (también denominado
fuente de luz) que emite rayos de luz
dirigidos hacia la muestra. Antes de llegar a la muestra los rayos atraviesan un
condensador, la función del cual es concentrar los rayos de luz sobre la preparación a
observar.

El siguiente elemento óptico es el objetivo. Esta parte del microscopio consiste

básicamente en un conjunto de lentes que reciben la luz proveniente de la muestra y
permiten aumentar la imagen observada. Por último, el ocular amplía la imagen
proveniente del objetivo y es a través de él que se puede observar finalmente la
muestra.

Fenómeno físico óptico asociado a la microscopia.

Lente convergente.
Una lente convergente es una lente que dirige los rayos de luz incidente hacia un
punto común conocido como foco.

La siguiente imagen muestra como los rayos de luz que inciden a través de la
lente siguiendo trayectorias paralelas convergen en un punto situado al otro lado de la
lente.

19
 Lente convergente

Las lentes convergentes tienen esta propiedad debido a la distribución de su

material. En general, las lentes convergentes son delgadas en los bordes y más
gruesas en su centro.

Esta distribución del espesor hace que la desviación de un rayo varíe según el

punto donde incide. En consecuencia, los rayos incidentes acaban juntándose en el
foco.

De forma inversa, un rayo que llegue a la lente siguiendo una trayectoria que
pase por el foco será desviado en el otro lado de la lente siguiendo una trayectoria
paralela.

Rayo incidente que pasa por el foco

En función de las características geométricas pueden distinguirse distintos tipos
de lentes convergentes. En este artículo te presentamos cuáles son estos tipos de
lentes así como los parámetros que debes conocer para definir sus características.

20
Tipos de lentes convergentes
Las lentes convergentes pueden clasificarse en función de la curvatura en la
superficie de sus dos lados. A partir de esta curvatura pueden diferenciarse tres casos:

Lentes biconvexas: La superficie es convexa en los dos lados de la lente.

Lentes planoconvexas: Una superficie es totalmente plana y la otra es convexa.

21
 Lentes cóncavoconvexas o meniscos convergentes: Estas lentes son
cóncavas por un lado y convexas por el otro.

Tipos de lentes convergentes [ CITATION Mun211 \l 8202 ]

Formación de imágenes en sus lentes convergentes.

La propiedad principal de las lentes convergentes es que focalizan los rayos de
luz en un punto. Esta propiedad es debido al fenómeno conocido como refracción, que
explica la desviación de la luz cuando pasa de un medio a otro.

Dependiendo de la distancia entre el objeto observado y la lente, la imagen que

se obtiene al mirar a través de la lente variará.

En función de esta distancia puede distinguirse tres casos principales:

El objeto se encuentra a una distancia superior a dos veces la distancia focal.

El objeto se encuentra a una distancia contenida entre una y dos veces la

distancia focal.

El objeto se encuentra a una distancia inferior a la distancia focal.

Cada uno de estos casos hace que la imagen observada sea distinta.

Distancia superior a dos veces la distancia focal.

Cuando el objeto observado está a una distancia superior a dos veces la
distancia focal (d > 2f), la imagen que se forma es una imagen invertida y de tamaño
menor al tamaño real.

22
 Como puedes ver en el siguiente esquema, los rayos que pasan a través de la
lente convergen al otro lado creando una imagen invertida. Esta imagen creada al otro
lado de la lente se conoce como imagen real.

En este caso la lente convergente no actúa como lente de aumento ya que

produce una imagen de tamaño inferior al tamaño real del objeto.

Cuando la distancia entre el objeto y la lente es exactamente igual a dos veces la

distancia focal, entonces la imagen obtenida tiene exactamente el mismo tamaño que el
objeto real.

Distancia entre una y dos veces la distancia focal.

Si el objeto está situado a una distancia de entre una y dos veces la distancia
focal (f < d < 2f), entonces se forma una imagen real de tamaño superior al objeto real.

En este caso la imagen formada aparece también invertida respecto al objeto

original. El siguiente esquema muestra la trayectoria de los rayos en este caso. Dado
que la imagen del objeto se forma al otro lado de la lente se conoce también como
imagen real.

23
 La particularidad de este caso es que la imagen obtenida tiene un tamaño real
superior al del objeto real. En consecuencia, la lente convergente actúa como una lente
de aumento pero invirtiendo la imagen.

Distancia inferior a la distancia focal.

Existe un tercer caso en el que el objeto se encuentra a una distancia de la lente
inferior a la distancia focal (d < f).

En este caso los rayos no convergen al otro lado de la lente como puedes ver en
el siguiente esquema. En consecuencia, el objeto es observado como si sus rayos
fueran emitidos en un punto más lejano.

En este caso la imagen se forma en el mismo lado que el objeto observado y se

conoce como imagen virtual. Esta imagen virtual tiene un tamaño superior al del objeto

24
real y como consecuencia en estos casos la lente actúa como una lente de aumento.
[ CITATION Mun212 \l 8202 ].

Conceptos asociados a la microscopia.

Angulo de abertura.

Esquema que muestra un objeto (1) que es atravesado por un haz de rayos
luminosos (2) los cuales son captados por el objetivo (3). Al formarse el cono de luz
proveniente del objeto se determina un ángulo, también llamado de apertura, donde a
representa la mitad del mismo.

Figura del angulo de apertura

Poder de resolución.
Es la capacidad que tiene un sistema óptico de aislar dos puntos que se
encuentran muy próximos entre sí, de manera que se puedan ver individualizados uno
del otro. La riqueza de detalles que puede ser observada al microscopio depende de la
habilidad de este para hacer que los puntos del objeto que están muy cercanos
aparezcan en la imagen como puntos separados. Mientras más corta sea la distancia

25
entre esos puntos del objeto, más finos serán los detalles. La distancia entre esos dos
puntos se conoce como Límite de Resolución, el cual es también referido como el
Poder de Resolución y puede ser utilizada como un indicador del rendimiento del
microscopio. Esto se puede comparar vagamente con algunos aspectos de la
informática, el tamaño del pixel por ejemplo; mientras más pequeño sea el tamaño,
mayor será la cantidad de detalles de la imagen digital.[ CITATION ULA21 \l 8202 ]

La distancia mínima entre dos puntos que pueden verse separada. En un

microscopio óptico este valor es de 0,2 décimas de micrómetro mientras que en el
electrónico es de 10 A.

El poder de resolución se calcula con la fórmula: 0.61 x Lambda / n SEN

omega

Lambda: longitud de onda de luz empleada (para la luz habitual se utiliza 550
ma)

n: índice de refracción del medio de la trayectoria de la luz

Omega: ángulo de desviación que sufre

n x SEN omega es igual a la apertura del objetivo (AN). Este dato está presente
en el objetivo del microscopio. ¡No hace falta realizar muchos cálculos![ CITATION
com11 \l 8202 ] .

Poder de penetración.
Es la capacidad que tiene un microscopio de poder realizar una observación simultánea
de dos o más planos de la muestra.

Distancia focal.
La distancia focal o longitud focal de una lente es la distancia entre el centro
óptico de la lente y el foco (o punto focal). La inversa de la distancia focal de una lente
es la potencia, y se mide en dioptrías.

Para una lente positiva (convergente), la distancia focal es positiva. Se define

como la distancia desde el eje central de la lente hasta donde un haz de luz de rayos

26
paralelos colimado que atraviesa la lente se enfoca en un único punto. Para una lente
negativa (divergente), la distancia focal es negativa. Se define como la distancia que
hay desde el eje central de la lente a un punto imaginario del cual parece emerger el
haz de luz colimado que pasa a través de ella.

Para un espejo con curvatura esférica, la distancia focal es igual a la mitad del
radio de curvatura del espejo. La distancia focal es positiva para un espejo cóncavo, y
negativa para un espejo convexo. En la convención de signos utilizada en el diseño
óptico, un espejo cóncavo tiene un radio de curvatura negativo.[ CITATION wik11 \l
8202 ]

Distancia frontal.
Es la distancia de la lente frontal al preparado colocada en la platina, cuando
está enfocado. Disminuye cuando aumenta la escala de reproducción del objetivo.

Aumento propio.
El aumento de un microscopio es una de sus características esenciales que
define su calidad y el tipo de muestras que se podrán observar.

En el caso del microscopio óptico compuesto, el aumento de la muestra se

produce en dos etapas, primero en las lentes del objetivo y a continuación en las lentes
del ocular. De este modo, es necesario conocer el aumento de estas dos partes del
microscopio para conocer el aumento total que se obtiene. El aumento total del
microscopio se puede calcular fácilmente multiplicando el aumento del objetivo por el
aumento del ocular:

Aumento microscopio = Aumento objetivo × Aumento ocular

Por ejemplo combinando un objetivo con un aumento de 60x con un ocular de

10x se obtiene un aumento total de 600x.

Formación de la imagen definitiva en el microscopio óptico.

La imagen en un microscopio se forma por la transmisión de los rayos

provenientes de una fuente luminosa a través del objeto. Los rayos luminosos

27
atraviesan el diafragma, que a manera de iris, delimita el diámetro del haz lumínico que
penetra por el condensador. Este último, está formado por un sistema de lentes
convergentes que concentra y proyecta el haz lumínico sobre el objeto a examinar, a
través de la abertura de la platina. El objetivo recoge la luz que atravesó el objeto
examinado y proyecta una imagen real, invertida y aumentada que se forma dentro del
tubo y que es recogida por el ocular que es la segunda lente, la cual forma una imagen
virtual, invertida y aumentada del objeto examinado.

Fuente de luz.
El sistema de iluminación del microscopio es necesario para producir, filtrar y
dirigir los rayos de luz hacia la preparación que quiere observarse.

Este sistema es esencial en los microscopios ópticos de luz transmitida, que

funcionan gracias a un haz de luz que ilumina y atraviesa la muestra antes de llegar al
objetivo.

Natural.
Los primeros microscopios utilizaban para ello luz natural que dirigían hacia la
muestra mediante espejos.

Artificial.
Actualmente existen básicamente dos tecnologías para crear incorporar una fuente de
luz en el microscopio. Una es la bombilla incandescente y otra más moderna son los
emisores LED.

Filtro de luz.
En microscopia se usan los filtros para trabajar con determinadas iluminaciones como
polarización o fluorescencia

Para analizar determinadas muestras celulares tenemos que usar técnicas más
avanzadas como puede ser la polarización o la fluorescencia. Estas técnicas requieren
de filtros específicos para poder completar la observación.

Sin la presencia de estos filtros, la observación de bacterias, células y otros

microorganismos nos sería muy difícil.

28
Tipo de iluminación.

Central.
No se interpone ningún elemento más allá de un filtro de luz de día (color azul),
que simplemente modifica la temperatura de color de la iluminación proveniente de una
lámpara convencional haciéndola más fría, más azulada, y de esa manera es más
natural y menos molesta a la vista (lámina 1A).

Lateral u oblicua de capo oscuro.

Se interpone un dispositivo opaco entre el haz de luz y la muestra que solo
permite pasar los rayos periféricos y el objetivo solo recibe aquellos rayos dispersados
por la muestra, mientras el resto se pierde. De esta manera observamos unos límites
muy definidos sobre un fondo oscuro. Es muy útil para muestras que no se pueden teñir
y preparaciones en vivo (lámina 1B).

Técnicas Histológicas.

Se denomina técnica histológica al conjunto de operaciones a que se somete una

materia organizada, a fin de que sea posible su estudio por medio del microscopio,
posibilitando la observación de estructuras no visibles al ojo humano.

Método de examen.

Métodos inmediatos.

In vivo al estado fresco.

Animales microscópicos uni o multicelulares, células libres de animales
superiores (descamadas naturalmente, por raspado o por extracción, por pincelamiento,
etc.), componentes celulares que quedan libres por métodos que desintegran la célula
(mitocondrias, núcleo, membrana plasmática), órganos muy delgados (mesenterio, o
cortes finos directos de tejidos como el cartilaginoso), células obtenidas de cultivos de
tejidos. En éstos casos, para evitar la desecación y prolongar las posibilidades de

29
observación, se agregan líquidos como suero sanguíneo, suero fisiológico a
temperatura semejante a la del animal, usando platinas calientes a 36º - 37º C.

Examen con coloración vital.

Usando soluciones muy diluidas de colorantes no tóxicos, que se introducen por
vía digestiva o por inyecciones, o que actúan sobre células libres.[ CITATION deG13 \l
8202 ]

Material.

Es el tejido o muestra la cual va hacer objeto de estudio por medio del uso del
microscopio, el material puede provenir de distintas fuentes y se debe de cumplir unas
series de paso para la obtención del mismo evitando que el material se contamine.

Origen del material.

a) Biopsias quirúrgicas.

b) Material obtenido de necropsias.

c) Utilización de animales de laboratorio.

d) Estudios experimentales en animales o vegetales.

e) Material obtenido por cultivo de tejidos.

f) Frotis o extendidos.

En la obtención del material histológico hay que cumplir con varias reglas, como
ser:
 Realizar la toma del tejido del lugar correcto.
 Es preciso obrar con cuidado y precaución, a fin de evitar la destrucción de los
tejidos.
 Cortar la pieza de órganos macizos en trozos pequeños (entre 1 y 3 cm. x 0,5
cm.), teniendo en cuenta la configuración anatómica.

30
  Los órganos huecos no deben ser muy distendidos para que se conserve su
aspecto normal.
 Realizar éste proceso con la mayor rapidez posible para evitar la autodestrucción
del tejido (autólisis).

Procedimiento.

El proceso histológico comienza con la obtención del tejido objeto de estudio. En

el caso de los tejidos vegetales directamente se toman muestras de los distintos
órganos que componen el cuerpo de la planta, mientras que para los tejidos animales
podemos optar por dos opciones: coger una porción del tejido u órgano y procesarla o
procesar primero el animal completo y luego extraer la muestra que nos interese. En
cualquier caso las muestras son habitualmente fijadas con unas soluciones líquidas
denominadas fijadores, las cuales se usan para mantener las estructuras celulares y
moleculares inalterables durante el procesamiento posterior y con una organización lo
más parecida posible a como se encontraban en la muestra viva. También podemos
fijar las moléculas de los tejidos por congelación rápida. Fijar un tejido es como hacer
una fotografía de dicho tejido, su estructura se mantendrá hasta su observación.
[ CITATION Atl20 \l 8202 ]

Líquidos indiferentes.

Constituyen un medio adecuado para conservar la vida de ciertos elementos de

los tejidos, durante un periodo determinado de tiempo.

Naturales.
 Plasma.
 Suero Sanguíneo.
 Líquido Amniótico, líquido Ascítico y Humor Acuoso.

Artificiales.
 Ringer.

31
  Locker.
 Tyrode.
 Líquidos que contienen Cloruro de Sodio, Potasio y Calcio.[CITATION htt \l
8202 ]

Examen con coloración vital.

En ciertos casos, cuando se requiera destacar alguna estructura celular o tisular

se pueden emplear colorantes inocuos para la vida de las células, no modifican la
estructura de ellas ni interfieren en sus funciones. A este procedimiento se le conoce
como coloración vital.

Para el estudio de las manifestaciones vitales de las muestras suelen emplearse

una serie de microinstrumentos que facilitan la introducción, al interior de las células, de
sustancias o la extracción de ciertos componentes mediante microinyectores,
micropipetas, microelectrodos o instrumentos que emiten haces sumamente delgado de
radiaciones de alta energía (rayos laser).

Coloración intravita.
Consiste en la administración de colorantes vitales a través de las vías digestiva
o intratraqueal; mediante inyecciones sanguíneas, linfáticas, subcutánea, o
intraperitoneal. Las soluciones de uso más frecuente son: tinta china, carmín de litio,
azul tripan (partículas colorantes que demuestran la capacidad fagocítica).

Coloración supravital.
En este procedimiento se emplean colorantes que se aplican a células o tejidos
provenientes de organismos vivos. Se demuestran: mitocondrias con el verde de Jano,
los gránulos de las células cebadas con el rojo neutro, la sustancia granulofilamentosa
de los reticulocitos con el azul brillante de cresyl, ramificaciones nerviosas con el azul
de metileno; o el ADN y el ARN de las células con naranja de acridina (empleando el
microscopio de fluorescencia).[ CITATION Mon10 \l 8202 ]

32
 Clasificación de los colorantes vitales.

Los colorantes se pueden clasificar según su origen o según su naturaleza

química. Si atendemos a su origen tenemos la siguiente clasificación:

Naturales.
Los colorantes naturales se subdividen, a su vez, en orgánicos e inorgánicos.
Los orgánicos se subdividen, también, según su naturaleza animal o vegetal.

Artificiales.
También denominados colorantes sintéticos. Adquieren la clasificación que se le
atribuye a los colorantes tradicionales, conformados por colorantes ácido, básico,
neutro e indiferente.

Según su naturaleza química tenemos los siguientes colorantes, que serán

definidos en el siguiente apartado:

Colorantes ácidos: Tienen especial afinidad por las estructuras básicas de

las células, como por ejemplo la hemoglobina. Algunos ejemplos son la eosina y el
ácido pícrico.

Colorantes básicos: Tienen especial afinidad por las estructuras ácidas de

las células, como por ejemplo los ácidos nucleicos. Algunos ejemplos son el azul de
metileno, el azul de toluidina o la hematoxilina.

Colorantes neutros: Están compuestos por sales de un ácido y de una base

coloreada. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro. Un ejemplo es el
eosinato de azul de metileno.

Colorantes indiferentes: No tienen especial afinidad por estructuras ácidas o

básicas. Además, presentan insolubilidad al agua. Un ejemplo es el Sudán III.
[ CITATION Rod17 \l 8202 ]

33
 Métodos mediatos.

Tienen por finalidad preparar células, tejidos y órganos procedentes de seres en

los que los procesos vitales se han detenido y es necesario conservar la estructura que
tenían en vida.

Postmortem.
Exigen la muerte de las células y seguir una serie de pasos que constituyen
la Técnica Histológica Universal, ya que se utiliza en todos los laboratorios y sus
resultados se interpretan de la misma manera.

Fijación.
Es un procedimiento cuya finalidad, al aplicarlo es detener la vida de las células e
impedir las modificaciones post mortem que pueda sufrir la célula (procesos autolíticos),
manteniendo la estructura morfológica de células y tejidos sin que ocurran cambios
notables en ellos.

Esto se consigue inmovilizando (por coagulación o precipitación) las moléculas

proteínicas e inhibiendo principalmente las enzimáticas haciéndolas insolubles. Esta
acción garantiza la integridad de las células y tejidos; se efectúa por mediante agentes
químicos denominados fijadores.

En este paso el tejido obtenido se coloca en una sustancia fijadora,

generalmente líquida, para evitar los cambios post-mortem y para lograr conservar la
forma original del tejido. Unos de los fijadores más usado es el formol al 10%
(formaldehído).En el caso de que realicemos estudios mediante el microscopio
electrónico, deberemos usar otros fijadores más específicos como paraformaldehido,
glutaraldehido y tetróxido de osmio.

Lavado.
Se debe lavar el tejido para quitar el exceso de fijador (químico). El exceso de
fijador durante el posterior proceso de infiltración, incluso en la microtomía, podría
afectar los cortes histológicos, y por ello se debe lavar con agua destilada.

34
Conservación de la muestra en inclusión de parafina o celoidina.
Tiene como finalidad proporcionarle al tejido un soporte sólido que posibilite
realizar un corte muy fino, por lo que es de suma importancia que el medio utilizado
para la inclusión penetre al interior del tejido. Aquí se forman bloques de parafina dentro
de los cuales están las muestras a estudiar. También hay máquinas especializadas
para la inclusión en parafina de tejidos. Después de su inclusión y posterior secado,
estos se deben poner a enfriar en un congelador para su posterior corte. Puede llevarse
a cabo en Parafina.

La parafina utilizada en la Técnica Histológica es una mezcla de cadenas de 22

carbonos hasta 29 carbonos, variando su punto de fusión entre 45º a 60º C, según su
composición. Como su nombre lo indica, es una sustancia químicamente inactiva, por lo
que puede conservarse indefinidamente en la estufa. Se liquefacta con facilidad a los
56º C y a temperatura ambiente se encuentra en estado sólido. Las piezas, después de
haber sido aclaradas, se pasan a una mezcla de parafina líquida y líquido intermediario
en partes iguales y se las lleva a la estufa durante una hora. Luego se las introduce en
un recipiente que tenga parafina líquida y se guarda en la estufa para que la parafina
impregne totalmente el tejido en toda su intimidad. La inclusión completa de las piezas
dura aproximadamente 4 horas.

Proceso de coloración.
La mayoría de los tejidos, sobre todo los de los animales, son incoloros y por ello
necesitamos teñirlos para observar sus características morfológicas con el microscopio
óptico. Ello se consigue con el uso de los colorantes, sustancias coloreadas que son
capaces de unirse de manera más o menos específica a estructuras del tejido
aportándoles color.

Técnicas de muestreo.

La calidad y la fidelidad con que una célula o un tejido muestren una imagen al
microscopio, con las características morfológicas que poseían cuando estaban con
vida, dependen esencialmente de la prontitud y el cuidado que se aplicó para obtener la
muestra.
35
 Existen diversos procedimientos que permiten obtener muestras de tejidos y
órganos para conseguir preparaciones histológicas de buena calidad. Estos son:

Mediante citología.
El estudio de células de superficies epiteliales de renovación constante (mucosas bucal,
gástrica, vaginal, uretral), se realiza a través de la Citología Exfoliativa. En otros casos
células obtenidas mediante punción (células sanguíneas o de la médula ósea) se
extienden en una lámina portaobjetos para hacer los “frotis”, colorearlas y examinarlas.

Mediante biopsia.
Del griego bios = vida y opsis = visión, consiste en la toma de un fragmento de
tejido u órgano de un ser vivo. Realiza a través de una operación quirúrgica hecha
exprofesamente o durante la intervención quirúrgica efectuada en pacientes y
corroborar así un diagnóstico de una determinada lesión. La biopsia puede ser:

 Incisional.
 Excisional.
 Por sacabocados.
 Por punción y absorción.
 Por raspado.
 Por trepanación.

Examen post mortem.

Las muestras se obtienen de seres muertos: En este caso es recomendable que
los tejidos y órganos se obtengan inmediatamente después de producida la muerte.

Recomendaciones para la toma de las muestras.

Los tejidos y los órganos provenientes de biopsias y necropsias se seccionar
empleando bisturís o navajas de afeitar nuevos, sin hacer presión sobre ellos. No es
recomendable el uso de tijeras para cortar los tejidos pues éstas ocasionan
compresiones y jalonamientos de los tejidos y órganos que distorsionar su estructura
microscópica. El tamaño de las muestras no debe exceder de 10 mm por lado con un
grosor de 5 mm. [ CITATION Mon10 \l 8202 ]

36
 Proceso de fijación.

Por medio de la fijación se busca interrumpir el desarrollo de los procesos

orgánicos fijando y conservando de la manera más fidedigna posible el estado y la
situación en que se encontraban los tejidos en vida. Los tejidos deben ser fijados
inmediatamente después de extirparlos; ésta es la única forma de interrumpir
instantáneamente los procesos vitales. Si la fijación se produce algún tiempo después
de la obtención del material, puede suceder que ya hayan comenzado los procesos de
post – mortem. En un organismo muerto pueden tener lugar varios tipos de
desintegración, como por ejemplo, “la autólisis”, que consiste en la destrucción de los
tejidos por sus propias enzimas locales producidas por los lisosomas. El segundo tipo
de desintegración consiste en la “putrefacción”, en donde se produce la destrucción de
los tejidos en acción conjunta con las bacterias.

Cualidades de un buen fijador.

Una sustancia fijadora para que ejerza de manera eficiente y adecuada sus
funciones debe poseer las siguientes condiciones:

 Matar inmediatamente a las células, impidiendo la aparición de los procesos

autolíticos. Para tal fin el fijador debe poseer:

Un buen poder de penetración, que en contados instantes se introduzca con

rapidez en el espesor de la muestra

Un buen poder de difusión, que no fije sólo la porción superficial de la muestra

sino que alcance las porciones más profundas de la misma.

 Producir cierta dureza a los tejidos sin que se provoque excesiva retracción o
hacerlos quebradizos y friables.
 Debe de ser de fácil manipulación.
 No debe disolver componentes celulares.
 Que sea fácil de conseguir y que sea barato.

37
Relación de la cantidad de fijador y el tamaño de la muestra.

Volumen del fijador.

Una proporción que es necesario emplear será de 1 a 20 (muestra – fijador).
Será la más adecuada para garantizar una buena fijación.

Tamaño de la muestra.
El tamaño y grosor de las muestras deben ser pequeñas y delgadas, de 1cm² a
2cm² y con un espesor de 2 mm a 5 mm, especialmente si se emplean fijadores con
escaso poder de penetración y de difusión.

Fijador simple.
Está considerado como la sustancia fijadora de mayor uso en los laboratorios que
realizan técnica histológica. El formol comercial consiste en una solución acuosa del
gas formaldehido al 39 - 40%.

Se le emplea en una solución al 10% (10 del formol comercial y 90 partes de

agua).

El tiempo de fijación de las muestras, dependiendo del tamaño de ellas, debe

ser de 24 a 48 horas como mínimo y si es posible, en refrigeración.

Fijadores compuestos.
Una sola sustancia fijadora difícilmente reúne todas las condiciones para ejercer
una buena fijación, por lo tanto es aconsejable usar mezclas fijadoras a través de las
cuales se acrecientan las cualidades de un fijador y se atenúan sus defectos y
desventajas.

A continuación se presentan algunos ejemplos de fijadores compuestos o

mezclas fijadoras que se emplean con mayor frecuencia:

38
  Formol - fosfato (formol tamponado):
- solución de formaldehído (37% a 40%)--------------100 ml
- agua destilada ------------------------------------------- 900 ml
- fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4 - H2O)-----4.0 gr
- fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4)------------------6.5 gr

Suele emplearse como un fijador de rutina, al igual que el formol al 10%. Posee un
pH de 6.8 a 7.0 aproximadamente. Es ligeramente hipotónico.

 Formol - bicloruro de mercurio.

- solución de formaldehído (37% a 40%)--------------150 ml

- agua destilada--------------------------------------------850 ml
- bicloruro de mercurio-------------------------------------50 gr

Es recomendable usarlo para fijar tejidos hematopoyético y linfático reticular. El material

nuclear se fija de manera precisa y nítida. Facilita la tinción de fibras colágenas y
células conjuntivas mediante el empleo de colorantes que tienen como base a las
anilinas. Los tejidos no deben mantenerse mucho tiempo en fijación (no más de 48
horas) porque se endurecen demasiado. HgCl2 es una sustancia que corroe el
instrumental metálico.

 Formol - cloruro de calcio.

- solución de formaldehido (37% a 40%)---------------100 ml

- cloruro de calcio--------------------------------------------10 gr
- agua destilada----------------------------------------------900m

Se recomienda fijar las muestras en esta solución cuando se desean preservar

lípidos, especialmente fosfolípidos: Antes de obtener los cortes, las muestras se
incluyen en gelatina o se congelan directamente para seccionarlas con empleando
micrótomos de congelación o el criostato.

 Líquido fijador de Boüin.

- solución acuosa saturada de ácido pícrico-------------750 ml

39
- solución de formaldehido (37% a 40%)---------------250 ml
- ácido acético glacial--------------------------------------- 50 ml

Es un buen fijador de uso rutinario. Tiene un buen poder de penetración y de

difusión. Ofrece resultados satisfactorios con ciertos tricrómicos como el de Masson.
Pueden fijarse piezas de un centímetro de grosor y dos o tres centímetros de longitud.
Dependiendo del volumen de la muestra, el tiempo de fijación será de 12, 24 a 48
horas.

 Líquido fijador de Zenker ( Solución madre o stock)

- bicloruro de mercurio-------------------------------------50 gr
- bicromato de potasio--------------------------------------25 gr
- agua destilada ------------------------------------------1000 ml
La solución “madre” se puede guardar durante mucho tiempo. Cuando a ella se
le añade ácido acético forma el Líquido de Zenker.

 Líquido de Zenker (solución de trabajo):

- solución madre (stock) de Zenker-----------------------95 ml
- ácido acético glacial-----------------------------------------5 ml

En cambio, si a la solución “madre” de Zenker se le agrega formol comercial se

convierte en Líquido fijador de Helly.

 Líquido fijador de Helly

- solución madre (stock) de Zenker-----------------------90 ml

- solución de formaldehido (37% a 40%)-----------------10 ml

El formol se debe agregar antes de usar la mezcla, pues la acción reductora del
formol inhibe la actividad fijadora del bicromato de potasio. Las muestras deben ser
pequeñas y fijarse por un lapso no mayor de 24 horas, porque se endurecen en exceso,
se disminuye la basofilia de los núcleos y se incrementa la acidofilia del citoplasma.

 Fijador de Carnoy,

- alcohol etílico absoluto------------------------------------60 ml

40
- cloroformo--------------------------------------------------30 ml
- ácido acético glacial---------------------------------------10 ml
Posee un excelente poder de penetración y de difusión. Las muestras delgadas de
tejidos y órganos se fijan en dos o tres horas. Produce lisis de los eritrocitos.

Proceso de lavado de la muestra.

Al concluir la fijación, el fijador debe ser eliminado de las muestras. Para tal fin se
procede al lavado de los tejidos mediante agua o alcohol. Se evita, así, que los tejidos
se endurezcan demasiado o que ciertos componentes del fijador introduzcan
modificaciones en los tejidos e impidan una adecuada obtención de secciones delgadas
o la coloración correcta de sus componentes celulares.

Proceso de inclusión en parafina celoidina.

Los tejidos fijados adquieren cierta consistencia y dureza, pero no la suficiente

para que, de ellos, se obtengan secciones delgadas. Estas secciones, del orden de
algunas milésimas de milímetro (5 a 10 m), se conseguirán cuando los tejidos se
infiltren con sustancias denominadas “de inclusión” y adquieran tal dureza que
sometidos al filo de una navaja produzcan secciones, cortes o láminas sumamente
delgadas y transparentes.

Después de la fijación y el “lavado” de las muestras, éstas se encuentran

embebidas en agua o en alcohol, por lo que resulta imposible que se infiltren con
parafina, medio de inclusión insoluble en agua y alcohol. Por lo tanto, para que los
tejidos puedan ser incluidos en parafina se requiere deshidratarlos e infiltrarlos con el
solvente de la sustancia de inclusión.

Los pasos a seguir para la inclusión de las muestras en parafina son:

a) Deshidratación.

b) Impregnación en el solvente (a este paso también se le denomina aclaración

o diafanización).

41
 c) Inclusión y formación del bloque de parafina.

Proceso de microtomía.

En esta etapa, los tejidos y la parafina integran un solo bloque que, posee la
dureza y la consistencia suficientes para obtener secciones delgadas y transparentes.

Las secciones delgadas o “cortes” se obtienen utilizando instrumentos mecánicos

diseñados para que en forma más o menos automática, seccionen el bloque de parafina
en cortes delgados y de grosor uniforme. Los instrumentos se denominan “microtomos”.

El sistema de funcionamiento de los microtomos consta de cuatro mecanismos

principales:

 sujeción del bloque de parafina.

 sujeción de la navaja.
 El que permite que el filo de la navaja seccione al bloque en cortes delgados y de
grosor uniforme.
 El de avance del bloque en un número determinado de micrómetros después que se
ha obtenido un corte.

Clasificación de los microtomos.

Los microtomos se clasifican de acuerdo a la manera como se desplaza el bloque

que contiene el tejido incluido; así, existen:

Microtomo de rotación tipo Minot.

Mediante una manivela circular denominada volante, el mecanismo que sujeta al

bloque de parafina se desplaza frente al filo de la navaja, de arriba hacia abajo y
viceversa en un movimiento vertical.

Los microtomos tipo Minot son los de uso más frecuente en cualquier laboratorio
donde se realiza técnica histológica, especialmente cuando los tejidos están incluidos
en parafina.

42
 Los microtomos tipo Minot permiten obtener secciones delgadas, del orden de 4
a 7m de espesor. Producen cortes seriados, es decir, cuando se obtiene un corte, éste
queda adherido por su borde anterior al borde posterior del que lo precedió; formándose
de esta manera una cinta de cortes que va descendiendo por la superficie anterior de la
navaja.

Microtomo de deslizamiento.

El movimiento que se realiza para obtener los cortes es horizontal, es decir de

atrás hacia adelante y viceversa. Generalmente el mecanismo que sujeta al bloque de
parafina es el que se desplaza y a la navaja permanece estática.

Proceso de coloración.

El procedimiento de coloración o tinción consiste en que una estructura celular o

tisular adquiere específicamente un color bajo la acción de una sustancia colorante. Se
considera que una estructura se ha coloreado o teñido cuando al ser lavada con el
líquido que disuelve al colorante, no se decolora.

El proporcionar color a las estructuras que constituyen un tejido o un órgano se

hace con la finalidad de distinguirlas entre sí y facilitar su observación. Si se examina al
microscopio una sección de tejido sin colorear, ya adherida al portaobjetos, se podrá
constatar que no es fácil discernir sus componentes, pues lo delgado de los cortes y la
diafanización producida en los tejidos igualan sus índices de refracción. La coloración
proporciona diferencias evidentes entre las estructuras y al observar los cortes será fácil
reconocerlas.

Teoría de la coloración.
Existen dos teorías que explican el procedimiento de la coloración.

Teoría física.

Considera que la coloración es un proceso físico de adsorción. Así, las partículas

de las sustancias colorantes disueltas penetran en los espacios intra e intercelulares en
los que se mantienen adheridas en razón de la cohesión molecular. Por ejemplo, la
43
coloración de las grasas o lípidos es una tinción por adsorción; los Sudanes III o IV
tiñen las grasas por la facilidad que tienen para disolverse en ellas.

Teoría química.

El colorante se une a la sustancia coloreable combinándose con ella íntimamente

debido a la presencia de agrupaciones moleculares ácidas o básicas en los
componentes celulares o tisulares que se unen respectivamente a los cromógenos
básicos y ácidos de los colorantes, formando sales insolubles. Una prueba de ello es el
hecho de la casi imposibilidad de separar completamente el colorante de los
componentes en donde ejerció su acción de tinción aun empleando sus líquidos
solventes.

Clasificación de las colorantes.

Existen varios criterios para clasificar a los colorantes:

Por su origen.

Pueden ser naturales y artificiales (sintéticos).

Colorantes naturales.
Se extraen de:

1) Animales. Como el carmín, que se extrae de la cochinilla, artrópodo parásito de

los tallos del nopal (tuna). El carmín (de color rojo intenso) es uno de los colorantes
naturales más empleado en la industria alimentaria y cosmética. En técnica histológica
se utiliza el carmín de Best para demostrar glucógeno, el carmín de Mayer para
demostrar mucina; las células fagocíticas se evidencian con el carmín de litio (colorante
vital).

2) Vegetales. Como la hematoxilina, obtenida de la corteza de un árbol, el “palo de

campeche” (Haematoxilum campechanum), la safranina que se extrae de una liliacea
(pistilos de la flor de azafrán) o la orceína que se obtiene de un liquen.

44
Colorantes artificiales o sintéticos.
Son productos derivados de la destilación de la hulla o carbón. Genéricamente
se les conoce como colorantes derivados de la anilina. Los colorantes artificiales son
sales. Son compuestos orgánicos formados por las modificaciones que experimenta el
anillo bencénico cuando se reemplazan dos átomos de hidrógeno por un átomo de
oxígeno o con otro átomo o por un grupo químico que tenga enlaces de doble valencia
en vez de uno, dando como resultado un compuesto coloreado.

Clasificación de las coloraciones.

Existen procesos a través de los cuales células y tejidos son coloreados por las
sustancias colorantes. De acuerdo a ellos, las coloraciones se clasifican en:

Coloración directa o sustantiva.

Se denomina así a la tinción que se ejerce sobre células y tejidos cuando éstos
se ponen en contacto con la solución colorante, el resultado indica una verdadera
afinidad entre el tejido y el colorante. Ejemplo: la tinción de los núcleos por el azul de
metileno.

Coloración indirecta o adjetiva.

Para que lleve a efecto la coloración es indispensable recurrir al empleo de

sustancias intermediarias que faciliten la adhesión del colorante en las estructuras
tisulares. La sustancia intermediaria que se utiliza se denomina “mordiente”. El
mordiente se aplica antes de la utilización de la solución colorante o puede formar parte
de ella.

Coloración progresiva.

Se refiere a la marcha misma de la coloración. Los tejidos se ponen en contacto

con la solución colorante para que, conforme transcurre el tiempo de coloración, el
tejido, de manera progresiva, alcance la intensidad de tinción deseada; en ese
momento se detiene la coloración mediante lavado y la eliminación del colorante
sobrante.

45
 Coloración regresiva.

En este caso los tejidos se sobrecolorean con el colorante para someterlos

después a la acción de una sustancia denominada diferenciador, éste extrae parte del
colorante y, mediante la observación al microscopio, se detiene el proceso de
diferenciación cuando los componentes alcanzan la tinción deseada.

Coloración simple.

Es el procedimiento en el que se utiliza un solo colorante para teñir algún

componente celular o tisular. Por ejemplo, teñir los núcleos con tionina.

Coloración compuesta o combinada.

Consiste en la aplicación, a una muestra de tejido u órgano, de varios colorantes

con la finalidad de destacar, mediante colores diferentes, estructuras específicas que
forman parte de ella. Puede ser:

Simultánea.

Cuando en una misma solución de coloración se mezclan varios colorantes. En

este caso los tejidos reciben la tinción en un solo evento, Ejemplos: las soluciones
colorantes de algunos tricrómicos como el de Van Gieson (fucsina ácida y ácido pícrico)
o el de Mallory (azul de anilina y naranja G) o el de Shorr (verde brillante, fucsina ácida
y naranja G).

Sucesiva.

Consiste en aplicar a los tejidos soluciones sucesivas de varios colorantes, con

la finalidad que ciertos componentes se tiñan con algunos de ellos. El ejemplo más
demostrativo es la coloración de hematoxilina. Eosina, en ella los núcleos se tiñen con
la hematoxilina y después la eosina se encarga de colorear al citoplasma.

Coloración ortocromática.

46
 Es la acción de tinción que ejerce un colorante al colorear una determinada
estructura con su propio color. La gran mayoría de los colorantes producen coloración
ortocromática.

Coloración metacromática.

Es la tinción en la cual, un colorante además de ceder su propio color a una

estructura celular o tisular también tiñe de color distinto a otras estructuras. La tionina y
el azul de toluidina colorean de azul a los núcleos y a otras estructuras basófilas pero,
al mismo tiempo, ciertos componentes tisulares como la mucina, la matriz cartilaginosa
o el ácido hialurónico se tiñen de violeta o rosado.

Coloración pancromática.

Es producida por la actividad tintorial de los colorantes neutros. En este caso,

las porciones básicas y ácidas ejercen su acción de tinción pero, además ciertos
componentes celulares se tiñen de colores diferentes a los originales adquiriendo
tonalidades que resultan de la mezcla de ellos.

Elaboración de láminas histológicas permanentes.

1) Utilizar fragmentos de menos de 1 mm.

2) Fijar con tetróxido de osmio, o aldehído glutárico, con el agregado o no de ácido

tánico.

3) Deshidratar la muestra.

4) Inclusión en resina epoxi, que dan la dureza necesaria para obtener cortes de 200 Aº
a 0,1 um.

5) Cortar con ultramicrótomo de avance muy lento y cuchillas de vidrio o diamante.

6) Recepción de los cortes en agua y luego en una rejilla de cobre recubierta por una
delgada rejilla plástica (Formvar), que será la que sostenga el corte.

47
7) Pasar por ácido ósmico, acetato de uracilo, sales de plomo, etc., que se depositarán
sobre determinados componentes celulares.

8) Observación en pantalla fluorescente.

9) Toma de fotografías y ampliaciones a voluntad. La Técnica es la misma para la

microscopia de barrido

Montaje.

Concluido el proceso de la tinción de los cortes, éstos se deben colocar en

condiciones de protección y de poderlos utilizar infinidad de veces sin que se
deterioren. Para alcanzar tales propósitos se recurre al último procedimiento que es el
montaje. Este procedimiento consiste en colocar encima del corte coloreado y
diafanizado una gota de una sustancia adherente, diluida, generalmente en xilol (resina
natural como el bálsamo de Canadá o resinas sintéticas, cuyos índices de refracción
son similares a los del vidrio) y encima de ellos, una laminilla cubreobjetos, cuidando
que no queden burbujas de aire entre la resina. A continuación se deja que el xilol se
evapore, y la resina adquiera solidez suficiente; para ello las láminas se colocan en una
platina caliente (45o 50o C) durante 24 a 48 horas y estarán listas para ser observadas.
[ CITATION Mon10 \l 8202 ]

48
 Conclusión.

La evolución de la histología va de la mana con la invención y mejoras del

microscopios y de los avances en la medicina, gracias a personas como Marcello
Malpighi considerado como el padre de la histología en los años de 1600, y a muchos
más que se dieron a la tarea de la investigación e innovación y por esa curiosidad
innata del ser humano por entender el porqué de las cosas, se han hechos grandes
avances en la medicina, el uso del microscopio abrió un abanico de posibilidades para
estudiar aquellos microorganismos que no eran visto a simple vista, con los tiempos
estos instrumentos fueron cada día más avanzados los cuales permiten aplicarlos en
muchas ramas de la medicina principalmente en la histología , ya que por medio de
este y con unas series de pasos como son las tomas de muestras, inmediatas o
mediatas , la inclusión, coloración y lavado se pueden realizar estudios sobre los tejidos
ya sean de origen animal o vegetal, permitiendo de este modo aprender y descubrir
mucho más sobre los seres vivos.

Para finalizar podemos afirmar que los temas anteriormente serán de gran
utilidad al momento de realizar las prácticas de histologías por lo que debemos de
conocer teóricamente todo lo desarrollado en el anterior trabajo.

49
 Bibliografía

Atlas de histología vegetal y animal . (24 de Enero de 2020). mmegias.webs.uvigo.es.

Recuperado el 28 de Abril de 2021, de mmegias.webs.uvigo.es:
https://mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/1-proceso.php

comprarmicroscopio.blogspot. (8 de Octubre de 2011). comprarmicroscopio.blogspot.

Recuperado el 27 de Abril de 2021, de comprarmicroscopio.blogspot:
https://comprarmicroscopio.blogspot.com/2011/10/propiedades-del-
microscopio.html

de Goroder, O. (21 de julio de 2013). med.unne.edu.ar. Recuperado el 28 de Abril de

2021, de med.unne.edu.ar:
https://med.unne.edu.ar/sitio/multimedia/imagenes/ckfinder/files/files/histologia_m
ed_cat2/GUIA%201%20%202013.pdf

FyQ. (25 de Abril de 2021). FyQ. Recuperado el 26 de Abril de 2021, de FyQ:

http://recursostic.educacion.es/newton/web/materiales_didacticos/instrumentos_o
pticos/instrumentos.html#:~:text=Entre%20ellos%20se%20pueden
%20mencionar,retroproyector%2C%20el%20telescopio%2C%20etc.

Montalvo, C. E. (15 de Agosto de 2010). facmed.unam.mx. Recuperado el 28 de Abril

de 2021, de facmed.unam.mx:
http://www.facmed.unam.mx/deptos/biocetis/PDF/Portal%20de%20Recursos
%20en%20Linea/Apuntes/3_tecnica_histologica.pdf

Mundo Microscopio. (4 de Febrero de 2021). mundomicroscopio.com. Recuperado el 27

de Abril de 2021, de mundomicroscopio.com:
https://www.mundomicroscopio.com/tipos-de-
microscopios/#2_Microscopio_electronico

Mundo Microscopio. (21 de Marzo de 2021). mundomicroscopio.com. Recuperado el 27

de Abril de 2021, de mundomicroscopio.com:
https://www.mundomicroscopio.com/lente-convergente/

50
Mundo Microscopio. (21 de Marazo de 2021). mundomicroscopio.com. Recuperado el
27 de Abril de 2021, de mundomicroscopio.com:
https://www.mundomicroscopio.com/lente-convergente/

Rodriguez, F. (12 de Abril de 2017). Blog de laboratorio clinico y biometrico .

Recuperado el 29 de Abril de 2021, de Blog de laboratorio clinico y biometrico :
https://www.franrzmn.com/tinciones-hematologicas/

Significados. (27 de Junio de 2017). Significados. Recuperado el 26 de Abril de 2021,

de Significados: https://www.significados.com/histologia/

slideshare. (30 de Marzo de 2016). es.slideshare.net. Recuperado el 28 de Abril de

2021, de es.slideshare.net: https://es.slideshare.net/juanpabloo21/tcnicas-
histolgicas-60247963

ULA. (27 de Abril de 2021). medic.ula.ve. Recuperado el 27 de Abril de 2021, de

.medic.ula.ve:
http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo3_
4.htm

wikipedia enciclopedia libre. (18 de Septiembre de 2011). wikipedia.org. Recuperado el

27 de Abril de 2021, de wikipedia.org:
https://es.wikipedia.org/wiki/Distancia_focal#:~:text=La%20distancia%20focal
%20o%20longitud,foco%20(o%20punto%20focal).&text=Se%20define%20como
%20la%20distancia,enfoca%20en%20un%20%C3%BAnico%20punto.

wikipedia enciclopedia libre. (26 de Abril de 2021). wikipedia. Recuperado el 26 de Abril

de 2021, de wikipedia: https://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio#:~:text=El
%20microscopio%20(del%20griego%20%CE%BC%CE%B9%CE%BA%CF
%81%CF%8C%CF%82,ser%20observados%20a%20simple%20vista.

wikipedia. (s.f.). wikipedia. Recuperado el 24 de Abril de 2021, de wikipedia:

https://es.wikipedia.org/wiki/Histolog%C3%ADa

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Anexos.

52
 Muestra en un microscopio óptico

Muestra observada en un microscopio de fluorescencia (Fuente: Zeiss Microscopy)

53
Muestra observada en un microscopio de campo oscuro

Muestra observada en un microscopio electrónico

54
Leucocito (Glóbulo blanco) observado con un microscopio electrónico de transmisión

Grano de polen observado con un microscopio electrónico de barrido

55
Microscopio monocular

Microscopio de rayos X.

56
 Microscopio binocular.

Microscopio digital.

57
Microscopio de interferencia.

58