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CURO: 2018/2019
UNIVERSITET I TROMSØ
NEUROPATÍA DE LA MÉDULA ÓSEA EN LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA | ADRIÁN FLORIT RUIZ
Contenido
Agradecimientos ............................................................................................................................................. 2
Abreviaturas .................................................................................................................................................... 3
Resumen.......................................................................................................................................................... 4
Abstract ........................................................................................................................................................... 5
Datos del centro .............................................................................................................................................. 6
Introducción .................................................................................................................................................... 7
Hematopoyesis............................................................................................................................................ 7
El nicho ...................................................................................................................................................... 11
La desregulación del nicho y las neoplasias mieloides ............................................................................. 16
Hipótesis ........................................................................................................................................................ 20
Objetivos ....................................................................................................................................................... 21
Metodología .................................................................................................................................................. 22
Modelo murino ......................................................................................................................................... 22
Cohorte ..................................................................................................................................................... 22
Tratamiento .............................................................................................................................................. 23
Obtención de muestras ............................................................................................................................. 24
Obtención de las secciones ....................................................................................................................... 24
Inmunofluorescencia para proteína fibrilar glial acídica (Gfap)................................................................ 25
Inmunofluorescencia para tirosina hidroxilasa ......................................................................................... 26
Análisis en el microscopio confocal .......................................................................................................... 27
Cuantificación de las fibras ....................................................................................................................... 27
Análisis estadístico .................................................................................................................................... 27
Resultados ..................................................................................................................................................... 28
Análisis de Gfap ......................................................................................................................................... 28
Análisis de Th............................................................................................................................................. 32
Discusión ....................................................................................................................................................... 36
Conclusión ..................................................................................................................................................... 40
Bibliografía .................................................................................................................................................... 41
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NEUROPATÍA DE LA MÉDULA ÓSEA EN LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA | ADRIÁN FLORIT RUIZ
Agradecimientos
Quisiera expresarle mi gratitud a la Dra. Aurora Bernal su esfuerzo por compartir conmigo todo
su conocimiento sobre inmunofluorescencia y su inestimable ayuda prestada durante toda mi
estancia. De su mano he aprendido diferentes técnicas, pero sobre todo me ha enseñado a cómo
organizar el trabajo, a ser más meticuloso y eficiente en el laboratorio.
También quiero darle las gracias a mi tutora Kathihuska Paredes, por haberme guiado en este
trabajo, por el esfuerzo dedicado y por sus consejos. Agradezco a la Universitat Rovira i Virgili
la oportunidad que me ha dado de poder vivir esta experiencia.
Finalmente quisiera expresar mi gratitud a mi familia por su contino apoyo, por creer en mí y
ayudarme a cumplir mis sueños.
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Abreviaturas
6OH 6-hidroxidopaminia
BSA Albúmina sérica bovina
C Control
CAR Células reticulares con abundante expresión de CXCL12
CMH Célula madre hematopoyética
CXCL12 Motivo del ligando C-X-C de la quimiocina 12
CXCL4 Motivo del ligando C-X-C de la quimiocina 4
CXCR4 Motivo del receptor C-X-C de la quimiocina 4
EDTA Etilendiaminotetraacético
FLI1 Protooncogén Fli1
GATA1 Proteína de unión GATA 1
GATA2 Proteína de unión GATA 2
Gfap Proteína acídica fibrilar glial
GFP Proteína fluorescente verde
IL-1β Interleucina 1 beta
JAK2 Quinas janus 2
KO Knock out
Lepr+ Células que expresan el receptor de leptina
LMA Leucemia mieloide aguda
NCMM Centro de medicina molecular de Noruega
Nes+ Células positivas para el marcador de células madre neuroepitelial
NMP Neoplasmas mieloproliferativos
PCMH Progenie de las células madre hematopoyéticas
PDGFRβ Receptor del factor de crecimiento derivado de plaqueta β
PDGFR𝛼 Receptor del factor de crecimiento derivado de plaqueta 𝛼
PU.1 Protooncogén Spi-1
SAC Stem Cell Aging and Cancer
SCF Factor de célula madre
SMD Síndrome mielodisplásico
TAL2 Factor de transcripción TAL bHLH 2
TGF-β Factor de crecimiento transformador beta
Th Tirosina hidroxilasa
TL Transgénico leucémico
UiT Universidad de Tromsø
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NEUROPATÍA DE LA MÉDULA ÓSEA EN LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA | ADRIÁN FLORIT RUIZ
Resumen
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NEUROPATÍA DE LA MÉDULA ÓSEA EN LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA | ADRIÁN FLORIT RUIZ
Abstract
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NEUROPATÍA DE LA MÉDULA ÓSEA EN LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA | ADRIÁN FLORIT RUIZ
El presente trabajo de fin de grado se basa en los resultados obtenidos durante la estancia en el
grupo de investigación “Stem cell, aging and cancer” (SAC), dirigido por la Dra. Lorena
Arranz, que pertenece al Departamento de Biología Médica de la Facultad de Ciencias de la
Salud de la Universidad de Tromsø. El edificio se localiza en la calle Hansine Hansens, número
74, 9019, Tromsø, Noruega.
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Introducción
La leucemia mieloide aguda (LMA) es un tipo de cáncer que se caracteriza por la invasión de
la médula ósea, sangre y otros tejidos por células del sistema hematopoyético diferenciadas de
manera defectuosa. Estas células cancerígenas se caracterizan por una proliferación
descontrolada y una diferenciación truncada (1). La LMA es el tipo de leucemia más común en
adultos y con una tasa de supervivencia de sólo 18% a 5 años en España (2), siendo la más baja
entre los distintos tipos de leucemia, convirtiéndola en la más agresiva (3). Se estima que la
incidencia en nuestro país es de 15 nuevos casos por cada millón de habitantes y año. El
intervalo entre la aparición de la enfermedad y los primeros síntomas es habitualmente menor
de 3 meses debido a su carácter agudo. Los síntomas son consecuencia del déficit de glóbulos
rojos, déficit de plaquetas o de granulocitos provocando cansancio, hematomas, hemorragias
además de fiebre o infecciones. Finalmente el funcionamiento defectuoso del sistema
hematopoyético puede causar la muerte del paciente si no se trata (4).
Hematopoyesis
Las células madres hematopoyéticas (CMH) residen mayoritariamente en la médula ósea
durante la edad adulta, que se encuentra en el interior de huesos largos y huesos planos. La
médula ósea es un tejido complejo que contiene una gran cantidad de células hematopoyéticas
y no hematopoyéticas rodeadas por una estructura vascularizada e inervada de hueso (Fig. 1A).
Las CMH se caracterizan por sus capacidades multipotenciales y de autorrenovación (5). La
hematopoyesis es el proceso continuo de formación de las células sanguíneas mediante la
proliferación, autorrenovación, y diferenciación de las CMH, en un proceso altamente regulado
por el microambiente de la médula ósea (6). El microambiente de las CMH es el entorno
biológico formado por las células que conforman la médula ósea, las moléculas que secretan y
otros factores como la concentración de oxígeno, la temperatura o las fuerzas contráctiles,
siendo todos ellos factores que regulan el mantenimiento y las funciones de las CMH en la
médula ósea.
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NEUROPATÍA DE LA MÉDULA ÓSEA EN LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA | ADRIÁN FLORIT RUIZ
Sobre el año 2000, se popularizó un modelo hematopoyético que categorizaba las distintas
células hematopoyéticas por su inmunofenotipo (Fig. 1B). Los diferentes marcadores de
superficie permitían formar grupos bien definidos de células precursoras con diferente
capacidad de autorrenovación. El primer grado de diferenciación formaba dos grupos bien
delimitados. Por un lado, los progenitores comunes linfoides, que generaban exclusivamente
linfocitos o células dendríticas. Y, por otro lado, los progenitores comunes mieloides que se
diferenciaban en el resto de las células sanguíneas y células dendríticas. Sin embargo, las
investigaciones actuales describen a las CMH como un conjunto de poblaciones heterogéneas
organizadas jerárquicamente, con una progresión gradual de una a otra. Además, cuentan con
una capacidad de diferenciación muy flexible para satisfacer las necesidades cambiantes de la
demanda celular de la sangre (5).
A) B)
Figura 1: A) Estructura interna del fémur vascularizado. (extraída de Morrison et al., 2014) (7) B) Modelo
hematopoyético jerárquico. Los marcadores de superficie describen la potencialidad de las células
hematopoyéticas. (extraída de Seita et al., 2010). (8)
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NEUROPATÍA DE LA MÉDULA ÓSEA EN LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA | ADRIÁN FLORIT RUIZ
Técnicas como el RNA-seq de célula única, han permitido dar un paso más hacia la completa
comprensión de la hematopoyesis. El estudio de su transcriptoma, junto con un análisis
computacional han permitido hacer un mapa más realista de cómo evolucionan las CMH hasta
células maduras. Además de RNA-seq, también se realizan estudios de seguimiento celular
mediante marcaje individual, ya sea por inserción de código de barras o inserciones virales. Las
células marcadas son trasplantadas en una médula ósea en homeostasis y se mide su
contribución cada cierto tiempo. Estos nuevos avances han permitido entender mejor cómo
funciona la hematopoyesis, reflejándolo en un nuevo modelo más flexible (Fig. 2), que no limita
la potencialidad de las células al inmunofenotipo que presenta (5). Se ha visto que las CMH
pueden estar polarizadas hacia determinado linaje, pero pueden cambiar su destino dependiendo
de las necesidades del organismo.
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NEUROPATÍA DE LA MÉDULA ÓSEA EN LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA | ADRIÁN FLORIT RUIZ
Figura 2: Representación del modelo hematopoyético actual. Las líneas continuas describen la trayectoria de
diferenciación celular. Las líneas horizontales describen el conjunto de marcadores de superficie que presentan
las células. Las células localizadas en una misma línea horizontal pueden moverse por esta línea variando sus
marcadores de superficie y su destino final según las necesidades puntuales de la sangre. Los círculos coloreados
representan la potencialidad de las células. Un color denota unipotencialidad, dos o tres indican la capacidad de
diferenciarse en dos o tres linajes distintos, respectivamente. El color negro representa multipotencialidad. La
representación gráfica no representa las proporciones reales in vivo (Imagen extraída de Laurentis et al., 2018)
(5)
.
El destino celular de las CMH y su progenie está regulada por distintos factores de transcripción
y factores epigenéticos que actúan en respuesta a señales extracelulares. Los modelos
instructivos postulan que un bajo nivel de expresión de receptores de citoquinas es suficiente
para desencadenar una expresión diferencial de factores de transcripción o realizar
modificaciones epigenéticas. Factores de transcripción como GATA1 o PU.1 se relacionan con
la diferenciación a eritrocitos o al linaje mieloide, respectivamente, mientras que factores como
GATA2, TAL1 o FLI 1 están relacionados con mantener la multipotencialidad de las células
madre. También se ha descrito que algunos cambios son totalmente independientes a los
programas transcripcionales. Se ha observado que la inducción de programas específicos de
transcripción para la selección de linaje, suelen activarse independientemente de la perdida de
funciones características de una CMH, pero existen reguladores implicados en ambos procesos
simultáneamente. Estas observaciones sugieren que aún queda mucho por aprender sobre la
decisión del destino celular y su coordinación en los cambios que efectuará la célula. (5)
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NEUROPATÍA DE LA MÉDULA ÓSEA EN LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA | ADRIÁN FLORIT RUIZ
El nicho
El gran responsable de la correcta regulación de la hematopoyesis es el microambiente en el
que se encuentran las CMH, conocido como nicho. El nicho está formado por distintos tipos
celulares, hematopoyéticos y no hematopoyéticos, que se encuentran en la proximidad de las
CMH en la médula ósea. El nicho produce una multitud de señales reguladoras mediante la
secreción de moléculas e interacciones físicas como fuerzas contráctiles, variación de
temperatura u otros. Los avances tecnológicos nos permiten crear modelos de nicho en los
cuales se incluyen todos las células candidatas a contribuir a la regulación de las CMH (Fig. 3)
(6).
Figura 3. Representación del nicho de las CMH. La imagen resume los grupos celulares que se creen que tiene
alguna influencia sobre las CMH y las interacciones entre las células del nicho (Imagen extraída de Mendelson et
al., 2014 (6).
Las primeras células del nicho que se estudiaron fueron las células óseas. Los osteocitos y los
osteoblastos son las células encargadas de la creación del hueso. Actualmente se ha descrito
que los osteoblastos tienen un papel destacado en la diferenciación de ciertos progenitores
linfoides debido a la secreción de la citoquina 12 (CXCL12) y otros factores (7,9). Además se
cree que también pueden influir en otras diferenciaciones de forma indirecta, mediante la
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NEUROPATÍA DE LA MÉDULA ÓSEA EN LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA | ADRIÁN FLORIT RUIZ
secreción de osteopontina entre otras moléculas (7). Los osteocitos son la población mayoritaria
de los huesos (95%). Principalmente se encargan del mantenimiento del hueso y tienen una vida
larga. Además de su papel estructural en el mantenimiento de la médula ósea, los osteocitos
pueden influir en el nicho secretando factores que afectan directamente a las CMH, o
indirectamente actuando sobre las células endoteliales, mesenquimales o adipocitos.
Otra población de la médula ósea que se ha estudiado son los adipocitos, que actúan como
reguladores negativos de la hematopoyesis, aumentando a medida que el individuo envejece.
La médula ósea rica en adipocitos presenta un menor número de células progenitoras. Los
adipocitos secretan adiponectina, leptina y factor de células madre (SCF) entre otros factores
que pueden regular la hematopoyesis. Por ejemplo, un déficit de leptina podría provocar una
hematopoyesis defectuosa, causando mayor porcentaje de células mieloides (10). Los factores
secretados podrían ser los responsables de inhibir la hematopoyesis (11). En los últimos años
se ha observado que el rol de los adipocitos depende de la situación en la que se encuentra el
nicho. Se ha observado que, tras el tratamiento con quimioterapia, bajos niveles de adiponectina
en la médula ósea podrían afectar a la regeneración de las CMH. Un déficit de adiponectina
podría provocar una regeneración hematopoyética deficiente (10). En el ensayo de Zhou et al.,
2017 se estudió el papel de los adipocitos tras realizar un trasplante de médula ósea. En el
estudio se observó que en un nicho recién trasplantado, los adipocitos eran capaces de secretar
SCF que favorecía la regeneración de la médula ósea. El SCF influye directamente sobre las
CMH promoviendo su mantenimiento lo que evidencia la importancia de los adipocitos en el
nicho post-trasplante (12).
Por otra parte, las células endoteliales tienen funciones más allá de la vascularización de la
médula ósea (13). Se ha observado que un 90% de las CMH se encuentran alrededor de los
vasos sanguíneos (12). Las células endoteliales son de vital importancia por su propia función
y por el soporte físico que ofrecen a otras poblaciones celulares. Estudios in vitro han
demostrado que estas células pueden promover la proliferación de CMH de largo plazo y
favorecer su supervivencia mediante la secreción de SCF (13). En ensayos in vivo realizados
con células endoteliales Knock out (KO) para CXCL12 se observó hipocelularidad de la médula
ósea, certificando la importancia de las células endoteliales en la hematopoyesis (13).
Uno de los grupos celulares más importantes del nicho se encuentra junto a las células
endoteliales son las células estromales mesenquimales (CEM). Estas células forman un grupo
heterogéneo y poco diferenciado que tiene la capacidad de diferenciarse en células del linaje
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NEUROPATÍA DE LA MÉDULA ÓSEA EN LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA | ADRIÁN FLORIT RUIZ
óseo, condrocitos y adipocitos. Las CEM son capaces de secretar distintas moléculas que
influyen directamente sobre las CMH. Según distintos marcadores que expresan las CEM
pueden organizarse en tres grupos, que solapan parcialmente entre sí sus identidades. Cada
agrupación tiene unas características que le dan una función específica en el nicho (14). Por una
parte, están las CEM positivas para el receptor de leptina (Lepr+). Las CEM Lepr+ además de
secretar CXCL-12, presentan en su membrana los receptores del factor de crecimiento
derivados de plaqueta 𝛼 y β (PDGFR 𝛼, PDGFR β) y el receptor de la leptina. Las células
estromales Lepr+ secretan SCF a un nivel significativamente superior a otras células del nicho
que también secretan SCF. La combinación de factores formada por CXCL12 y el SCF
promueve la supervivencia de CMH (13, 15). El experimento de Ding et al., 2012 demostró la
importancia de las células estromales Lepr+. Mediante un ensayo in vivo con un modelo murino
al que se le había eliminado las células Lepr+, donde se observó una disminución notable de
las CMH, demostrando la importancia de las CEM Lepr+ (13).
Otro grupo de CEM que se ha descrito son las células reticulares con abundante expresión
CXCL-12 (células CAR). Las células CAR se encuentran mayoritariamente asociadas a los
sinusoides de la médula ósea, muy cerca de las CMH. Estas células son un grupo heterogéneo
de células estromales que se caracterizan por ser las mayores productoras de CXCL12, que se
une al receptor CXCR4 en CMH. Las células CAR juegan un rol importante en la homeostasis
del nicho debido a la secreción de CXCL12 que induce la supervivencia de las CMH al
promover el estado quiescente (16). Además de las células CAR, las células Nes+ son las
grandes responsables de mantener a las CMH en estado quiescente. Las células Nes+ son CEM
que expresan el marcador de células madre neuroepitelial Nestina, un filamento intermedio de
clase VI que se expresa en distintos tipos celulares como islas pancreáticas, musculo esquelético
y células no hematopoyéticas de la médula ósea, entre otros tejidos (17). Las CEM Nes+ se
encuentran en la periferia de las arteriolas y de los sinusoides. Según estudios de microscopia
confocal de fluorescencia con modelos transgénicos Nes-GFP (proteína fluorescente verde)
existen dos poblaciones distintas. Una población que expresa mayor cantidad de Nestina,
llamadas Neshigh generalmente localizadas alrededor de las arteriolas. El otro grupo apodado
Neslow expresa poca cantidad de Nestina y se encuentra en la periferia de los sinusoides. Las
CEM Nes+ son capaces de secretar CXCL12, SCF y angiopoyetina, permitiéndoles regular la
supervivencia y retención en la médula ósea de las CMH. La secreción de factores tiene un
papel muy importante en la hematopoyesis al mantener quiescentes las CMH. Para regular la
secreción de las células Nes+ se han observado dos vías. Por una parte, la secreción está
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regulada por la presencia del factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) y por otra
parte está regulado por las señales β- adrenérgicas (18).
La estrecha relación entre los nervios simpáticos y las CEM permite una regulación completa
de la movilización y proliferación de CMH. Estudios de Méndez-Ferrer et al., 2012
demostraron que, en homeostasis, la secreción de noradrenalina es un fenómeno regulado por
los ritmos circadianos. En consecuencia, la secreción de CXCL12 y la migración de las CMH
de la médula ósea también están reguladas por los ritmos circadianos (Fig. 4) (20). El
experimento de Méndez-Ferrer et al., 2012 se realizó debido a la observación de como variaba
la expresión de CXCL12 en ratones en distintas condiciones de luz; con un horario de luz
normal, simulando desfase horario o en condiciones de luz u oscuridad constante. Mediante la
simpatectomía de la médula ósea confirmaron que la expresión de CXCL12 era regulada por
las señales adrenérgicas secretadas por los nervios simpáticos. Finalmente comprobaron que
los conocidos como genes reloj, como son Clock, Bmal1, Per1, entre otros, tenían influencia en
la expresión de CXCL12, aunque no directamente (20).
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NEUROPATÍA DE LA MÉDULA ÓSEA EN LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA | ADRIÁN FLORIT RUIZ
Otro componente del sistema nervioso que forma el nicho de la médula ósea son las células de
Schwann no mielinizantes cuya función principal es sustentar a los nervios simpáticos. Estas
células son capaces de activar la forma latente del factor de crecimiento transformador β (TGF-
β), una citoquina capaz de regular negativamente la proliferación de CMH. El TGF-β externo
estimula a las CMH a secretar más TGF-β que mantiene a las CMH en estado quiescente (21).
Las células de Schwann no mielinizantes expresan la proteína acídica fibrilar glial (Gfap), un
filamento intermedio específico para astrocitos y para las células de Schwann no mielinizantes.
Gfap es el responsable de mantener firme la estructura del citoesqueleto de las células de
Schwann no mielinizantes (22). Yamazaki et al., 2011 demostraron que las células de Schwann
no mielinizantes de la médula ósea son capaces de activar a TGF-β (21).
Otra población celular que secreta TGF-β, son los megacariocitos de la médula ósea. Se han
observado megacariocitos en las proximidades de las CMH. Los megacariocitos pueden regular
el estado quiescente de las CMH secretando TGF-β y la quimiocina 4 (CXCL4) (15). Los
megacariocitos no son las únicas células hematopoyéticas maduras que pueden regular el nicho
de la médula ósea. Los monocitos-macrófagos también son grupos muy influyentes en el nicho,
han evidenciado la capacidad de regular la movilización de la progenie de las células madre
hematopoyéticas (PCMH), aunque su influencia sea indirecta mediante células osteoblásticas.
Se observó que la expresión de G-CSF por los monocitos-macrófagos era suficiente para
provocar la supresión de los osteoblastos, la regulación negativa de la expresión de CXCL 12
y la movilización de la PCMH (15).
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Aunque los factores solubles secretados por el componente celular de la médula ósea sean los
grandes responsables de la regulación de la hematopoyesis, no son los únicos que influyen en
el correcto funcionamiento del nicho. Los contactos entre células también son muy relevantes.
La ruta Notch tiene una gran importancia en el proceso de desarrollo y definición del destino
celular de las CMH. En la hematopoyesis temprana se observan receptores Notch 1 y Notch 2
que favorecen la diferenciación de estas células en progenitores de megacariocitos o eritrocitos,
respectivamente. También se ha observado la relevancia de la ruta Notch en CMH de largo y
de corto plazo, potenciando su supervivencia (6). Un ejemplo es el estudio del equipo de David
Scadden quienes describieron que, mediante la estimulación de los osteoblastos, estos podían
aumentar la producción del ligando jagged 1 de la vía Notch. El alto nivel del ligando jagged 1
de la vía Notch provoca la activación de la ruta Notch 1 en CMH potenciando su proliferación
(24). Aunque la ruta Notch se ha observado en múltiples localizaciones del nicho, no se ha
podido demostrar el grado de importancia que tiene, debido a que al bloquear alguna proteína
de la ruta se podrían activar vías alternativas, por lo que se debe seguir estudiando para poder
demostrar su verdadera importancia (6).
La ruta Wnt se encuentra en la misma situación, tiene una gran relevancia en el desarrollo de
muchos tejidos, entre ellos la médula ósea. La β-catenina es un componente de la ruta Wnt que
juega un rol muy importante en la conservación del estado inmaduro de las CMH, manteniendo
la multipotencialidad (6). Mediante la β-catenina las CMH de largo plazo interaccionan con los
osteoblastos, que presentan en su membrana N-cadherina. La interacción entre N-cadherina y
β-catenina ancla las CMH de largo plazo a la superficie del hueso. La interacción física entre
osteoblasto y CMH de largo plazo permite que el osteoblasto favorezca la permanencia de la
CMH de largo plazo en la médula ósea (25). Existe una variante de la ruta Wnt conocida como
la variante no canónica que inhibe la proliferación e incrementa la repoblación de CMH (6).
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Los neoplasmas mieloproliferativos (NMP) son un tipo de cáncer ocasionado por una mutación
en las CMH que desencadena una mayor proliferación o supervivencia de las CMH, pero su
diferenciación no se ve afectada. Los NMP son una enfermedad bien estudiada de la que se
tiene un gran conocimiento de su patología molecular. Los NMP se originan en la mayoría de
casos debido a alteraciones somáticas, causadas por ejemplo a una fusión entre los genes del
BCR, activador de RhoGE de la GTPasa y el promotor oncogén ABL (BCR-ABL). También
puede originarse un NMP debido a una mutación puntual de novo de la quinasa janus 2 (JAK2).
La mutación de JAK2 provoca una proliferación aumentada de las CMH. Según los ensayos
realizados por Arranz et al., 2014 en NMP se produce una secreción de interleucina-1β (IL-1β)
desde sus etapas más tempranas por parte de las células hematopoyéticas mutadas. La IL-1β
daña los nervios simpáticos y las células de glía no mielinizantes que se encuentran en la médula
ósea. El deterioro de los nervios junto con el aumento de IL-1β provocan la desregulación de
las CEM, comprometiendo su supervivencia y disminuyendo la presencia de CXCL12 en el
nicho. La disminución de CXCL12 del nicho provoca que las CMH abandonen el estado
quiescente activando su ciclo celular. (27) (Fig. 5)
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NEUROPATÍA DE LA MÉDULA ÓSEA EN LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA | ADRIÁN FLORIT RUIZ
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NEUROPATÍA DE LA MÉDULA ÓSEA EN LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA | ADRIÁN FLORIT RUIZ
No obstante, antes de iniciar estos ensayos, debemos conocer cuáles son las consecuencias de
la neuropatía producida por las células mutantes en LMA, lo que se ha llevado a cabo mediante
un experimento de simpatectomía. Es vital demostrar que la simpatectomía realizada es correcta
para poder obtener conclusiones fiables acerca de su impacto sobre la progresión de la
enfermedad, para posteriormente realizar el ensayo con 4-metilcatecol con garantías.
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NEUROPATÍA DE LA MÉDULA ÓSEA EN LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA | ADRIÁN FLORIT RUIZ
Hipótesis
En los últimos años se ha descrito la patología molecular de las NMP desde etapas muy
tempranas. Se ha comprobado que la las CMH mutadas provocan inflamación que daña los
nervios simpáticos de la médula ósea. El deterioro de los nervios simpáticos junto con la
inflamación provocan la desregulación del nicho de las células madre (27). En estado de
homeostasis, los nervios mediante la secreción de noradrenalina regulan la liberación de
CXCL12 de las células estromales, que mantiene las CMH en estado quiescente. Al disminuir
CXCL12, las CMH entran en estado proliferativo derivando en enfermedad hematológica (28).
Dado que algunos oncogenes humanos que se asocian con NMP y LMA dan lugar a fenotipos
similares de NMP en modelos murinos, la hipótesis principal del proyecto es que el mecanismo
de neuropatía se produce también en LMA y puede usarse como diana terapéutica.
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NEUROPATÍA DE LA MÉDULA ÓSEA EN LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA | ADRIÁN FLORIT RUIZ
Objetivos
El objetivo final de este trabajo es comprobar que la simpatectomía química ha sido realizada
con éxito en el ensayo diseñado. Una vez confirmada la simpatectomía se podrá realizar el
experimento con 4-metilcatecol. Confirmar la simpatectomía es de vital importancia para
conocer el impacto de la neuropatía sobre el desarrollo de la enfermedad y poder realizar un
ensayo con garantías con 4-metilcatecol. Para ello debemos:
1. Comprobar que los ratones leucémicos presentan menos nervios simpáticos que los
controles. Este dato ha sido obtenido en varios experimentos anteriores por el grupo
receptor (SAC).
2. Demostrar que la simpatectomía química ocurre en los grupos control y enfermo.
3. Verificar que la administración de la 6OH afecta a las células de Schwann no
mielinizantes de la médula ósea.
4. Confirmar que la administración de la 6OH afecta a los nervios simpáticos de la médula
ósea.
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Metodología
Modelo murino
Para realizar este experimento utilizamos ratones (Mus musculus) <tm1Tyj>/J Tg(Mx1-
G12D
cre)1Cgn/, también conocidos como Mx1-cre/NRAS (30). El modelo de ratón fue cedido
por Paloma García, de la Universidad de Birmingham. Este modelo permite inducir LMA a
estos ratones con gran facilidad técnica, mediante el promotor que controla la expresión de CRE
(Fig.6), el cual normalmente regular la expresión de Mx dynamin-like GTPase 1. El gen Mx1
forma parte del sistema inmune de los murinos ante infecciones víricas. El promotor del gen
Mx1 se activa debido a la alta concentración de interferón α o interferón β. Para regular la
activación del promotor se usa ácido polinosilico-policitidilico (pIpC). El pIpC es un RNA de
doble cadena sintético que funciona como inductor de interferones (31). Debido a la expresión
interferones el promotor Mx1 expresa la Cre recombinasa. Cre induce la deleción de la
secuencia de stop situada en la región upstrem del gen mutado NRASG12D. Las secuencias loxP
se encuentran delimitando la secuencia stop. Cuando la Cre recombinasa se expresa reconoce
las secuencias loxP delecionando la secuencia stop. Los ratones Cre+ inducidos expresan la
mutación NRASG12D.
A) B)
Figura 6: Esquema del funcionamiento de casete de expresión de los ratones utilizados. A) Representa la
construcción genética de los ratones control (C). B) Representa la construcción genética de los ratones
transgénicos leucémicos (TL).
Cohorte
Para este ensayo usamos 27 ratones hembra de 10 meses de edad media que fueron estabulados
con acceso a agua y comida ad libitum. Todos los procedimientos fueron supervisados y
aprobados por el Gobierno de Noruega dentro del sistema de solicitud de proyectos para la
supervisión y conservación de animales de experimentación (FOTS) Organizamos los ratones
por sus genotipos y según su tratamiento con 6OH o con vehículo (agua libre de oxigeno),
formando 4 grupos; Control (C) tratado con vehículo (n=8), Control inyectados con 6OH (n=6),
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transgénico leucémico (TL) inyectados con vehículo (n=6) y ratones transgénicos leucémicos
inyectados con 6OH (n=6). (Tabla 1).
Tras 20 semanas se inició la administración de 6OH (Sigma, Ref. h4381) o agua libre de
oxígeno, como vehículo. Para obtener el agua libre de oxígeno se mantuvo el agua MiliQ bajo
un flujo continuo de N2 gaseoso durante 15 min, tal y como describen Ian B. Butler et al., 1994
(32). Posteriormente, se añadió el antioxidante, metabisulfito de sodio (Sigma, Ref. S9000-
500G) hasta conseguir una concentración de 0,1% de metabisulfito de sodio. Finalmente, el
agua libre de oxígeno se dividió, una parte como vehículo y la otra parte para disolver la droga.
Los ratones fueron inyectados vía intraperitoneal con 100 μl de 6OH a una concentración de 10
mg/Kg o 100 μl de vehículo. Las dosis fueron repetidas cada lunes, miércoles y viernes,
alternando una semana de tratamiento y una semana de descanso. Cada dos semanas se
realizaron extracciones de 70µL de sangre a través de la vena safena para controlar como
evolucionaba la salud de los ratones. Esta estrategia se mantuvo hasta la semana 24. El segundo
análisis de sangre mostró que la droga no estaba afectando a los ratones como se esperaba.
Entonces se decidió aumentar el número de dosis para potenciar los efectos de la droga. A partir
de la semana 24 los animales fueron inyectados todas las semanas, lunes, miércoles y viernes.
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Figura 7: Cronograma del experimento. Tratamiento del grupo C con vehículo, aunque todos los grupos
siguieron la misma cronología con sus respectivos tratamientos. Cada flecha representa una toma de
muestra para controlar la enfermedad. Las muestras se recogieron aproximadamente cada 4 semanas antes
de iniciar el tratamiento con 6OH. Una vez iniciado el tratamiento las muestras se obtuvieron cada 2
semanas.
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ósea y tenían una calidad alta. Se almacenaron a -20ºC aquellas muestras que no tenían burbujas
ni roturas y pertenecían a la zona central del hueso. Al menos se obtuvieron 6 secciones de alta
calidad de cada animal para poder realizar triplicados de las dos tinciones que se realizaron.
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Tabla 2 Anticuerpos utilizados durante las Inmunofluorescencia
Tipo de Casa
Anticuerpo Diana Dilución Referencia
anticuerpo comercial
Ac
Anti-Gfap Proteína acida
policlonal de 1:200 Dako Z0334
(primario) fibrilar de la glía
conejo
Ac
Anti-Th Tirosina Merck
policlonal de 1:50 AB152
(primario) hidroxilasa Millipore
conejo
Ac
Jackson
policlonal
Immuno
Cy-3 Inmunoglobulina conjugado 711-165-
1:200 Research,
(secundario) tipo G de conejo con el 152
Laboratories,
fluorocromo
INC.
Cy-3
En primer lugar, se preparó una cámara húmeda para disponer los portaobjetos durante las
incubaciones. Las muestras fueron lavadas con tampón fosfato salino 1X (PBS) (Sigma, Ref.
P4417-50ta) 4 veces, a continuación, con un algodón se retiró el OCT sobrante. Se volvió a
lavar otras 8 veces en PBS 1X para eliminar los restos de OCT. A continuación, se añadió el
buffer de PBS 1X / albúmina sérica bovina 2% (BSA) (Sigma, Ref. A7906-100G) / Triton-X-
100 0,05% (Sigma, Ref. T8787-100ML) para bloquear la muestra durante 1 hora. Después se
realizaron 3 lavados con PBS 1X de 5 minutos cada uno y se añadió el anticuerpo primario anti-
Th en la proporción 1:50 (Tabla 2) disuelto en el buffer PBS 1X /BSA 2% /Triton 0,05%,
durante 2,5 horas. Tras la incubación se realizaron 4 lavados de 5 minutos cada uno con buffer
de PBS 1X /BSA 2%/ Triton 0,2% y después se incubó la muestra con el anticuerpo secundario
disuelto en de PBS 1X / BSA 2% / Triton 0,2% en proporciones 1:200 respectivamente, durante
1,5 horas. Posteriormente se realizaron 3 lavados con PBS 1X/BSA 2%/ Triton 0,2% y se
incubaron con 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Sigma, Ref. D9542) 1:1000 durante 10
minutos. Finalmente se lavó 3 veces con PBS 1X y se reservó la muestra en cámara húmeda a
4 ℃.
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Análisis estadístico
El análisis estadístico de las cuantificaciones se realizó mediante el programa informático
GraphPad Prism 6. Comparamos los grupos determinando que los valores serian significativos
cuando el p-valor fuera inferior a 0,05. Estudiamos si existían diferencias estadísticamente
significativas al comparar los grupos; C tratado con vehículo y TL tratado con Vehículo, C
inyectado con vehículo y C inyectado con 6OH, y TL tratado con vehículo y TL tratado con
6OH.
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Resultados
Análisis de Gfap
Uno de los objetivos de nuestro trabajo era confirmar que los ratones TL inyectados con
vehículo presentaban una cantidad de nervios simpáticos significativamente inferior a los
ratones C inyectados con vehículo, dato que ha sido obtenido en varios experimentos previos
del grupo receptor (SAC). La tinción de Gfap nos permite ver cómo la expresión del gen
NRASG12D en las CMH afecta a las células de Schwann no mielinizantes. Tras realizar la
inmunofluorescencia y su posterior visualización en el microscopio confocal procedimos a
realizar una captura digital de las muestras.
Tal y como observamos en la Fig. 8 el marcador Gfap se halla dentro de la médula ósea señalado
en color rojo. También está presente de forma mucho más abundante en el músculo, por ello lo
empleamos como control positivo de la técnica. Al tratarse de un filamento intermedio, y al
haberse realizado las imágenes a un aumento de 20X (Fig. 8 A-D), Gfap se observa formando
una hebra debido a la sucesión de células de Schwann no mielinizantes que sustentan el nervio
simpático. Sin embargo, algunos filamentos pueden adquirir estructuras ramificadas, siendo
más prevalentes las de carácter lineal (Fig. 8E). Tras el análisis de las fotografías apreciamos
características comunes en las fibras de Gfap en los distintos grupos; todas ellas tienden a
polarizarse en uno de los extremos de la médula y suelen aparecer en los alrededores de los
vasos sanguíneos.
Tras un análisis general nos centramos en las fotografías de los ratones C tratados con vehículo,
donde observamos que tenían una gran cantidad de fibras largas y continuas. Además, todas
ellas presentaban una señal homogénea (Fig. 8A). En cambio, observamos que los ratones TL
tratados con vehículo no presentaban tanta concentración de fibras, mostrando un número
inferior a los filamentos de los ratones C tratados con vehículo. Al contrario que en los ratones
C tratados con vehículo, las fibras en los ratones TL tratados con vehículo eran cortas y
presentaban una señal heterogénea.
Además, apreciamos que algunos de los ratones TL presentaban morfologías de médula ósea
anómalas, como, por ejemplo, invasiones de la médula ósea en el hueso (Fig. 8C). También
queremos resaltar que los ratones TL presentaban una morfología de la médula ósea más
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A) B) C) D) D)
DAPI
Gfap
30
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Una vez cumplido el primer objetivo pasamos a comprobar como afectaba la 6OH a los ratones
C. Para ello visualizamos mediante microscopia confocal la cantidad de las fibras en la diáfisis
que presentaban los ratones C tratados con 6OH o con vehículo. Al ver las fotografías,
destacamos las diferentes morfologías entre las fibras en los ratones C tratados con 6OH y
tratados con vehículo. Las fibras de los ratones C tratados con 6OH eran más cortas o parecían
debilitadas debido a la perdida de señal que observamos en la fibra. No percibimos una
disminución de la cantidad de fibras, pero si una disminución de su longitud. Tampoco
observamos cambios en la morfología de la médula ósea (Fig. 8B). Al realizar la cuantificación
y el posterior análisis estadístico comprobamos que existía una diferencia significativa entre el
porcentaje de la longitud de las fibras entre el área total de la diáfisis de los ratones C tratados
con 6OH y C tratados con vehículo (Fig. 9).
También realizamos la comparación entre los ratones TL inyectados con 6OH o con vehículo.
Apreciamos que aquellos tratados con 6OH presentaban menos fibras que los TL tratados con
vehículo. Además, las fibras que observamos en los ratones tratados con 6OH parecían
fragmentadas, debilitadas o tenían una señal heterogénea (Fig. 8D). Al realizar el análisis
estadístico confirmamos que existía una diferencia significativa entre el porcentaje de la
longitud de las fibras y el área total de la diáfisis de los ratones TL tratados con 6OH y los
ratones TL no tratados con 6OH (Fig. 9).
A) B)
Gfap % diáfisis (longitud / area)(m/m2)
Gfap % diáfisis (longitud / area)( m/m2)
0.10
0.05
0.05 ** **
0.00 0.00
h
H
h
Ve
Ve
Ve
Ve
6O
6O
6O
6O
TL
C
TL
TL
C
TL
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Figura 9: Gráficos obtenidos tras el análisis estadístico mediante “t de student” de los datos obtenidos al
cuantificar todas las fotografías de los fémures teñidos para la detección de Gfap. El grafico A representa
la media de los triplicados de cada animal. El grafico B representa la media de cada grupo y el error
estándar. *** P-valor < 0,001. ** P-valor < 0,01.
Análisis de Th
El análisis de Th nos permite comprobar si la administración de la 6OH afecta directamente a
los nervios simpáticos. Una vez realizada la inmunofluorescencia observamos las muestras al
microscopio confocal y capturamos fotografías de todas las diáfisis de las muestras a 20X. Th
es un enzima que se encuentra mayoritariamente en los extremos catecolaminérgicos. En las
fotografías observamos los botones catecolaminérgicos de color rojo intenso unidos por fibras
de señal menos intensa (Fig. 10E). Tras un análisis general observamos que fibras de Th no
presentaban una polarización de las fibras tan acentuada como observamos en las fibras de
Gfap. También detectamos que las fibras de Th aparecen cerca de los vasos sanguíneos.
Lo primero que queríamos comprobar era si la mutación de NRASG12D en CMH deteriora los
nervios simpáticos. La comparación entre las fibras presentes en la diáfisis de los ratones C y
ratones TL, inyectados con vehículo, nos permite comprobar si existe afectación de las
terminaciones nerviosas por la enfermedad. Hemos observado que los extremos
catecolaminérgicos de los ratones C tratados con vehículo forman fibras generalmente largas
que presentaban una señal homogénea. Además, percibimos que los botones
catecolaminérgicos tenían muy poca separación entre ellos facilitando la visualización de la
estructura fibrilar (Fig. 10A). La morfología de los nervios del sistema nervioso periférico son
muy distintas dependiendo del destino final de la señal (33). Las fibras que pudimos encontrar
en nuestras muestras presentaban tres morfologías diferentes; mayoritariamente las
visualizamos como una fibra individual, aunque pudimos visualizar en múltiples ocasiones
como los extremos catecolaminérgicos formaban fibras en forma de hélice. En algunos
animales llegamos a ver una tercera morfología debido a una conglomeración de extremos
catecolaminérgicos (Fig. 10E). Los ratones TL tratados con vehículo presentan una
concentración menor de fibras que eran generalmente cortas. Observamos que las fibras
presentaban señales heterogéneas, aunque podíamos seguir la forma de la fibra sin dificultades
(Fig. 10C). Una vez cuantificadas las fotografías y realizado el análisis estadístico sobre los
datos concluimos que la mutación NRASG12D de las CMH provocaba una disminución
significativa de las fibras de Th (Fig. 11).
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NEUROPATÍA DE LA MÉDULA ÓSEA EN LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA | ADRIÁN FLORIT RUIZ
A) B) C) D)
Th
DAPI
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Seguidamente analizamos como afectó a los ratones C el tratamiento con 6OH. Sus fibras eran
generalmente largas, pero no tanto como los ratones C tratados con vehículo. Algunas fibras de
los ratones C tratados con 6OH presentaban indicios de desestructuración perdiendo la forma
de filamento. También detectamos que las fibras tenían una señal dispar comparadas con los
ratones C inyectados con vehículo. Mayoritariamente, los botones catecolaminérgicos
mantenían la constancia suficiente para seguir las fibras (Fig. 10B). Al realizar la cuantificación
y el análisis estadístico confirmamos que la administración de 6OH provocaba una disminución
significativa de los botones catecolaminérgicos en los ratones C (Fig. 11)
Finalmente estudiamos cómo afectaba la 6OH a los ratones TL. Las fibras que presentaban los
ratones TL tratados con 6OH eran más cortas que las observadas en ratones TL inyectados con
vehículo. Algunas fibras se organizaban formando una conglomeración, pero las fibras en estos
ratones se veían disgregadas y sin el patrón fibrilar característico. Además, las señales que
emitían las fibras eran muy heterogéneas y no apreciamos la señal que conecta los botones
catecolaminérgicos. La visualización de la fibra era posible, aunque las señales estuvieran
distorsionadas y botones catecolaminérgicos aparecieran con menor frecuencia que en los
ratones TL tratados con vehículo (Fig. 10D). Al realizar el análisis estadístico, comprobamos
que no existía una diferencia significativa entre los ratones TL inyectados con vehículo y
ratones TL inyectados con 6OH. Podríamos decir que existe una tendencia a ser diferentes pues
su p-valor es igual a 0,0802 (Fig. 11).
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A) B)
Cuantificación de
de Th
Th % diáfisis (longitud / area)( m/m2)
Cuantificación de Th Cuantifiacación Th
0.04
0.05
0.02 p = 0,0802
p=0,0802
0.00 0.00
h
H
Ve
Ve
Ve
Ve
6O
6O
6O
6O
C
TL
TL
C
TL
TL
Figura 11: Gráficos obtenidos tras el análisis estadístico mediante t de student de los datos obtenidos al
cuantificar todas las fotografías de los fémures teñidos para la detección Th. El grafico A representa la
media los triplicados de cada animal. El grafico B representa la media de cada grupo y el error estándar.
*** P-valor < 0,001
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NEUROPATÍA DE LA MÉDULA ÓSEA EN LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA | ADRIÁN FLORIT RUIZ
Discusión
Los resultados para la tinción de Gfap han sido los esperados para un diseño experimental
correcto. Lo primero que queremos analizar son las diferencias significativas entre los ratones
C y los ratones TL tratados con vehículo. El estado leucémico que provocan las CMH mutadas,
la desregulación de las vías de señalización reguladas por RAS y la hipercelularidad de la
médula (30), podría producir una presión ambiental sobre las células de Schwann no
mielinizantes que desencadenaría su muerte. Datos previos del laboratorio indican que los
ratones leucémicos en este modelo presentan inflamación mediada por la citoquina IL-1β, y
esta a su vez ha sido previamente relacionada con el deterioro de las fibras simpáticas de la
médula ósea en otras enfermedades hematopoyéticas (27). Futuros trabajos deberán indagar en
las causas moleculares de la reducción de las células de Schwann no mielinizantes en la
leucemia inducida por NRASG12D.
Hemos visto que en ratones C las fibras de Gfap disminuían significativamente al ser tratados
con 6OH. Estos resultados nos permitieron confirmar que las células de Schwann no
mielinizantes se ven afectadas por la 6OH en estado de homeostasis. También hemos visto que
en ratones TL, la 6OH también afectaba a las células de Schwann no mielinizantes de forma
significativa. Podemos decir que la capacidad de oxidación de la 6OH afecta a las células de
Schwann, de forma directa o indirecta. Según Hernández-Baltazar et al., 2017 la 6OH tiene
distintos mecanismos de actuación. Uno ellos, se debe a su gran capacidad de oxidación, ya que
esta molécula puede autooxidarse intra o extracelularmente favoreciendo la producción de
peróxido de hidrogeno o radicales superóxido o hidroxilo. La autooxidación extracelular es un
mecanismo inespecífico y por tanto, una limitación del modelo experimental. Otro mecanismo
de actuación se da en la mitocondria al activar la monoaminooxidasa o bloquear el complejo I
de la cadena respiratoria (34). La 6OH es un análogo de la dopamina que puede ser capturado
a través de los transportadores de dopamina. Este es el mecanismo específico que se produce
en las terminales simpáticas. Es posible que la degradación específica de la fibra simpática
producida por la 6OH inicie una cascada de eventos que resulte en la muerte de la célula de
Schwann como consecuencia. Sin embargo, no podemos descartar que la capacidad
autooxidación extracelular de la 6OH afecte a las células de Schwann no mielinizantes.
En cuanto a la tinción para Th tuvimos unos resultados en concordancia con los obtenidos en
Gfap. Al comparar la longitud de las fibras de Th en proporción con el área total de los ratones
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NEUROPATÍA DE LA MÉDULA ÓSEA EN LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA | ADRIÁN FLORIT RUIZ
C y de los ratones TL tratados con vehículo, observamos una disminución significativa del
porcentaje en ratones TL debido a la enfermedad. Esto se corresponde con lo observado en otras
enfermedades hematopoyéticas (27). Al estudiar como afectó la 6OH a los ratones con C,
detectamos una diferencia significativa entre los dos grupos (Fig. 11). La reducción de las fibras
confirma que el tratamiento diseñado afectó a los botones catecolaminérgicos en ratones C.
Finalmente comparamos como afectó la 6OH a los ratones TL tratados con vehículo o con 6OH.
Las diferencias entre estos dos grupos no fueron significativas, pero si demostró una tendencia
a la baja en el grupo de ratones TL tratados con 6OH. Creemos que una menor eficiencia de la
simpatectomía química en TL podría deberse a distintos factores. Uno de los factores que
creemos que más podría haber influenciado son las características individuales de cada fibra.
En ratones TL, el ambiente produce un estrés sobre los extremos catecolaminérgicos que no
ocurre en los ratones C. Por tanto, podemos decir que las fibras presentes en ratones TL tratados
con vehículo posiblemente sean más resistentes al estrés que las fibras de los ratones C. Al
someter a estas fibras seleccionadas a un nuevo estrés algunas sufrieron los daños provocados
por la 6OH, pero otras fueron resistentes y se mantuvieron en funcionamiento.
Otro factor que pensamos que puede influir es la baja supervivencia de las células de Schwann
no mielinizantes a la inyección de 6OH. Si observamos las fibras de Gfap detectadas en ratones
TL tratados con 6OH eran muy reducidas en número y en longitud (Fig. 9), esto significa una
baja supervivencia de células de Schwann no mielinizantes. Tal como describe Hernández-
Baltazar et al., 2017 la 6OH puede autooxidarse extracelularmente. Las especies reactivas de
oxigeno derivadas de la autooxidación pueden afectar tanto a las células nerviosas como a las
células de Schwann. Al verse afectadas las células de Schwann por la 6OH, las células nerviosas
podrían haber sobrevivido debido a las disminución de 6OH que afectó directamente sobre los
botones catecolaminérgicos. No obstante, este es un tratamiento continuo con 6OH, de modo
que aunque las células de Schwann se afectaran en primer lugar por la autooxidación de la 6OH,
lo esperable seria que los nervios se afectaran a continuación ya que estarían expuestos
directamente a la 6OH. Una explicación más plausible sería una distinta sensibilidad por parte
de nervios y células de Schwann a la autooxidación de la 6OH.
En cualquier caso, para realizar una conclusión correcta de los resultados obtenidos es
importante tener en consideración las limitaciones técnicas a la hora de realizar la
comprobación de la simpatectomía. Primero, debemos ser conscientes que la
inmunofluorescencia es una técnica semicuantitativa, lo cual se debe principalmente a la
cantidad de muestra que se cuantifica, que es pequeña. También, a variables no controlables
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que pueden provocar variaciones de la señal que se cuantifica. Diferentes factores como la edad
de los anticuerpos y buffers utilizados o la experiencia del investigador que realizó la técnica
pueden afectar a la cantidad de fibras detectadas. De esta manera, a menor cantidad de fibras,
la sensibilidad de la cuantificación se reduce, lo que ha podido contribuir de manera relevante
a la detección de diferencias significativas entre los grupos TL vehículo y TL 6OH. Un factor
que ha podido afectar más a las muestras en nuestro caso es el tratamiento después de la
eutanasia del ratón. El procedimiento óptimo para realizar la inmunofluorescencia propone que
a la vez que el ratón muere, este sea desangrado e inyectado con PFA para fijar las muestras lo
antes posible. En nuestro caso el resto de las muestras biológicas del animal eran de gran
importancia para estudios funcionales con las células vivas, por lo que no realizamos la fijación
del tejido durante la muerte del animal. Conociendo las limitaciones a las que nos somete la
técnica pasamos a comentar los datos obtenidos, dado que es la técnica que actualmente más
información nos puede dar.
Los resultados de las muestras biológicas nos hacen pensar que la simpatectomía no afectó al
transcurso de la enfermedad como esperábamos. El análisis de células hematopoyéticas
mieloides y linfoides no mostraron grandes diferencias entre los animales TL tratados con 6OH
y con vehículo. Esperábamos que los ratones tratados con 6OH expresaran un fenotipo de la
enfermedad más avanzada, pero ni las muestras obtenidas durante el tratamiento ni el análisis
tras el sacrificio hubo cambios hematopoyéticos robustos. Una causa que creemos podría
explicar la menor eficacia del tratamiento en la enfermedad es la baja concentración de 6OH
administrada a los ratones. Al ser un tratamiento de larga duración la concentración no debía
ser muy alta para evitar efectos tóxicos en los ratones. La baja concentración de la droga, junto
con la baja frecuencia de administración de 6OH pudo permitir la regeneración de los nervios
simpáticos. Se ha descrito que los nervios simpáticos son capaces de regenerarse tanto en
órganos relacionados con la hematopoyesis como en el resto de órganos (35,36). El continuo
ciclo de daño y regeneración de los nervios simpáticos podría haber influido en la enfermedad
siendo la desregulación de la hematopoyesis menor de lo que se esperaba. Esto concuerda con
solo una tendencia a la reducción de fibras simpáticas en los TL tratados con 6OH con respecto
a los TL tratados con vehículo. En el futuro, en base a estos resultados, se debería usar un
tratamiento con 6OH más intensivo.
Otra de las explicaciones que encontramos para este fenómeno es la carencia de un reto
adicional para la hematopoyesis que permita evidenciar la función de los nervios de la médula
ósea. Experimentos realizados por Lucas et al., 2013 (37) mostraron como la inervación
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Conclusión
Los resultados nos permiten confirmar que el modelo diseñado para realizar la simpatectomía
en los ratones NRASG12D C y TL provoca la destrucción de los nervios simpáticos de la médula
ósea en los ratones C, pero ésta no es evidente en los TL. Por otra parte, la neuropatía no ha
tenido la repercusión esperada en la progresión de leucemia. Futuros experimentos incluirán
una mayor frecuencia de administración y mayor concentración de 6OH para asegurar la
simpatectomía química en ambos grupos experimentales. Además, futuros ensayos combinando
la 6OH con un daño genotóxico comprobarán la influencia de la simpatectomía en el avance de
la enfermedad en situaciones más similares a las de los pacientes, a los que generalmente se
trata con quimioterapia.
Los resultados obtenidos en este trabajo nos han permitido aproximarnos al diseño experimental
final que nos permitirá comprobar la capacidad del 4-metilcatecol como futuro tratamiento para
la LMA.
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NEUROPATÍA DE LA MÉDULA ÓSEA EN LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA | ADRIÁN FLORIT RUIZ
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