INFORME DE LABORATORIO: SIEMBRA E IDENTIFICACIÓN DE ESTRUCTURAS

CELULARES

MARIANA ALDANA CASTELLANOS

MARÍA FERNANDA MARIN RUIZ

TATIANA FAJARDO URBINA

ESTUDIANTES BIOINGENIERÍA IV SEMESTRE

BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR

UNIVERSIDAD EL BOSQUE

OCTUBRE 2019

BOGOTA D.C
Lista de tablas............................................................................................................................................3

Lista de imágenes.......................................................................................................................................3

Capítulo 1 Problema de la investigación..................................................................................................4

1.1. Objetivos 4
1.2. Objetivo General 4
1.3. Objetivo especificos 5

2. Capítulo 2 Materiales y metodos......................................................................................................6

2.1. Primera etapa experimental 6
2.2. Segunda etapa experimental 9

3. Resultados Bacterias........................................................................................................................33
3.1. Nivel Macroscopico 33
3.2. Nivel Microscopico 38
4. Resultados Hongos.........................................................................................................................38
4.1. Nivel Macroscopico 38
4.2. Nivel Microscopico 38
5. Análisis de Resultados………………………………………………………………………………40
6. Conclusiones…………………………………………………………………………………41
Lista de tablas

Tabla 1. Materiales empleados en la primera etapa de la práctica.............................................................32

Tabla 2. Materiales empleados en la segunda etapa de la práctica............................................................35

Lista de imágenes

Ilustración 1 Material particulado y calidad del aire (Ministerio de Ambiente de Perú, 2017)..................23

Ilustración 2 Jerarquía de estrategias para prevención de contaminación (CNMA, 2001).........................25

Ilustración 3 Medidas de mejora en operaciones y prácticas de gestión....................................................25

Ilustración 4 Gestión de residuos aprovechables y no aprovechables........................................................26

Ilustración 5 Esquema de una cámara de compostaje con UDDT..............................................................31

 Capítulo 1 Problema de la investigación
1.1. Objetivos
1.1.1. General: Identificar las estructuras celulares de hongos y bacterias a partir
de características morfológicas.
1.1.2. Específicos
1. Sembrar en medio de cultivo los diferentes géneros de bacterias con el propósito de
determinar sus características morfológicas.
2. Sembrar en un medio de cultivo diferentes géneros de hongos con el propósito de
determinar sus características morfológicas.
3. Observar la morfología de los hongos y bacterias distinguiendo sus diferentes estructuras
celulares.
2. Capítulo 2 Materiales y métodos
2.1. Primera etapa experimental
2.1.2. Materiales.

A continuación, se listan los materiales usados en la práctica que consistió en la siembra de

bacterias y hongos en distintos medios de cultivo.
Tabla 1. Materiales empleados en la primera etapa de la práctica.

Materiales Bacterias Hongos

● Agar-PDA (Hongos)
● Agar nutritivo (Bacterias)  Muestra
● E. coli
● Rosa de Bengala (Hongos) ● Colonia 9 problema
● Asas Curvas.  Muestra 1
● Asas rectas.  Muestra 2
● Mechero.  Muestra 3
 Levadura

2.1.3. Proceso realizado para la siembra de hongos.

La metodología usada para la siembra de los hongos se llevó a cabo en dos medios de cultivo:

● PAPA DEXTROSA AGAR (PDA): Es un medio muy usado que sirve para aislar todo
tipo de hongos ya que crecen muy bien y esporulan en este medio [1]. En este medio
fueron sembrados los hongos muestra 1, 2 y 3.
 ● ROSA DE BENGALA: El agar rosa de bengala con cloranfenicol se utiliza para el
aislamiento selectivo y enumeración de levaduras y mohos a partir de alimentos en un
entorno de laboratorio. El agar rosa de bengala con cloranfenicol es un medio selectivo
para la enumeración de hongos. El cloranfenicol se recomienda como el agente selectivo
en medios fúngicos con un pH neutro debido a su estabilidad térmica y amplio espectro
antibacteriano. [2] En este medio fue sembrado únicamente la muestra problema.

La siembra se realizó con el fin de aislar los hongos para mantenerlos viables por un tiempo
corto. La siembra en cultivo puro consiste en dejar crecer el hongo elegido bajo condiciones en
las que pueda desarrollar y esporular convenientemente. Se realizó por medio de un asa recta,
específicamente por un simple toque. Para la siembra se usaron placas que después fueron
sellados, marcados con la fecha, nombre del grupo e incubados por 7 días [1].

Gráfica 1. Diagrama de flujo de la siembra de hongos.

2.1.4. Proceso realizado para la siembra de bacterias.

La metodología usada para la siembra de bacterias se llevó a cabo en el medio de cultivo:

● AGAR NUTRITIVO: Es un medio sólido que se prepara añadiendo 12 g de agar-agar a

un caldo usual. Rodríguez, E., Gamboa, M., Hernández, F., & García, J. (2005). En este
medio fueron sembrados las bacterias de la colonia 9, muestra 1, muestra 2.

● EMB: es un medio ligeramente selectivo y de diferenciación para el aislamiento y la

diferenciación de bacilos Gram negativos entéricos (Enterobacteriaceae).Dickinson, B.
(1992). En este medio fue sembrada la bacteria Escherichia coli.

La siembra de bacterias se llevó a cabo por el método de agotamiento por estrías en donde se
vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido y se deja solidificar. Se realizó
mediante la técnica B: consiste en que, con el asa redonda cargada se hacen 3 o 4 estrías; se
quema el ansa, se hacen 3 o 4 estrías perpendiculares a las anteriores, se quema el ansa y se
repite el procedimiento hasta agotar la superficie de la placa [5].

Imagen 1. Técnica de agotamiento por estrías.

Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio

adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano para su desarrollo y multiplicación. Una
vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento. Las
reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen [5]:

● Que se efectúen asépticamente.

● Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estén esterilizados.
● Que se realicen solo los manipuleos indispensables.
● Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un mechero.
 Gráfica 2. Diagrama de flujo de la siembra y aislamiento de bacterias.

2.2. Segunda etapa experimental

2.2.1. Materiales
Los materiales empleados en la práctica que consistió en el uso de técnica de tinción para la
posterior identificación en microscopio.

Tabla 2. Materiales empleados en la segunda etapa de la práctica

Materiales Reactivos

● Asas Curvas. Azul de lactofenol.

● Mechero. Agua.
● Cinta transparente.
● Lámina portaobjetos. Cristal violeta.
● Lámina cubreobjetos. Lugol.
 Alcohol acetona.
● Microscopio.
Safranina.
Aceite de inmersión.

Con el fin de identificar los organismos por microscopía se lleva a cabo un procedimiento de una
tinción de azul lactofenol para hongos y tinción de GRAM para bacterias.

1. Tinción con azul lactofenol para hongos

Es una técnica rápida que permite visualizar perfectamente las estructuras fúngicas donde se
observa el micelio micólico de color azul, está compuesto por; Alcohol metílico, Azul de
algodón acético, Agua destilada 250 mL, Alcohol al 96% y xilol [5].

El azul de lactofenol tiene tres funciones importantes a la hora de observar hongos del tipo
mohos obtenidos por aislamiento de medios inoculados. El fenol destruye la flora acompañante.
El ácido láctico conserva las estructuras fúngicas al provocar un cambio de gradiente osmótico
con relación al interior del fúngico generando una película por así llamarlo protectora.La tinción
de azul algodón de lactofenol no es considerada una tinción diferencial, sin embargo, posee
características tintoriales que permiten observar cada uno de los componentes fúngicos y apreciar
fácilmente las estructuras para una adecuada identificación. [5]

El fenol inactiva las enzimas líticas de la célula e impide que ésta se rompa; de igual forma,
destruye la flora acompañante e inactiva a la célula, quitándole el grado de patogenicidad;
además, actúa como mordiente cuando se usa en combinación con colorantes. El ácido láctico
preserva las estructuras fúngicas al provocar un cambio de gradiente osmótico con relación al
interior fúngico, lo que genera una película protectora. El azul de algodón es un colorante ácido,
que tiñe el citoplasma y la quitina presente en las células fúngicas, mientras que el glicerol
mantiene húmeda la preparación. Una vez preparado el colorante, se debe colocar la muestra
microbiológica en un portaobjetos por medio de una impronta (proceso en el cual se coloca una
impresión de la muestra sobre una estructura utilizando una cinta adhesiva transparente).[6].
 Gráfica 3. Diagrama de flujo de la tinciòn de azul lactofenol en hongos.

2. Coloración de GRAM en bacterias

Las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los
términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico, sino simplemente
designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias). Descripta en forma breve, la secuencia
de la tinción es la siguiente: el Frotis fijado con calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal, se lava
con agua, se cubre con solución Yodada durante 1 - 2 min. y se lava de nuevo con agua,
decolorar con mezcla alcohol etílico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste)
durante 1 – 2 min. Lavar y secar. Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma
distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares [5]
Gráfica 4. Diagrama de flujo de la tinciòn de GRAM en bacterias..
 Figura 1. Esquema de las diferencias estructurales entre bacterias Gram negativas y Gram positivas.

Bibliografía