PRACTICA N° 3

MÉTODOS DE CULTIVO Y SIEMBRA

I. INTRODUCCIÓN
Las bacterias deben ser cultivadas en medios de cultivo de laboratorio para
caracterizar su crecimiento, hacer su identificación y determinar sus actividades
metabólicas. Un medio de cultivo es una solución acuosa de diferentes compuestos
que contiene todos los elementos indispensables que requieren los microorganismos
para crecer.
Generalmente las bacterias son inoculadas o introducidas en medios líquidos (caldos)
o solidificados con agar para su propagación y/o conservación, así como para estudiar
sus características de crecimiento. Es importante recordar que la inoculación de los
microorganismos en los medios de cultivo, siempre deberán realizarse en zona
aséptica (cerca del mechero o en campana de flujo laminar), condiciones que limitan la
presencia de microorganismos indeseables o contaminantes.
Las técnicas de aislamiento, permiten la obtención de microorganismos a partir de
muestras complejas (suelo, agua, alimentos, etc.) en las que hay una gran diversidad
microbiana, así como para comprobar la pureza de los cultivos obtenidos. Los cultivos
puros están formados por un solo tipo de microorganismo; y son indispensables para
conocer las características morfológicas, propiedades de tinción, actividad bioquímica,
patogeniddad, sensibilidad a antibióticos e identificación de las especies microbianas.
El aislamiento de cultivos microbianos puede realizarse por métodos de dilución, en
medios sólidos por estría en placa o en medios líquidos.
En el primer caso se considera que cada célula bacteriana que se separa dará origen
a una población que formará una colonia característica, visible a simple vista.
La limitación principal de estas técnicas de dilución, es que no es práctica para el
aislamiento a partir de mezclas donde el microorganismo de interés se encuentra en
pequeñas cantidades, donde solamente se obtendrán las bacterias dominantes.
Para favorecer el aislamiento de cultivos de baja densidad, se aplican métodos de
cultivo especiales, en los que se utilizan medios que contienen nutrientes especiales,
antibióticos, altas concentraciones de sales y/o condiciones de pH, luz o temperatura
para favorecer el crecimiento del microorganismo de interés y se conocen como
selectivos o de enriquecimiento.
En ocasiones se pueden agregar a los medios de cultivo otros componentes como:
sangre, colorantes, indicadores, etc. para distinguir especies bacterianas diferentes
por la forma en que metabolizan los sustratos que se manifiesta por cambios en la
apariencia o modificación del pH del medio de cultivo. Estos medios se conocen como
medios diferenciales y son de gran utilidad para la caracterización e identificación de
especies bacterianas.
II. OBJETIVOS
Que el alumno conozca las diferentes técnicas de aislamiento en medios de cultivo
sólido para la obtención de cultivos puros de bacterias
Que el estudiante prepare medios de cultivos de uso general, diferenciales y selectivos
para el cultivo de diferentes especies bacterianas.
 III. MATERIALES
3 cajas de Petri con Agar nutritivo
2 cajas de Petri con Agar de eosina azul de metileno EMB
2 tubos con Caldo Nutritivo
4 tubos con Agar Nutritivo
1 Mechero
1 Asa bacteriológica
1 Autoclave
Muestras de secreción faríngea y orina
IV.PROCEDIMIENTO
a. Emplear un inoculo que pueda proceder de la boca de los propios estudiantes,
o una muestra cualquiera traída al laboratorio (jugo, leche, etc)
b. Siembra: Se realiza usando la aza bacteriológica, una espátula, una torunda o
cualquier otra forma que permita una diseminación de los gérmenes en el
medio de aislamiento cuando es sólido.( usar una torunda de algodón)
Modalidad de siembra: Para la diseminación es necesaria una amplia
superficie de medio nutritivo; esta se logra en placas petri y en menor medida
en agar inclinado. La técnica de la siembra en sí, consiste en pasar por sobre
toda la superficie del medio, el instrumento portador del inóculo, es
recomendable evitar dañar la superficie del medio.
Las formas como debe hacerse la diseminación es:
I. Siembra con rastrillo
II. Siembra con asa de cultivo
 Diseminación en superficie
 Agotamiento en superficie
 Tubos en superficie
 Tubos en profundidad o picada
III. Siembra con torunda

Siembra con rastrillo Diseminación en superficie

 Siembra semicuantitativa de Siembra en tubo en superficie
agotamiento en superficie

Debe observarse que la placa este seca antes de la siembra

c. Incubación.- Después de la siembra, debe quedar en la incubadora con la
tapa hacia abajo, para que el agua de condensación (desprendida por el calor
de la estufa) no malogre la siembra. El cultivo para gérmenes anaerobios,
constituye un procedimiento especial, que será referido al tratar de estos
gérmenes.
d. Lectura de la siembra: Entre las 12 y 24 horas aparecen por lo común las
primeras colonias y es cuando comienza la observación del cultivo.
En las colonias se estudia la forma, tamaño, contorno, coloración,
emulsionabilidad, grado de opacidad, superficie y consistencia.
En los medios líquidos se observa el grado de turbidez, película, sedimento y
otros caracteres.
En medios especiales se estudia las acciones bioquímicas del medio sobre los
diversos componentes del medio.
Uno de los caracteres fundamentales en una colonia es lo referente a su
contorno y superficie. Las colonias de contorno regular y superficie lisa, se
llaman colonias S( de la palabra inglesa Smooth que significa suave-liso). Las
de contorno y suerficie irregulares, se llaman colonias R( de Rough que
significa rugoso) Estos gérmenes tienen relación con la virulencia de algunos
gérmenes.
e. Transplante o resiembra. El estudio macroscópico de las colonias se
completa con un estudio microscópico que se realiza emulsionando una
fracción de la colonia en una pequeña gota de suero fisiológico o agua
cuidando que la extensión sobre la lámina sea fina. Se fija, se colorea y se
observa en inmersión.
 Luego se procederá al transplante o resiembra que consiste en tomar con el
aza la fracción de la colonia elegida, y llevar este inóculo a otro medio líquido o
solido en el que se obtendrá el desarrollo de una sola especie de germen, lo
cual constituye la fase final del proceso de aislamiento. El germen aislado en
estado de pureza constituye una Cepa, aunque este término se reserva con
más estrictez a gérmenes cuyas propiedades han sido profundamente
estudiadas y sirve incluso como patrones de comparación.
Los procedimientos de siembra en los transplantes varían según el medio que
se va a usar. Si el medio es liquido, bastara tocar la superficie de este con el
inóculo. El medio es sólido variará la forma de siembra, siendo en unos casos
por estría , o sea pasando el inóculo en zigzag sobre la superficie del medio
inclinado, y en otros por punción o picadura, que consiste en introducir la aguja
hasta el fondo o a poca profundidad según la naturaleza del medio.
No debe olvidarse que todas las manipulaciones se practican frente a una
llama de alcohol o gas. La boca de los tubos se flamea al destaparlos y antes
de volverlos a tapar.
El aza se esteriliza al rojo antes y después de su empleo. El tubo y cajas Petri
se marcan con un lápiz para vidrio poniendo nombre o número de registro,
fecha u otro dato importante.
Preparación de medio de cultivo( En línea)
Jóvenes, los que pueden conseguir placas Petri de plástico, que venden
en el lab. Cerca de los hospitales, de lo contrario en unos platos de té
prepara lo siguiente:
Diluir la colapez o gelatina incolora en un porcentaje de tal manera que
quede sólido. Cuidar la esterilidad es decir no exponer el medio ni los
depósitos a corrientes de aire ni manipulación excesiva. Una vez que
enfrían y solidifican seguir las instrucciones de los videos que se les
estará pasando y de las indicaciones del docente.

RESULTADOS
DISCUSIÓN
1. Es posible aislar gérmenes en estado de pureza en medios líquidos a partir de
muestras con flora variada.

2. Qué importancia tiene el aspecto de una colonia

3. Qué importancia tiene la capacidad de un germen de desarrollar o no en un

medio simple

4. Que le indicaría la presencia de un bacilo y un coco en la coloración de una

suspensión hecha a partir de una colonia.

5. Cuál es la información que se obtiene de las siembras de cultivos barterianos

en tubos con agar inclinado y en tubos con agar solidificado en forma recta?
 6. Porque el agar nutritivo es un medio de uso general para el cultivo de
bacterias? Proponga algunas sustancias que se le agregarían para hacerlo
selectivo para bacterias Gram negativas?

7. Cuál es la composición química de los medios diferenciales empleados en los

videos? ¿Cuáles son los componentes o propiedades responsables de su
función como medios selectivos o diferenciales?

REFERENCIA BIBLIOGRAFICA