UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS

ESPE

Departamento de Ciencias de la Vida

Carrera de Ingeniería en Biotecnología
Diseño de Procesos

Integrantes: Anaguano Alexis NRC: 3009

Castro Joselyn Fecha: 17-02-2021
Guerrón Sergio
Jarrín Nicole
Ramos Evelyn
Utreras Camila

Tema: IN VITRO FOLDING OF INCLUSION BODIES

1. Importancia de las técnicas de DNA recombinantes para proteínas heterólogas.

Resultados negativos y causa de la no obtención de proteína soluble.

En el año en que aparecieron las técnicas de DNA recombinante la utilización de proteínas

recombinantes en diferentes áreas por ejemplo de aplicar en productos terapéuticos, como
vacunas y como herramientas en ensayos de diagnóstico está siendo cada vez más extendida, así
mismo también en una producción industrial. Lo que posiciona como importantes a este tipo de
técnicas, es la eficacia de obtenerlas sin las limitaciones que presentan otras técnicas
convencionales.

Un ejemplo de los resultados es la expresión de insulina en microorganismos transformados que

no presentó una conformación nativa, soluble y biológicamente activa, sin embargo en estudios
posteriores en E. coli se observó que la formación de los cuerpos de inclusión es la regla y no la
excepción.En experimentos se ha intentado generar la solubilidad en proteínas recombinantes
aplicando una co-expresión de chaperonas, ya que estas proteínas ayudan al plegamiento
previniendo reacciones secundarias improductivas como la agregación.

Se plantearon dos respuestas al porqué de los resultados negativos:

● El plegamiento oxidativo de las proteínas unidas por enlaces disulfuro puede verse
gravemente comprometido en el citosol reductor, lo que hace que la agregación sea
inevitable incluso con la ayuda de un chaperón óptimo.
● Los diferentes miembros de la familia acompañante ayudan a plegarse de manera
concertada y como no está claro qué miembro de la familia de las chaperonas constituye
el cuello de botella para el replegamiento de una proteína sobreexpresada dada, la co-
expresión de chaperonas individuales puede no ser suficiente para reducir la formación
de agregados.

Sin embargo, a pesar del porcentaje alto en casos negativos, un efecto positivo se dió en la co-
expresión de chaperonas moleculares u otros potenciadores del plegamiento tales como tiol-
disulfuro isomerasas o peptidil-prolil-isomerasas.
 2. Formación de cuerpos de inclusión.

Hasta el momento no se ha podido obtener una relación entre la probabilidad de formación de

cuerpos de inclusión con las propiedades particulares de la proteína recombinante, su sistema de
expresión, la célula huésped o las características de la proteína (tamaño de los polipéptidos
expresados, el uso de construcciones de fusión, la estructura de la subunidad o la hidrofobicidad
relativa de la proteína recombinante).

Para inducir la formación de agregados inactivos, es suficiente contar con el aumento de la

concentración de la cadena polipeptídica naciente, en base a esta afirmación se ha propuesto un
modelo cinético que muestra que el rendimiento de la proteína nativa depende únicamente de la
tasa de plegado, la tasa de agregación y la tasa de síntesis de proteínas, también se observa que,
mientras el rendimiento de la proteína nativa aumenta la formación de cuerpos de inclusión y la
tasa de expresión de la proteína disminuyen. Todas estas hipótesis se sustentan en experimentos
en los cuales la fermentación de las células transformadas en condiciones de crecimiento
reducidas y una inducción limitada también dan lugar a un mayor rendimiento de proteína nativa
y soluble.

El aumento de la formación de cuerpos de inclusión podría estar relacionado con un plegamiento

muy lento de una proteína. Se puede esperar un plegamiento lento en la expresión citosólica
(formación lenta de enlaces disulfuro en el entorno reductor del citosol) de proteínas heterólogas
que contienen enlaces disulfuro en su estado nativo. Para demostrar el plegamiento oxidativo en
la expresión citosólica de proteínas con enlaces disulfuro, se han desarrollado cepas mutantes de
E. coli que se caracterizan por una actividad reducida de la tiorredoxina reductasa (enzima que
reduce a la tiorredoxina, la cual actúa como antioxidante).

Para dar lugar al plegamiento correcto mediante la formación de enlaces disulfuro, se ha

estudiado la producción periplásmica de proteínas con enlaces disulfuro. El espacio periplásmico
de E. coli proporciona un entorno oxidante en el cual se puede dar la formación de enlaces
disulfuro en las proteínas y contiene además a las isomerasas tiol-disulfuro (participan en la
formación de enlaces disulfuro en proteínas de ubicadas en el periplasma de E. coli). Las
proteínas de E. coli contienen pocos enlaces disulfuro, por lo tanto, las isomerasas de E. coli no
son eficientes para catalizar la formación de enlaces disulfuro en proteínas eucariotas con muchos
enlaces disulfuro. En consecuencia, la formación de cuerpos de inclusión también se observa con
frecuencia en la producción periplásmica de proteínas heterólogas.

3. Aislamiento de cuerpos de inclusión.

Los cuerpos de inclusión son obtenidos por sobreexpresión microbiana citosólica de una proteína
recombinante, pueden abarcar todo el diámetro de una célula de E. coli, debido a su carácter
refráctil los cuerpos de inclusión pueden ser observado directamente en la célula huésped viva
mediante microscopía. Se pueden recolectar después de la lisis celular por centrifugación y se
debe prevenir la sedimentación de restos celulares, esto se puede lograr mediante la combinación
de tratamiento con lisozima, seguido de dispersión a alta presión y finalmente por altas
concentraciones de sal y detergente. La homogeneidad de los aislados de cuerpos de inclusión
también se puede mejorar mediante la extracción con detergentes o con concentraciones molares
de caotrópicos y durante la extracción con urea o clorhidrato de guanidina, se debe tener cuidado
de que los cuerpos de inclusión no se desintegran durante este paso de extracción. Sin embargo,
en ciertos procesos industriales las proteínas del cuerpo de inclusión se extraen directamente del
caldo de fermentación de E. coli añadiendo un reductor y un caotropo. Siempre que el nivel
inicial de expresión sea lo suficientemente alto, la recolección de los cuerpos de inclusión por
separación de líquidos sólidos suele dar lugar a una preparación bastante homogénea, se sabe que
las proteínas de la célula huésped, como el factor de elongación EF-Tu, las proteínas de la
membrana externa o las pequeñas proteínas de choque térmico pueden enriquecerse en los
cuerpos de inclusión aislados

Los cuerpos de inclusión tienen la ventaja de contar con un alto enriquecimiento de la proteína
deseada en la etapa temprana de purificación, además su formación protege el recombinante
proteico contra la proteólisis por proteasas intracelulares. Pueden ser el mejor método para la
producción de proteínas recombinantes que, si están activas son letales para las células huésped.

4. Solubilización y purificación de cuerpos de inclusión. Eliminación de agentes

desnaturalizantes.

Solubilización de cuerpos de inclusión

La solubilización de cuerpos de inclusión requiere desnaturalizantes fuertes tales como 6M

GdmCl o urea 6-8M. GdmCl es más preferible que la urea para el tratamiento de cuerpos de
inclusión.

Razones de preferencia de GdmCl en lugar de urea.

● GdmCl es un caotrofo bastante fuerte que puede permitir la solubilización de cuerpos de

inclusión que son resistentes a la solubilización por la urea.
● Las soluciones de urea pueden contener isocianato que conduce a la carbamilación de los
grupos amino libres del polipéptido, especialmente tras la incubación a largo plazo en
valores de pH alcalino.

Como alternativa a la solubilización de los cuerpos de inclusión mediante GdmCl o urea, se ha

propuesto el uso del surfactante catiónico cloruro de cetiltrimetilamonio (CTAC).

En el caso de las proteínas que contienen cisteína, los cuerpos de inclusión aislados suelen
contener una cierta cantidad de enlaces disulfuro que reducen la solubilidad de los cuerpos de
inclusión en ausencia de agentes reductores como el ditiotreitol, el ditioeritol, el glutatión, el
cistema, la cistamina o el 2-mercaptoetanol. La adición de estos reactivos tiólicos de bajo peso
molecular en combinación con los caotrofos permite la reducción de los enlaces disulfuro entre
cadenas por intercambio tiol-disulfuro.

La reducción del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) en el espacio periplásmico

de E. coli da lugar a la formación de proteínas tanto nativas como agregadas en este caso, la
recuperación eficiente de la proteína en forma desnaturalizada se logró mediante la solubilización
in situ de la proteína a partir del caldo de fermentación completo mediante la adición de urea y
reductor.
Purificación de la proteína de cuerpo de inclusión solubilizada

Las proteínas pueden ser renaturalizadas directamente después de la solubilización sin necesidad
de una purificación adicional de la proteína solubilizada y desnaturalizada. Dado que los procesos
de plegado de las proteínas no se ven fuertemente afectados por el plegado de otras proteínas en
el mismo entorno de renaturalización, la purificación rigurosa de la proteína del cuerpo de
inclusión puede no ser un requisito previo para un replegado eficiente.

La purificación podría lograrse mediante RP-HPLC, filtración en gel o cromatografía de

intercambio iónico en presencia de un desnaturalizante. Sin embargo, si la proteína del cuerpo
de inclusión es una construcción de fusión His-tag, la purificación de la proteína solubilizada
puede realizarse mediante cromatografía de afinidad de metales inmovilizados en presencia de
una alta concentración de desnaturalizante

Eliminación de agentes desnaturalizantes

El repliegue de las proteínas del cuerpo de inclusión solubilizadas suele realizarse por dilución
o diálisis. Tras la eliminación del desnaturalizante por diálisis, la proteína queda expuesta a una
concentración intermedia de desnaturalizante durante un largo periodo de tiempo. Dependiendo
de la proteína respectiva, esto puede ser tanto beneficioso como perjudicial para el correcto
plegamiento sin ninguna predicción previa.

● En el caso de ciertas proteínas, los intermedios de plegado se pueblan en concentraciones

intermedias de desnaturalizante, que son muy susceptibles. En este caso, la eliminación
del desnaturalizante por diálisis puede inducir una precipitación cuantitativa en la fase de
los intermedios de plegado. Por lo tanto, la renaturalización debe realizarse mediante una
dilución rápida de la proteína desnaturalizada en el tampón de replegado.
● En otros casos, la precipitación sólo se observa al replegar en condiciones de disolvente
fuertemente nativo. En este caso, la eliminación gradual del desnaturalizante mediante
diálisis puede ser superior al refolding por dilución.

5. Agregación vs reconfiguración.

Tras el plegado in vitro, tanto el plegamiento incorrecto como la agregación compiten con la vía
de plegado correcta (Figura. 1). Los procesos de agregación improductivos pueden originarse
tanto de interacciones inespecíficas (hidrófobas) de cadenas polipeptídicas predominantemente
desplegadas como de interacciones incorrectas de intermedios de plegamiento parcialmente
estructurados. Estas reacciones de agregación son procesos de segundo orden (o superior),
mientras que el plegamiento correcto generalmente se determina mediante reacciones de primer
orden.
 Figura 1. Plegamiento y agregación durante la renaturalización de proteínas. Reacciones de plegamiento
correctas que conducen al estado nativo [(1), (2)]. Reacciones de agregación irreversibles, partiendo de
diferentes conformaciones durante el proceso de renaturalización [(3), (4)].

Al aumentar la concentración de cadenas polipeptídicas desplegadas se observa un aumento de

la tasa de agregación improductiva y consecuentemente, la agregación predomina sobre la
renaturalización produciendo una disminución del rendimiento de renaturalización por encima
de una concentración límite de aproximadamente 10-50 µg/ml. Por ende, la renaturalización de
estas proteínas requeriría volúmenes de reacción excesivos, es decir, se pueden obtener altas
concentraciones de proteína correctamente plegada mediante la adición sucesiva de proteína
desnaturalizada a la solución de renaturalización.

También tenemos el caso de las proteínas más complejas, donde el plegamiento correcto in vitro
compite con el mal plegamiento o la agregación. Estos procesos improductivos pueden
predominar en condiciones de plegado convencionales. En donde, se ha intentado producir
proteínas recombinantes en forma soluble mediante la coexpresión de una clase de proteínas
huésped denominadas chaperonas, ya que estas proteínas ayudan al plegamiento evitando
reacciones secundarias improductivas como la agregación.

6. Estrategias para el foldeo. Chaperonas, aditivos de bajo peso molecular.

Una estrategia para recuperar la formación de los enlaces disulfuro de las proteínas es por medio
de reacciones de intercambio con tioles de bajo peso molecular en forma reducida y oxidada. Se
pueden usar aditivos como el glutatión reducido y oxidado (GSH, GSSG), otros tioles de bajo
peso molecular tales como cisteína / cistina, cisteamina / cistamina o dihidroxietil disulfuro / 2-
mercaptoetanol pueden ser superiores para la formación de enlaces disulfuro dependiendo de la
proteína del cuerpo de inclusión a una concentración reducida de 1-3 mM y aproximadamente
una quinta parte a una décima parte de esa concentración de la forma oxidada respectiva.
Otra estrategia para el plegamiento in vitro de proteínas son los detergentes no iónicos, así como
iónicos y bipolares los cuales tienen un efecto favorable sobre la renaturalización. Por ejemplo,
se puede emplear el reactivo lauril-maltósido o también se pueden añadir chaperonas al tampón
de replegamiento o mezclas compuestas de detergentes (por ejemplo, Triton X-100 o lauril-
maltósido) y fosfolípidos. Con estos se logra un plegamiento eficaz siendo que estas micelas
mixtas contienen restos polares y apolares que pueden interactuar con varios sitios en los
intermedios de plegado, evitando así el plegamiento incorrecto o la agregación.

Bibliografía

Rudolph, R. (1996, enero). In vitro folding of inclusion body proteins. PubMed.

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8566547/#:%7E:text=These%20inclusion%20bodies%
2C%20which%20contain,using%20in%20vitro%20folding%20techniques.

Firmas