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1. Clonado de genes
2. Construcción de mutantes
3. Secuenciación del genoma humano (y otros genomas)
4. Kit de detección de agentes infecciosos (chlamydias, HIV)
5. Detección de enfermedades genéticas (anemia falciforme,
fibrosis cística)
8. Pruebas de paternidad
9. Diagnóstico de parásitos
10. Y muchas otras….
Qué es una PCR y como se hace?
ADN molde: (extraído del organismo
bajo estudio)
Termocicladora
Termobloque
¿Cómo se hace una PCR?
Desnaturalización Extensión
94 ºC 94 ºC
Tª Unión cebador 72 ºC 72 ºC
5´ 1´
50-60 ºC 1-5´ 5´
1´
x 25-35 ciclos
Amplificación de ADN in vitro
Amplificación
exponencial
Resultado de una PCR
Modificación de la Tª de annealing
Modificación de la concentración de Mg2+
annealing del primer
desnaturalización de las cadenas
actividad enzimatica
PCRs solapantes
PCRs anidadas
Mutagénesis dirigida
Mutagénesis al azar
PCR múltiple
Fragmento 1
A
5’
5’ Ventajas: una amplificación
más específica
B
C
5’
5’
C
5’
5’ Fragmento 2
D
Mutagénesis dirigida
Introducir mutaciones en un lugar concreto del ADN
ADN molde
A
X
5’
5’ 5’
X 5’
B
5’
X 5’
5’
5’
X
X
X
5’
5’ Dpn I
5’
5’
X X
X
X
5’
5’
A
5’ X 5’ X
5’
5’
X 5’ X 5’
X
X
B
5’ X 5’ X
5’ 5’
Mutagénesis al azar
Introducir mutaciones puntuales en los fragmentos amplificados
ADN molde
A
5’
5’
B
1 mM dGTP, dCTP y dTTP
0.2 mM dATP
Aumento Mg2+ (de 2 mM a 6.2 mM)
Presencia Mn2+
5’ X
5’ X
X 5’
X 5’
5’ X
X 5’
5’ X X
X X 5’
5’ X
X 5’
PCRs múltiples
Reamplificar varias regiones de ADN al mismo tiempo
A C E
B D F
A+B
C+D
E+F
A
E
5’
5’ 5’
5’
B C
5’ F
5’
ADN
P
5’
AAAAA 3’ mARN
3’
Reverso transcriptasa (virus)
Poli T o primer específico
5’
TTTTT 5’
AAAAA
3’
cDNA
A Rompe union
ARNsa H
RNA/DNA
PCR normal
Usos: B
Amplificar regiones codificantes de genes de eucariotas
Detectar expresión génica
Técnica semicuantitativa de la expresión génica
QRT-PCR (quantitative real time PCR)
Se obtiene información on line de la amplificación
Estrategia 1: Estrategia 2:
colorantes de dsADN primers marcados
A A
5’ 5’
5’ 5’
B B
Fluóroforo Fluóroforo Quencher
(SYBR-Green I)
A 5’ 3’
5’
5’
5’
B 5’
Detector
de fluorescencia Detector
de fluorescencia
Ventajas de la PCR en diagnóstico
Alta especificidad
Toma de muestra
(Sangre, Orina, Heces, Tejidos, Extracción de ADN total
semen)
Análisis de PCR:
electroforesis o fluorometría