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Facultad de Ciencias Médicas

Escuela Académico Profesional de Nutrición

Ms.C Jorge Luis Díaz Ortega


Maestría en Biotecnología, Fisiología y Biofísica
Doctorando en Ciencia Biomédicas
 “En la actualidad, se han realizado enormes
esfuerzos con impresionantes frutos en el
ámbito de la bioinformática con potentes
bases de datos de secuencias, de proteínas de
vías metabólicas, etc., que ponen a
disposición de la comunidad científica una
ingente cantidad de información nunca antes
generada”.
 Las dos o más formas de
variantes de un segmento
de ADN que codifica una
proteína específica (para un
determinado rasgo
característico) se denominan
alelos.
 Locus es la ubicación
definida de un alelo dentro
de un cromosoma
 Si hay dos versiones, la
variante genética es
bialélica; con varias
versiones es multialélica.
 Las variantes genéticas que se producen en al
menos 1% de las poblaciones se definen
como polimorfismos.
 Mucho se malinterpreta que todos los
polimofismos son solo SNP
 Hay otros polimorfismos que no son SNP que
incluyen las inserciones, deleciones y
variantes en el número de copias (CNV)
 Un error de concepción común que los
polimorfismos son mutaciones. Es incorrecto,
porque sería muy poco probable para una
variación particular que se produzca
espontáneamente precisamente en el mismo
locus y con exactamente el mismo cambio en
millones de personas.
 Todas variantes que son lo suficientemente
común que se llama polimorfismo han sido
heredado lo largo de muchos cientos o miles de
generaciones, a veces abarcan millones de años
y en múltiples especies distintas
 Un polimorfismo de un solo
nucleótido o SNP (Single Nucleotide
Polymorphism,pronunciado snip) es
una variación en la secuencia
de ADN que afecta a una sola
base (adenina (A), timina (T), citosina (
C) o guanina (G)) de una secuencia del
genoma. Una de estas variaciones
debe darse al menos en un 1% de la
población para ser considerada como
un SNP. Si no se llega al 1% no se
considera SNP y sí una mutación
puntual.
 ESTE TEMA SE ABORDARA CON
MAYOR TIEMPO LA PRÓXIMA
SESIÓN
 El cambio más simple en una secuencia de
gen es la sustitución de una base con una
diferente. Este tipo de variante (y sólo este)
se llama un SNP.
 Por lo general se describe con su ubicación, la
base en la forma más común, una flecha o el
carácter > y la base de la variante (por
ejemplo, en el gen de la metileno tetrahidro
reductasa MTHFR 677C>T).
 Cuando un gen que codifica una enzima que
tiene varias variantes comunes que difieren
en su secuencia de aminoácidos, las formas
individuales se denominan alozimas.
 En el caso de la variación 677C>T en el gen de la
MTHFR, los genotipos que podemos encontrar
en la población son: CC, CT y TT.
 En el primer caso, tanto el alelo procedente del
padre como el de la madre poseen la base C en
posición 677.
 El genotipo CT se denomina heterocigoto
porque un alelo procedente de un progenitor es
normal, mientras que el otro está cambiado.
 Por último, el genotipo TT sería la situación de
un homocigoto con los dos alelos cambiados
 Polimorfismo +2138InsCAGACC en el gen del
receptor 3 de la melanocortina (MC3R). Este
polimorfismo consiste en la inserción de seis
nucleótidos CAGACC en posición +2138 del gen
MC3R.
 En algunos estudios este polimorfismo se ha
asociado con menor peso corporal en personas
obesas y menor riesgo de obesidad, ya que dicha
inserción podría influir en la expresión del gen y
su subsiguiente acción, induciendo una
disminución de la ingesta de alimentos.
 Sin embargo, en los últimos años, las variaciones que más
interés han despertado han sido las denominadas CNV, que
consisten en variaciones en el número de copias de segmentos
específicos de cada gen, con un tamaño mínimo de 1.000 pares
de bases.
 De los distintos estudios publicados en los que se analizan
CNV, uno de los que tuvo más impacto inicial en ciencias de la
Nutrición fue el publicado en 2007 por Perry y col.(3) en el que
asociaban el número de copias del gen de la amilasa de la
saliva (AMY1) con la cantidad de la proteína amilasa en la
saliva, observando también que los individuos de las
poblaciones que consumen dietas ricas en almidón poseen un
mayor número de copias del gen AMY1 que los individuos de
aquellas poblaciones que consumen tradicionalmente dietas
pobres en almidón. Por ejemplo, los yakutos –un grupo de
etnia turca– del Ártico, cuya dieta tradicional consiste en
pescado, tienen menos copias de AMY1 que los japoneses,
cuya dieta incluye alimentos con alto contenido de almidón
como el arroz.
 “El análisis más detallado de la organización
estructural y funcional de los genes y de los
genomas de los organismos vivos requiere
conocer la secuencia nucleotídica de estos”.
 “En la actualidad los métodos más utilizados
son la secuenciación enzimática de
terminación de la cadena basado en Sanger o
Dideoxi y la secuenciación automática”.
 En este método, una molécula de ADN cuya
secuencia va a ser determinada es
convertida a hebra simple la cual es usada
como molde para sintetizar una serie de
hebras complementarias.
 Un enzima que replique el ADN,
normalmente la ADN Polimerasa I del
bacteriofago T4. La ADN Polimersa I del fago
T4 emplea como molde ADN de hélice
sencilla y siguiendo las reglas de
complementariedad de las bases
nitrogenadas va añadiendo nucleótidos a
partir de un cebador o "primer".
 Un cebador o "primer" que suele ser un
oligonucleótido corto de alrededor de 20
bases de longitud necesario para que la ADN
polimerasa I comience a añadir nucleótidos
por el extremo 3' OH. El "primer" utilizado
suele marcarse radiactivamente.
 Los cuatro nucleótidos
trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y
dTTP).
 Por último, se necesitan
nucleótidos didesoxi (ddATP,
ddTTP, ddCTP y ddGTP). Los
nucleótidos didesoxi son
nucleótidos modificados que
han perdido el grupo hidroxilo
de la posición 3' de la
desoxirribosa.
 Estos nucleótidos pueden
incorporarse a la cadena de
ADN naciente, pero no es
posible que se una a ellos
ningún otro nucleótido por el
extremo 3'. Por tanto, una vez
incorporado un nucleótido
didesoxi se termina la síntesis
de la cadena de ADN.
 En primer lugar, deben realizarse en
cuatro tubos diferentes, cuatro
mezclas de reacción. Cada mezcla de
reacción contiene los cuatro
nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP,
de dTTP y dGTP), ADN polimerasa I,
un cebador marcado radiactivamente
y un nucleótido didesoxi, por ejemplo
ddATP, a una concentración baja. El
nucleótido didesoxi utilizado (ddATP
en este ejemplo) competirá con su
homólogo (dATP) por incorporarse a
la cadena de ADN que se está
sintetizando, produciendo la
terminación de la síntesis en el
momento y lugar donde se incorpora.
 Por este sistema, en cada mezcla de
reacción se producen una serie de
moléculas de ADN de nueva síntesis
de diferente longitud que terminan
todas en el mismo nucleótido y
marcadas todas radiactivamente por
el extremo 5'
 Los fragmentos de ADN de nueva
síntesis obtenidos en cada mezcla de
reacción se separan por tamaños
mediante electroforesis en geles
verticales de acrilamida muy finos (0,5
mm de espesor) y de gran longitud
(cerca de 50 cm) que permiten distinguir
fragmentos de ADN que se diferencian
en un solo nucleótido. Los productos de
cada una de las cuatro mezclas de
reacción se insertan en cuatro calles o
carriles diferentes del gel.
 Una vez terminada la electroforesis, el
gel se pone en contacto con una película
fotográfica de autorradiografía. La
aparición de una banda en una posición
concreta de la autorradiografía en una
de las cuatro calles nos indica que en
ese punto de la secuencia del ADN de
nueva síntesis (complementario al ADN
molde) está la base correspondiente al
nucleótido didesoxi utilizado en la
mezcla de reacción correspondiente.
 Teniendo en cuenta
que el ADN de nueva
síntesis crece en la
dirección 5' --> 3', si
comenzamos a leer el
gel por los
fragmentos de menor
tamaño (extremo 5') y
avanzamos
aumentando el
tamaño de los
fragmentos (hacia 3'),
 En la siguiente
figura se muestra
un ejemplo de
una secuencia
obtenida por el
método
automático de
secuenciación.
 Cuando aparece
la letra N significa
que no ha sido
posible
determinar el
nucleótido
existente en esa
posición de la
secuencia.
 Estudio de genes que se expresan
diferencialmente entre varias condiciones
– Sanos/enfermos, mutantes/salvajes, tratados/no
tratados
 Clasificación molecular en enfermedades
complejas
 Identificación de genes característicos de una
patología (firma o “signature”)
 • Predicción de respuesta a un tratamiento
 • Detección de mutaciones y polimorfismos de
un único gen (SNP)
 • Etc, etc, etc…
 Existen muchos tipos de microarrays
 Los principios en que se basan son similares
 • Los detalles de su funcionamiento varían de
uno a otro caso
 • En este primer contacto nos centraremos en
los
 arrays de expresión
 – Arrays de 2 colores (spotted)
 – Arrays de oligonucleótidos sintetizados in
situ
 Microarrays de 2 colores (spotted)
 Diseño y producción del chip
 Preparación de la muestra
 Hibridación
 Escaneado del chip
 Análisis de la imagen
 Diseño más avanzado que los de 2 colores
 Utilizan tecnologías desarrolladas en el entorno
 de la microelectrónica
 Algunos rasgos distintivos
 – No se basan en hibridación competitiva: cada chip
contiene muestras de un solo tipo (”1 color”)
 – Las sondas se sintetizan directamente sobre el chip
en vez de sintetizarlas in vitro y adherirlas después
 Cada gen esta representado por un grupo de sondas
cortas en vez de por una solo
 Un grupo de sondas se utiliza para medir
niveles de mRNA de un único gen
 Cada grupo (probeset) consta de múltiples
pares de celdas (probe cells)
 – Con millones de copias de un oligo de 25bp
 – Organizadas en parejas (probe pairs) con un
Perfect Match (PM) y un Mismatch (MM)
▪ • PM: coincide exactamente con una parte del gen
▪ • MM: idéntico al PM excepto en el nucleótido central
reemplazado por su complementario