LA ASOCIACION SIMBIOTICA FIJADORA DE NITROGENO ATMOSFERICO Azolla-Anabaena F. SEVILLANO* P. SUBRAMANIAM* C. RODRIGUEZ-BARRUECO* SuMmaRy: The agronomically important nitrogen-fixing symbiotic associ- ation between Azolla spp., an aquatic fern, and Anabaena azoliae, a blue-green algae, exploited since times immemorial as a nitrogenous biofettilizer in South- East Asia, is currently a topic of intensive study in industrialized countries. This paper presents a review of the literature accumulated on this symbiotic association, laying special emphasis on the physiological and morphological characteristics of the symbionts in relation to their nitrogen-fixing ability, biochemistry of N- fixation, interrelationships between the symbionts and the ecology of the association. Its high nitrogen-fixing capacity (103-162 kg N/ha/yr), fast growing ability, and the possibility to use it either as a green manure or as a dual-culture crop with rice, contribute to the potentials offered by this system to complement or substitute the increasingly expensive chemical nitrogenous fertilizer. Further- more, the high carbohydrate and nitrogen content of this association also permits its use in the production of biogas. RESUMEN: El sistema simbiético fijador de nitrdgeno atmosférico constituido por el helecho acuatico Azolla spp. y la cianoficea Anabaena azollae, de signifi- cacién agronémica por su empleo tradicional como fertilizante nitrogenado en paises del Sudeste Asidtico, es ya objeto de investigacién en paises industrializa- dos, FI presente trabajo contribuye a la actualizacién de los conocimientos cien- tificos y prdcticos acumulados, haciendo énfasis en las caracteristicas morfol6- gicas y fisioldgicas de los simbiontes en relacién con la actividad fijadora de ni- trégeno y su bioguimica, asi como estudiando las relaciones simbisticas entre los dos erganismos y la ecologia de su asociacién. Finalmente, se destaca la im- * U.E.L Fijacion de Nivégeno y B. de S. Centro de Edafologia y Biologia Aplicada, C.S.1.C. Salamanca, 233portancia del sistema simbistico como biofertilizante, siendo capaz de fijar 103-162 Kg N/ha/aho, lo que unido a su rapido crecimiento y posibilidad de empleo co- mo abono verde 0 en cultivo simulténeo, constituye un complemento o alterna- tiva a los fertilizantes de sintesis industrial. Asimismo, el contenido de sustan- cias carbonadas y nitrogenadas de la asociacién hacen de ella un firme candida- to para la produccién de biogas. INTRODUCCION El nitrégeno en su forma molecular (N,) constituye un 79 Yo aproxima- damente de ja atmésfera terrestre, pero no puede ser utilizado directamente por los vegetales superiores. De ahi que el rendimiento de la mayoria de los cultivos fundamentales para la alimentacién humana sea dependiente del su- ministro de N asimilable. Las limitaciones econémicas en ia produccién in- dustrial de fertilizantes y los problemas ecolégicos que resultan de su aplica- cién, hacen que cobre especial importancia la utilizacién de aquellos organis- mos que sean capaces de fijar N, atmosférico. Sélo unos pocos pueden ha- cerlo y todos son heterstrofos, excepto grupos de algas azul-verdosas (ciano- ficeas), que ademas son los tinicos capaces de realizar Ja fotosintesis de sus compuestos carbonados, por lo que no necesitan un aporte exdgeno de éstos. Estos grupos de cianoficeas, ain cuando fijan N, en vida libre, pueden también realizar esa funcién cuando se encuentran en simbiosis con varios tipos de plantas, tales como dlgas, hongos, briofitas, pteridofitas, cicadineas y angiospermas, incluyendo un total aproximado de 30 géneros (STEWART, 1978). La gran significacién agronémica de la asociacién entre el pequeito he- lecho dulceacuicola Azolla Lam. y el alga azul-verdosa Anabaena azollae Strasb., ha inducido a los autores de este trabajo a dar una vision general y actualizada de la misma. Dicha significacién ha sido poco estudiada y eva- luada en nuestro pais y en el mundo occidental en general, debido, por una parte, al uso de fertilizantes industriales, y, por otra, a los mayores esfuerzos dedicados a la investigacién de otras asociaciones fijadoras, como legumino- sas —Rhizobium o actinorrizas— Frankia, pero que, sin embargo, posee una importancia demostrada como biofertilizante en otros paises menos industria- lizados. LA ASOCIACION SIMBIOTICA Azolla-Anabaena La asociacién Azolla-Anabaena, que fue puesta ya de manifiesto en 1973 por Strasburger, es la tinica simbiosis conocida entre una pteridofita y una cianoficea y esté ampliamente distribuida en aguas dulces tropicales y tem- 234,pladas de todo el mundo. Todas las especies de Azolla investigadas contienen una alga azul-verdosa identificada como Anabaena azollae y ratamente se ha encontrado el helecho en cottdiciones naturales libres del microsimbionte, Anabaena es un simbionte extracelulat que habita en cavidades forma- das en las hojas del helecho, del que obtiene proteccién fisica y quimica, a la vez que un aporte de nutrientes minerales y compuestos energéticos. Por su parte, Azolla esta en disposicién de utilizar sustancias nitrogenadas sinte- tizadas pot la cianoficea. La capacidad fijadora del sistema simbiético, conocida desde hace dé- cadas y demostrada por MOORE (1969}, facilita el desarrollo del mismo en medios pobres 0 carentes de nitrégeno combinado. Cuando en el Jaborato- rio se logra separar Azolla de Anabaena, aquél se muestra incapaz de cre- cet en un medio deficiente en N combinado, y atin cuando éste se encuen- tre en abundancia, el crecimiento es menor que en plantas con el microsim- bionte (BECKING, 1978}, indicando que la cianoficea ha de ser capaz de su- ministrar a la asociacién todo el N que ésta necesite. Becking determiné una cantidad de 335-670 kg N fijado/ha/afio en Azolta pinnaia R. Br. en condi- ciones de laboratorio, pero normalmente los valores obtenidos en condicio- nes ambientales son menores, debido a las limitaciones en la actividad fijado- ra que ellas imponen o a variaciones en la fisiologia del material cuando se maneja en un medio artificial. En efecto, este autor, en experimentos de cam- po, determind en la misma especie una cantidad de N fijado de 103-162 kg/ha/aiio, siendo no obstante de 12-20 veces mayor que en el alga aislada. La fijacién éptima de N, se logra, pues, en el estado de asociacién simbidti- ca, lo que implica un intercambio de nutrientes entre helecho y alga. La simbiosis Azolla-Anabaena es, por lo tanto, un eficiente fijador de N, atmosférico, ademds de reunir una serie de caracteristicas, como facil pro- pagacién, rdpido crecimiento, produccién de abundantes hojas con un alto contenido de N, rapida descomposicion en el suclo y no transmitir enferme- dades a los cultivos, que la hacen ttil como biofertilizante. EL HELECHO ACUATICO Azolla El género Azolla constituye un grupo homogéneo claramente separado de Salvinia Adans., el otro género con el que forma la fam. Salvinidceas. El esporofito consiste en un tallo flotante que consta de un eje principal con nudos de tos que parten ramas laterales y verdaderas raices. Las raices estén sumergidas en el agua y poseen una cofia terminal y numerosos pelos radicales, cuyo desarrollo parece estar controlado indirectamente por et mi- crosimbionte, ya que su contribucién al peso fresco es mayor en plantas que carecen de la cianoficea (PETERS, 1976). Las hojas son pequefias, alternas € 235imbricadas, y desarrollan dos Iébulos, uno ventral y otro dorsal. El ventral ¢s fino, con poca clorofila y parcialmente sumergido, mientras que el I6bulo dorsal, mucho mayor, es grueso, con abundante clorofila y siempre aéreo, con la propiedad de repeler el agua (fig. 1). Los filamentos de Anabaena azollae, que se encuentra asociada al hele- cho durante todas las etapas del crecimiento de éste, se hallan ya presentes en el ptimordio foliar. A medida que el desarrollo de la hoja continiia, los filamentos algales quedan atrapados en cavidades formadas en la cara ven- tral del lébulo dorsal, cerca de su base (fig. 2). Estas cavidades poseen una Fiq.1. Planta de Azolla sp. cultivada en el laboratorio de los autores en una solucién nu- triente libre de nitrogeno combinado bajo iluminacién de 60 wEs!m*(x 4) FiG. 2. Seccion transversal de una hoja de Azolla mostrando su organizacion. 1 = lébulo dorsal; 2 = Idbulo ventral; 3 = Anabaena azollae; 4 = cavidad fo- liar; 5 = pelos pluricelulares; 6 = tejido conductivo; 7 = zona de cierre de la ca- vidad foliar. 236pequefia abertura central que en hojas jévenes comunica con el exterior, y estén revestidas por células epidérmicas, de las que sobresalen pelos plurice- lulares en todos los estadios del crecimiento. En hojas jévenes, la cianoficea llena a menudo la cavidad foliar, adoptando en su interior una distribucion periférica, a lo largo de una capa de mucilago que la tapiza interiormente y que presumiblemente es secretado por los pelos (Moore, 1969). La abertura de la cavidad acaba por cerrarse, quedando el alga completamente protegida del ambiente exterior. No existe evidencia de que Anabaena escape de la cavi- dad durante el envejecimiento de Azolla. Antes de la muerte de las hojas, se observa una reduccién en el nimero de células algales, las cuales parecen en- fermas y muestran cambios en la pigmentacién, como si estuviesen en proce- so de desintegracién (BECKING, 1978). La formacién de las cavidades foliares y de los pelos multicelulares aso- ciados a ellas constituye una manifestacién morfoldgica del helecho, puesto que aparecen en ausencia del microsimbionte (PETERS and MAYNE, 1974). Nin- guna otra especie de cianoficea ha sido encontrada en la cavidad, si bien se han observado algunas bacterias no fijadoras de N,, atin cuando con una fre- cuencia muy baja en plantas sanas. La diferenciacién de Azolla en especies es poco clara. Segtin HILLS y GoPAL (1967), existen 6 especies vivientes y 25 fésiles. De las 6 especies cita- das a continuacién, las 4 primeras han sido incluidas en el subgénero Euazolla y las 2 uiltimas en el subgénero Rhizosperma. A, filiculoides Lam. se encuentra distribuida por toda América, Nue- va Zelanda, Hawaii y diversos paises europeos, donde ha sido introduci- da; A. filiculoides var. rubra (R. Br.) Strasb. es una variedad, y A. japo- nica Franch. et Sar. es similar a A. filiculoides. A. caroliniana Willd. es in- digena del este de los EE.UU., Indias Occidentales y México, pero ha sido introducida en Francia y en el este espafiol (BOLOS Y MASCLANS, 1957), en- contréndose también en charcas de la provincia de Salamanca. 4. mexicana Presl. se encuentra desde el norte de Sudamérica hasta Ja Columbia Briténica y, hacia el este, hasta Illinois. A. microphylla Kaulfuss ocupa desde el oeste y norte de Sudamérica hasta ¢} sur de Norteamérica ¢ Indias Occidentales. A. pinnata R. Br. se encuentra ampliamente distribuida en el Hemisferio Es- te, ha sido descrita en Africa Tropical, Madagascar, Australia, Nueva Cale- donia, Japén y Asia meridional. A. imbricata (Roxb.) Nakai y A. africana Desvaux son sinénimos de A. pinata y A. nilotica DeCaisne, que se encuen- tra en el valle del Nilo. La existencia de muchas especies fésiles indica que Azolla es un grupo antiguo con propiedades pioneras en el desarrollo de la vegetacién. De las es- pecies actuales hay registro fésil de A. filicwloides y A. pinata en depésitos pleistocénicos (HILLS and GOPAL, 1967). A. filicwloides parece haberse ex- tendido desde Europa, a través del norte de Asia, hasta Norteamérica duran- te el 2°Perfodo Interglacial, pero fue exterminada en nuestro continente du- 237rante la 3* Glaciacién. El registro fésil de especies diferentes a las actuales est confinado al Cenozoico. La reproduccién de Azoila puede ser de tipo vegetativo, a partir de una rama lateral que se separa def tallo principal, o sexual. El ciclo vital muestra alternancia de generaciones, con una generacién gametofitica muy reducida y otra esporofitica, que produce dos clases de esporas, macrosporas y micro: poras, ya que se trata de un helecho heterospéreo. El desarrollo del embrién se realiza completamente dentro del complejo de la mactospora, hasta que la primera hoja emerge al exterior, constituyéndose una joven planta, libre y flotante, En un desarrollo posterior comienzan formarse las raices, y el meristemo apical, situado en el centro de la hoja primordial, produce las pri- meras hojas bilobadas. Aftadiremos que los principales agentes de dispersion son, ademés de las corrientes de agua, las aves acuaticas y el hombre LA CIANOFICEA Anabaena azollae La cianoficea Anabaena azollae pertenece a la fam. Nostocdceas, pre- sentando una forma filamentosa de células vegetativas, algunas de las cuales se diferencian en heterocistos (fig. 3 y 4). Todo el filamento se encuentra ro- deado por una cdpsula o vaina mucilaginosa, mucho més fina a nivel de los heterocistos, recibiendo el nombre de tricoma la estructura viva que se halla dentro de la vaina. Se trata de un microorganismo fotoautétrofo, con un tipo de fotosinte- sis C, similar al de plantas superiores, aunque sin fendmenos de fotorrespi- racién, es decir, posee los dos fotosistemas, produce ATP por fotofosforila- cién ciclica y no ciclica, utiliza H,O como donador de electrones, genera NADPH como poder reductor para la fijacién de CO, y produce O,. Con- tiene clorofila a, carotenoides y ficobilinas, que se localizan en estructuras membranosas © tilacoides y permiten una captacién de la energia luminosa en aquellas zonas del especiro no utilizadas por las plantas verdes, lo que da a la cianoficea una ventaja competitiva, incluso en simbiosis, frente a otros organismos fotosintéticos. ‘Auin cuando no necesita una fuente de N combinado, requiere otros ele- mentos, como Fe, Mo, Co (STEWART, 1977), Ca y Na (WOLK, 1973). La reproduccién puede realizarse de dos modos: a) por akinetos 0 espo- ras, diferenciados a partir de céhulas vegetativas, y que constan de una gruesa pared, con pocos pigmentos fotosintéticos y con gran cantidad de cianofici- na, una proteina de reserva, y b) mediante hormogonios, pequeiios trozos de tricoma, méviles, que se separan del filamento materno y originan nuevas ca- denas algales. 238Fic. 3. Colonia de Anabaena azollae extraida de la cavidad foliar del helecho por macero- cin, (x 250). FiG.4. Detalle de filamentos jdvenes de Anabaena azollae mostrando células vegetativas (¥) y diferenciando heterocistos (H). ( 1500). 239Actividad nitrogendsica del alga, La dinitrogenasa (N,asa) es la enzima que cataliza la reduccién de N, a NH,, con formacion de H,, en los organis- mos fijadores de N,, inclufda Anabaena azollae. Dicho enzima es un dime- ro que consta de una Mo-Fe-proteina y una Fe-proteina, ambas necesarias para que haya actividad, as} como ATP, Mg?*, un reductor y ausencia de oxigeno. La fotosintesis constituye la fuente de ATP y poder reductor necesarios para la actividad N,asa. Si bien el fotosistema II es necesario para propot- cionar fotosintatos que generan poder reductor, la principal fuente de ATP no ¢s la fotofosforilacién no ciclica. En efecto, la actividad N,asa no se in- hibe en presencia de DCMU (3:(3,4-diclorofenil)-I¢1dimetilurea), inhibidor de Ia fijacién del CO, y de fa fotofosforilacién no ciclica, lo que indica que el poder reductor aportado por una actividad fotosintética anterior y el ATP generado en la fotofosforilacién ciclica son los motores de a actividad fija- dora de N, (PETERS, 1975), Por otra parte, Anabaena puede crecer hetero- tr6ficamente y la fosforilacién oxidativa puede aportar también la energia y el poder reductor necesarios (PETERS ef al. 1980). Cuando Ja N,asa no utiliza todos los electrones disponibles en la reduc~ cin del sustrato, desprende los sobrarites como H, én un proceso que és ATP-dependiente. Este H, no escapa a la atmésfera porque es reciclado me- diante una hidrogenasa (H,asa) que cataliza su combinacién con Q, con for- macién de ATP, y que quizé acttie también como fuente de electrones para la actividad N,asa (PETERSON and BURRIS, 1978), dando asi al sistema una mayor eficiencia fijadora de N,. Con respecto a esto, diversos autores han recalcado el potencial obvio que poseen las cianoficeas, y por tanto la asocia- cién Azolla-Anabaena, como candidatos para la produccién biosolar de H,. Asimilacion de NH, A fin de evitar una acumulacién que resultaria 16- xica, el NH, producido por reduccién de N, debe ser asimilado répidamen- te, lo que se consigue a través de una ruta metabélica en 1a que intervienen dos enzimas, la glutamina-sintetasa (GS) y la glutamato-sintasa 0 glutamina- oxoglutarato-aminotransferasa (GOGAT), segiin el proceso: tronseminacion otros wing lata sistema aneiaee fer court 240Heterocistos. En acrobiosis, s6lo las cianoficeas filamentosas que poseen heterocistos pueden fijar N,, por lo que la N,asa ha de estar continada en ellos, posiblemente debido a que la enzima no sdlo ha de ser protegida del ©, intracelular, producido en la fotosintesis, sino también del O, atmosféri- co, y esa proteccién, como veremos, tinicamente pueden proporcionarla los heterocistos. En efecto, existe una correlacién entre la presencia de heterocis- tos y la actividad fijadora, y la primera evidencia de ello es la obtenida por STEWART (1969), quien mostré que los heterocistos a los que se suministraba ATP y poder reductor exégenos eran capaces de reducir acetileno, sustrato que al igual que el N,, ¢s reducido por la N,asa. Al microscopio electrénico muestran una estructura simple, con una ma- sa sumamente retoreida de tilacoides y sin inclusiones subcelulares (STEWART, 4978). Son ligeramente mas anchos que las células vegetativas y poseen varias caracteristicas que proporcionan a la N,asa una gran proteccién frente al O,. Con este fin se encuentran rodeados por una gruesa cubierta de varias capas, exterior a la pared celular, que les confiere una resistencia quimica y mecani- ca y limita la difusion de gases como N,, CO, y O, (HASELKORN ef al., 1980). Esas capas son, de fuera adentro, de naturaleza fibrosa; homogénea, de com- posicién glicolipidica; y laminada, de composicién polisacaridica Asimismo, carecen del fotosistema 11, por lo que no fijan CO, ni pro- ducen O, (FOGG ¢7 al., 1973) y pierden la actividad ribulosa-difosfato-carbo- xildsica. No hay competencia, pues, por el ATP entre fijacién de CO, y fi- jacién de N,. Por otra parte, poseen niveles muy altos de glucosa-6-fosfato- deshidrogenasa y 6-fosfogluconato-deshidrogenasa, que proporcionan piridin- nuclestidos reducidos que donan electrones para la reduccién de N, a través de una ferredoxina (HASELKORN et al., 1980) Con respecto al metabolismo del N, difieren de las células vegetativas en que contienen N,asa, poseen niveles mas altos de GS y niveles mas bajos de GOGAT. Ademis, en ellos se encuentra una H,asa que puede reciclar el H, producido por la N,asa. Por ‘odo ello, la diferenciacién de heterocistos no es mas que la conver- sion de células vegetativas fijadoras de CO, y productoras de O, en fabricas anaerdbicas fijadoras de N,. Heterocistas y células vegetativas adyacentes es- t4n conectados por puentes citoplasmaticos con microplasmodesmos, por los que pueden circular pequeftas moléculas, de modo que en aerobiosis la fija- cin de N, por los heterocistos depende de Jos productos de fotosintesis que reciben de las células vegetativas, en tanto que éstas recogen de aquéllos pro- ductos de la fijacién del N, (WOLK, 1980). Los heterocistos se desarrollan a intervalos regulares del filamento de'la cia- noficea cuando crece en ausencia de N combinado, siendo un inhibidor fabrica- do en eilos, posiblemente glutamina o un metabolito derivado de ella (THOMAS et al., 1977), cl que, transportado a través de los microplasmodemos hasta las células vegetativas, impide la posterior diferenciacién de éstas en heterocistos. 241Interrelaciones metabélicas entre heterocistos y células vegetativas. En filamentos intactos de Anabaena, el flujo de N sigue la ruta siguiente (Fig 5): Del N, al NH,, por accién de la N,asa; del NH, a la amida de la gluta- mina, por accién de la GS; y de Ja glutamina al radical a-NH, del glutama- to, por accién de la GOGAT. Se ha postulado que Ja glutamina es el trans- portador de N fijado, desde heterocistos a células vegetativas, a la vez que su sintesis es altamente estimulada por el glutamato, el cual debe proceder de las células vegetativas, ya que Ja GOGAT esta presente casi exclusivamen- te en ellas (THOMAS et al., 1977). Los heterocistos de Anabaena poseen altas actividades de enzimas del ci- clo de las pentosas-fosfato y, por otro lado, la glucosa-6-fosfato puede servir como donador de electrones para ¢l O, y para los sustratos de la N,asa (PE- TERSON and BURRIS, 1978). Asi pues, un disacdrido, posiblemente maliosa, 2s fotosintetizado en las células vegetativas y transportado a los heterocistos, donde es metabolizado a glucosa-6-fosfate y oxidado en la ruta de las pentosas- fosfato. El NADPH formado de este modo puede reaccionar con el ©, para mantener condiciones reductoras y reducir la feredoxina. La ferredoxina do- nna entonces sus electrones a la N,asa, que reduce el N, a NH,, con la consi- guiente produccién de H,. El glutamato producido en las células vegetativas es utilizado ahora para producir glutamina en los heterocistos, y ésta es trans- portada hasta aquéllas, donde reacciona con ¢| 2-oxoglutarato formando dos moléculas de glutamato, una de las cuales es empleada en la produccién de otros aminoacidos por accién de transferasas. RELACIONES SIMBIOTICAS, La continuidad de la asociacién Azolla~Anabaena es mantenida durante la reproduccién sexual mediante la presencia de células algales en el macros- porocarpo del helecho, que poseen un tamafio mayor al de células vegetativas normales y que no son akinetos ni heterocistos. En macrosporocarpos jéve- nes, el alga es capaz de crecer y ocupa todo el espacio libre, donde se dispone formando filamentos, pero con él desarrollo de aquéllos es desplazada hacia el Apice del macrosporocarpo y se rompen los filamentos algales dejando cé- lulas aisladas 0 cortas cadenas de 2-3 células, que son incapaces de multipli- carse, lo que indica que se encuentran en perfodo de reposo. La infeccién tie- ne lugar cuando la primera hoja emerge al exterior, de modo que el alga que- da directamente asociada con el merisiemo apical, quedando asi asegurada la permanencia de la asociacién, incluso a pesar de la muerte periédica de Azolla (BECKING, 1978). La asociacién simbidtica es, al igual que en todas las asociaciones cia- noficea-eucariota, altamente especifica, de modo que solamente A. azollae 242Glu ~ otros eer! Luz + COg + H20 2-Oxoglutarato CELULA VEGETATIVA Disacaridd HETEROCISTO FIG. 5. Interrelaciones metabélicas entre heterocistos y células vegetativas en Anabaena azollae. G-6-P = glucosa-6-fosfato; CPP = ciclo de las pentosas-fosfato; PO ~ fosfori- lacién oxidativa; gin = glutamina; glu = glutamato; GS = glutamina-sintetasa; GOGAT = glutamato-sintasa; N,asa = nitrogenasa; H,asa = hidrogenasa; Fa = ferredoxina; PS I = fotosistema I. 243establece simbiosis con Azolla. El factor que puede determinar tal especifi- dad quizd lo constituyan las lectinas, glicoproteinas que actiian como puentes moleculares enlazando receptores especificos en las diferentes superficies ce- lulares; y asi, se ha demostrado que las paredes celulares de la capa que en- vuelve las cémaras foliares estan enriquecidas en fucosa, y se ha sugerido que ésta podria reconocer las lectinas de Anabaena (TEL-OR et al., 1984) Durante la maduracién de las hojas de] helecho, Ja divisién celular del endofito disminuye, al tiempo que se ensanchan sus células y se incrementa la diferenciacién en heterocistos (BECKING, 1978). La frecuencia de éstos en la simbiosis oscila alrededor del 25 %, existiendo un gradiente que va desde el 15 % en la 5* hoja a partir dei dpice de Azolla hasta el 33 % en la hoja n? 15, después de lo cual se mantiene constante (HILL, 1975). Los autores de este trabajo han observado que en cianoficeas libres, como Anabaena spp., la frecuencia de heterocistos es bastante menor. Por otra parte, en A. azollae se suceden una serie de cambios fisiolégi- cos y bioquimicos, observandose durante la simbiosis las siguientes particula. ridades: a) una capacidad reducida de fijacién fotosintética de CO, y pro- duccién de O,, quizés como proteccién para la N,asa (STEWART, 1978); y b) una actividad GS disminuida, por lo que la cianoficea fija mas N, del que puede utilizar y parte de él es liberado como NH, y asimilado por Azolla. Mas ain, cuando se aisla el microsimbionte, éste contimia fijando N,, pero libera mds de la mitad del N fijado, principalmente como NH, (PETERS, 1977). En la asociacién hay una rapida asimilacién de éste por el helecho, que puede que de algin modo dirija Ja sefial apropiada para inducir la liberacién de productos nitrogenados por Anabaena, No obstante, Azolla puede tam- bién liberar NH, al medio y asf, A. mexicana pierde del 10 al 30 % del total del N fijado, lo cual es muy importante desde un punto de vista agronémico, pues de otro modo, ese nitrégeno sélo podria ser utilizado por los cultivos que crecen junto al helecho a la muerte de éste (TALLEY and RAINS, 1980). Esta liberacién de NH, sugiere un trastorno en la regulacién de la N,asa, po- siblemente causado por las condiciones ambientales. Cuando el alga se encuentra en el dpice de Azolla puede ser cultivada con facilidad, pero una vez que es aprisionada en Ja cavidad foliar pierde esa ca- pacidad de crecimiento en estado libre en medios habitualmente utilizados para el aislamiento de cianoficeas (BECKING, 1978). Por otra parte, la actividad fijadora de N, varia en las diferentes hojas del helecho, segtin sean mds 0 menos maduras. Seguin el mismo autor, la fija~ cién de N, en el eje principal de A. pinata alcanza un maximo en las hojas 73-8° a partir del 4pice, para sufrir un brusco descenso, con un nivel muy bajo en ia hoja 10? e incrementarse entonces hasta manifestar otro maximo en la hoja 133, a partir de Ja cual decrece paulatinamente. Este desigual gra- diente parece ser una caracteristica tipica de Azolla y se produce también en las ramas laterales. El mismo seftala la posibilidad de que en hojas alejadas 244del pice, el nimero de heterocistos inactivos aumente, lo que explicarfa la disminucidn en la fijacién de N, atin cuando la frecuencia de esas células sea mayor. De hecho, la cianoficea de hojas maduras muestra cambios morfolé- gicos y de composicién de los pigmentos en sus células. Intercambio metabélico entre hospedador y microsimbionte. Como he- mos visto, tanto la cianoficea como el helecho tienen capacidad para metabo- lizar NH,. Las diferencias de atinidad de las enzimas asimiladoras de NH, por este sustrato y su distribucién entre hospedador y endofito, pueden pro- porcionar un mecanismo regulador de la alimentacién reciproca de la asocia~ cién (PETERS et al., 1980). Asf, la actividad GS es alta en la asociacién y ba- ja en el microsimbionte aislado, lo que podria indicar que procede del hele- cho, ya que por otra parte, en estudios comparativos, ¢ alga libre A. cylin- drica manifiesta una actividad GS 50 veces superior a A. azollae aislada de Azolla (PETERS, 1977). Como los heterocistos carecen del fotosistema II y su frecuencia en el microsimbionte alcanza ms del 30 % en cavidades foliares maduras, puede cuestionarse si el alga fija la cantidad de CO, suficiente para mantener la ele- vada actividad N,asa. Al respecto, estudios sobre inhibidores indican que Azolla puede proporcionar compuestos carbonados a la cianoficea (PETERS, 1976), Sin embargo, no se excluye la posibilidad de que el microsimbionte fun- ciona mixotréficamente en la cavidad foliar, es decir, que sea capaz de fijar CO,, fotoasimilar sustratos orgdnicos aportados por el hospedador y reali- zar una asimilacién oxidativa; ni la posibilidad de que un intermediario del metabolismo del helecho sea transportado a Ja cavidad, descarboxilado y el CO, refijado por Anabaena, Dado que las cavidades foliares no estén directamente conectadas con el sistema vascular del helecho, el intercambio de metabolitos entre hospeda- dor y microsimbionte ha de hacerse a través de la epidermis de la cavidad y/o de los pelos pluricelulares que de ella parten. Estos pelos poseen numerosos organulos citoplasmaticos, pliegues en Ja pared celular y una ultraestructura celular con funcién de secrecién activa y transferencia (BECKING, 1974), v pue- den entonces intervenir en un proceso de traslocacién de compuestos fotosin- tetizados por el helecho y de compuestos de N fijado por Anabaena. A este respecto, se ha descubierto en A. azollae la presencia de unas lectinas que po- siblemente sean el disparador del intercambio metabélico entre los dos orga- nismos (TEL-OR et al., 1984). Crecimiento heterotréfico de Anabaena azollae. Atin cuando el desarto- Ilo heterotréfico de A. azollae en las cavidades foliares es un tema discutido, lo cierto es que la cianoffcea puede crecer heterotréficamente en un medio con un 0,5 % de fructosa (BECKING, 1974). Sin embargo, aunque se mantic ne la capacidad de fijar N,, la sacarosa, glucosa, citrato, malate, piruvato, 245succinato y acetato no proporcionan actividad N,asa. La fructosa es, pues, preferida a otros fotosintatos como regla general en A. azollae, ¢ induce una serie de cambios estracturales cuando se halla presente, tales como mayor ta- mafio celular, superficie celular rugosa, aumento del numero de granulos de cianoficina y glucégeno como productos de reserva en células vegetativas, a la vez que se facilita la respiracién y se incrementa la relacién C/N, lo que sugiere un aumento en la diferenciacién de heterocistos. Asimismo, ademas de la fructosa, glucosa y sacarosa aumentan la actividad respiratoria dos ve- ces respecto al control, y apenas se influyen en la fotosintesis, lo que consti- tuye una prueba indirecta de que en simbiosis esos azticares son tomados por Anabaena del helecho, que los produce en grandes cantidades, para facilitar Ja respiracion (TEL-OR ef al., 1984). Las modificaciones anteriormente sena- ladas estin relacionadas con el mantenimiento de la actividad N,asa, que conduce a un aumento de los productos de reserva. ASPECTOS ECOLOGICOS DE LA ASOCIACIGN SIMBIOTICA Azolla-Anabaena EJ sistema simbiético tiene gran importancia en aguas deficientes en N, que no pueden mantener el crecimiento de plantas acudticas no fijadoras, ya que es capaz de utilizar la energia solar para la produccién primaria y el mi. crosimbionte puede cubrir Jas necesidades de N de la asociacién. Entre los ptincipales factores que condicionan la distribucién del sistema Azolla- Anabaena se encuentran la temperatura, la luz, la concentracién de sales, el pH y la presencia de ciertos nutrientes. La simbiosis puede crecer en un amplio margen de temperaturas, de 5 a 45°C, con un éptimo general a 28°C. Aunque es considerado como tropical © subtropical, las altas temperaturas son nocivas para el crecimiento de A pinata, y asi, por encima de los 40°C, la actividad fijadora de N, disminu- ye. Algunas azollas, como A. pinnata y A. filiculoides son resistentes a las heladas, si bien la congelacién de la superficie del agua produce su muerte (Moors, 1969). La temperatura es el factor limitante primario para A. fili- culoides y A. mexicana en California. El crecimiento y Ja fijacién de N, en A, filiculoides son casi nulos a 10°C, incrementaéndose exponencialmente hasta os 25°C, pero por encima de los 30°C decrecen rapidamente y las exposicio- ‘nes prolongadas a 40°C son letales (TALLEY and RAINS, 1980). La luz afecta en mucho menor grado que la temperatura. En A. filiculai- des el maximo crecimiento se da a una intensidad luminica mener de la mitad de la que existe a pleno sol (TALLEY and RAINS, 1980). La actividad fijadora de N, en la oscuridad representa un 25-30 % de la existente bajo la luz en A. pinata y similar en A. caroliniana y A. filiculoides (BECKING, 1974). Esa reduccién del 70-75 M% se debe a la restriccién en el aporte de azticares cuando 246hay ausencia de fotosintesis, y la actividad remanente se realiza a expensas de los fotosintatos de reserva suministrados por el helecho. Por otra parte, la intensidad de luz necesaria para llegar a la saturacién en la reduccién de N, por el microsimbionte libre es aproximadamente la mitad de la requerida en simbiosis (PETERS, 1977), presumiblemente dedido al efecto producido por los pigmentos del hospedador Las sales representan un factor que puede condicionar en gran medida Ja presencia de la asociacién, ya que altas concentraciones salinas pueden matar a A. pinnata en tres semanas. En términos generales, el sistema simbidtico puede desarrollarse dentro de un intervalo de pH de 4-10 (Moore, 1969), pero el maximo crecimiento iene lugar a pH bajo (5) con poca luz 0 a pH de 9-10 con luz intensa (ASHTON and WALMSLEY, 1976) El crecimiento de Azolla es dependiente de los macronutrientes P, K, Ca, Mg y Fe, y ademas necesita Mo y Co cuando crece en medios deficientes en N combinado. De estos elementos, Ca y Fe pueden estar relacionados con la fijacion de N,, mientras que el Co parece estar asociado con ef crecimiento de la cianoficea (IOHNSON ef al, 1966). SIGNIFICACION AGRONOMICA DE LA ASOCIACION El modo de crecimiento de Azolla es tan rapido que permite una alta den- sidad de plantas, lo que puede plantear algunos problemas ecolégicos, pues la gruesa capa de vegetacidn que crea puede destruir Jas plantas ya existentes (ASHTON and WALMSLEY, 1976), pero es también un indice aproximativo de la fijacién de N,. Tales problemas han hecho que la asociacién haya sido considerada a menudo como una mala hierba, tal como ha ocurrido en los arrozales de Filipinas, Hawaii o Japén, y también ha sido descrita como tal por SANCHEZ RODRIGUEZ (1984) en Salamanca. Abundando en este aspec- to, hay que distinguir entre variedades silvestres y cultivadas, de las cuales las silvestres son mas resistentes al calor, por lo que padrian competir con jos cultivos de arroz durante el periodo de crecimiento de éste. En Indochina se recolecta Azolla para alimentacién animal y en Vietnam ¢s utilizado como alimento de reses, aves de corral y peces. Por la gran canti- dad de nutrientes inorganicos y orgénicos que contiene, Azolla puede consti- tuir un forraje de buena calidad (MooRE, 1969). Uso como biofertilizante. A pesar de los ocasionales trastornos que puede ocasionar en determinados ecosistemas, el empleo de esta asociacion simbidtica como fertilizante en el Lejano Oriente data de muchas décadas (Moore, 1969) y, segiin la tradicién, su utilizacién fue iniciada por un cam- 247pesino llamada Ba Heng, que recomendaba afiadir 15-20 kg de Azolla por hectdrea de arrozal, siendo los resultados tan buenos que a la muerte de Ba Heng se construyé una pagoda a la «diosa de Azolla». El uso como biofertili- zante en el cultivo de arroz ha sido, hasta hoy, la aplicacién de mayor signifi- cacién del sistema simbidtico, y puede llevarse a cabo adoptando una de las dos técnicas siguientes: cultivarla para incorporarla como abono verde al suelo antes de plantar el artoz, 0 crecer Azolla junto al arroz en forma de sistema de doble cultivo («dual cropping system»), El esquema para producir sufi- ciente Azolla para inocular una hectarea de arrozal es ¢l que figura a conti- nuacién y se debe a Liu, de la Academia de Ciencias Sinica, en comunicacién personal a uno de los autores (C.R.B.). 4 Kg inéculo + 36 g superfosfato inocular una superficie de 4m x 3m e incubar una semana 12 kg Azolla + 90 g superfosfato, inocular una superficie de 5m x 6m e incubar una semana 36 ke Azolla + 300 g superfosfato, inocula; una superficie de 10m x 10m ¢ incubar una semana 110 kg Azolla + 900 g superfosfato, inocular una superficie de 20m x 15m. ¢ incubar una semana 330 kg Azolla + 3000 g superfosfato, inocular una superficie de 45m x 20m incubar una semana de aqui se pueden recuperar 1000 kg de Azolla, que es suficiente para ino- cular alrededor de media hectérea Los aumentos obtenidos en la produccién de arroz por efecto de a ino- culacién de Azolla son importantes. Algunos de ellos quedan reflejados en la Tabla 1. Segtin L1u (1981), con la sola adicién de una Tm de Azolla, sin ningiin otro fertilizante nitrogenado, se puede obtener un incremento de en- tre 80 y 100 kg de arroz, lo que indica que se puede hacer frente a las necesi- dades nitrogenadas de 10 Tm de arroz con el cultivo simultaneo det helecho en la misma parcela. Asi pues, la produccién biolégica de N fijado por la asociacién, que cons- tituye alrededor del 5 % del peso seco, y que puede doblar su biomasa en 3 6 dfas (PETERS, 1977), la convierten en una atractiva alternativa a los ferti- 248TaBLa 1 EFECTO DE Azolla SOBRE EL RENDIMIENTO DE GRANO ¥ PAJA DE ARROZ (SINGH, 1977) Rendimiento en kg/ha Tratamiento Grano Paja Control 3489 asm | Azolla (10 Tm peso fresco por ha) | 5125 3786 ‘Aumento en % a7 47 lizantes comerciales, De hecho, su cultivo se ha extendido a zonas subtropica- les y templadas, y segtin los informes de la FAO de 1977 se crecia ese aitio en mas de 1.300.000 ha de arrozales del Sudeste Asidtico. La potencialidad del uso de la asociacién Azolla-Anabaena en zonas templadas queda demos- trada mediante Jos trabajos recientes de TALLEY and RAINS (1980) en Cali- fornia (Tabla 2). Los mismos autores indican que la muerte de Azolla es nor- TABLA 2 EFECTO DE Azolla EN EL CONTENIDO APROXIMADO DE NIUROGENO DEL CULTIVO DE ARROZ, EXPRESADO EN KG N/HA PRESENTES EN GRANO Y PAJA RESPECTIVAMENTE (TALLEY and RAINS, 1980) kg N/ha Tratamiento - Grano Paja Control sin fertilizantes 25 10 Cultivo subyacente de A. mexicana 60 18 Abonado mediante la adicién de A. filicutoides (40 kg N/a) 40 15 Fertilizando con 40 kg N/ha de sul- fato aménico 33 13 Fertilizando con 80 kg N/ha de sul- fato aménico 7 7 malmente necesaria para que todo su N sea utilizable por el arroz. En efecto, en un suelo anegado, la mineralizacién del 75 % de Azolla requiere unas 7 semanas, siendo més répida en A. mexicana debido a la gran cantidad de N combinado que libera al medio durante su crecimiento. En Vietnam, la muer- te es provocada por la elevacién de la temperatura, aproximadamente un mes antes de la cosecha del arroz, pero en otras Areas no ocurre asi, y ha de ser provocado mediante productos quimicos (STEWART, 1977). 249Otros posibles beneficios de la asociacion son como aporte de materia orgdnica y control de malas hierbas. De todos modos, el hecho de que hasta ahora la utilizacién se limite preferentemente al Sudeste Asidtico, sugiere que existen problemas de manejo. Asi, la existencia de grandes cantidades de Azolla en la época de siembra del arroz puede dar como resultado la desaparicién de las plantas jévenes de éste. En esas circunstancias, la asociaciéa sdlo pue- de tener un papel fertilizante en campos no sembrados 0 como abono verde La asociacion puede ser uti] también como fuente de N, en forma de abo- nado en verde, para otros cultivos diferentes al arroz, tales como trigo, ceba- da, maiz y batata, asi como para alimentacién animal. En estudios prelimi- nares, los presentes autores han obtenido incrementos del 20 al 40 % en el peso seco de plantas de trigo a los 20 dias de la germinacién en macetas abo- nadas a razén de 3 Tm de peso fresco de helecho por hectarea A fin de obtener él mayor beneficio de la asociacién, seria muy conve- niente la seleccién de cultivares de Azolla. Asimismo, seria importante conse- guir una mayor tolerancia a las temperaturas extremas, una fotorrespiracién disminuida en el helecho y ausencia de la inhibicién de la fotosintesis por O,, un incremento en la capacidad fijadora de N, y la liberacién de N combina do al medio durante el crecimiento. Por otra parte, la tolerancia de la asocia~ cién a las sales, una mayor facilidad en la produccién, manejo y transporte, una mayor resistencia a las enfermedades y plagas, y conseguir el maximo cre- cimiento y fijacién de N, a pleno sol, son otros tantas factores que conviene potenciar. AGRADECIMIENTOS. Los autores F. S. y P. S. agradecen a la Caja de Ahorros y M. P. de Salamanca la ayuda econémica necesaria para la realizacién de este trabajo. BIBLIOGRAFIA ASHTON, P. J. and WALMSLEY, R. D. (1976). The aquatic fern Azolla and its Anabaena symbiont. Endeavour 35, 39-43 BECKING, J. H. (1974). Contribution on plant-algal associations. pp. $56-580. Jn’ «Proc. st Int, Symp. on Nitrogen Fixation». Eds. W. E. Newton and C. J. Nyman. Wash Sta, Univ. Press. BrckING, J. H. (1978). Ecology and physiological adaptations of Anabaena in the Azolla- Anabaena symbiosis. pp. 266-281. Jn: «Environmental role of nitrogen-fixing blue- green algae and asymbiotic bacteriay. Ed. U. Granhall, 391 pp. Ecol. Bull. (Stock holm) 26. 250Bios, O. de MASCLANS, F. (1987). La vegetacién de los campos de artoz en la Regién Mediterranea. Collectanea Bot. 4, 415-434. HOGG, G. E., StEWaRT.W.D. P., Fay, P. and Watsay, A. B. (1973). The blue-green algae. Academic Press, N. 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