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● El plegamiento oxidativo de las proteínas unidas por enlaces disulfuro puede verse
gravemente comprometido en el citosol reductor, lo que hace que la agregación sea
inevitable incluso con la ayuda de un chaperón óptimo.
● Los diferentes miembros de la familia acompañante ayudan a plegarse de manera
concertada y como no está claro qué miembro de la familia de las chaperonas constituye
el cuello de botella para el replegamiento de una proteína sobreexpresada dada, la co-
expresión de chaperonas individuales puede no ser suficiente para reducir la formación
de agregados.
Sin embargo, a pesar del porcentaje alto en casos negativos, un efecto positivo se dió en la co-
expresión de chaperonas moleculares u otros potenciadores del plegamiento tales como tiol-
disulfuro isomerasas o peptidil-prolil-isomerasas.
2. Formación de cuerpos de inclusión.
Los cuerpos de inclusión son obtenidos por sobreexpresión microbiana citosólica de una proteína
recombinante, pueden abarcar todo el diámetro de una célula de E. coli, debido a su carácter
refráctil los cuerpos de inclusión pueden ser observado directamente en la célula huésped viva
mediante microscopía. Se pueden recolectar después de la lisis celular por centrifugación y se
debe prevenir la sedimentación de restos celulares, esto se puede lograr mediante la combinación
de tratamiento con lisozima, seguido de dispersión a alta presión y finalmente por altas
concentraciones de sal y detergente. La homogeneidad de los aislados de cuerpos de inclusión
también se puede mejorar mediante la extracción con detergentes o con concentraciones molares
de caotrópicos y durante la extracción con urea o clorhidrato de guanidina, se debe tener cuidado
de que los cuerpos de inclusión no se desintegran durante este paso de extracción. Sin embargo,
en ciertos procesos industriales las proteínas del cuerpo de inclusión se extraen directamente del
caldo de fermentación de E. coli añadiendo un reductor y un caotropo. Siempre que el nivel
inicial de expresión sea lo suficientemente alto, la recolección de los cuerpos de inclusión por
separación de líquidos sólidos suele dar lugar a una preparación bastante homogénea, se sabe que
las proteínas de la célula huésped, como el factor de elongación EF-Tu, las proteínas de la
membrana externa o las pequeñas proteínas de choque térmico pueden enriquecerse en los
cuerpos de inclusión aislados
Los cuerpos de inclusión tienen la ventaja de contar con un alto enriquecimiento de la proteína
deseada en la etapa temprana de purificación, además su formación protege el recombinante
proteico contra la proteólisis por proteasas intracelulares. Pueden ser el mejor método para la
producción de proteínas recombinantes que, si están activas son letales para las células huésped.
En el caso de las proteínas que contienen cisteína, los cuerpos de inclusión aislados suelen
contener una cierta cantidad de enlaces disulfuro que reducen la solubilidad de los cuerpos de
inclusión en ausencia de agentes reductores como el ditiotreitol, el ditioeritol, el glutatión, el
cistema, la cistamina o el 2-mercaptoetanol. La adición de estos reactivos tiólicos de bajo peso
molecular en combinación con los caotrofos permite la reducción de los enlaces disulfuro entre
cadenas por intercambio tiol-disulfuro.
Las proteínas pueden ser renaturalizadas directamente después de la solubilización sin necesidad
de una purificación adicional de la proteína solubilizada y desnaturalizada. Dado que los procesos
de plegado de las proteínas no se ven fuertemente afectados por el plegado de otras proteínas en
el mismo entorno de renaturalización, la purificación rigurosa de la proteína del cuerpo de
inclusión puede no ser un requisito previo para un replegado eficiente.
El repliegue de las proteínas del cuerpo de inclusión solubilizadas suele realizarse por dilución
o diálisis. Tras la eliminación del desnaturalizante por diálisis, la proteína queda expuesta a una
concentración intermedia de desnaturalizante durante un largo periodo de tiempo. Dependiendo
de la proteína respectiva, esto puede ser tanto beneficioso como perjudicial para el correcto
plegamiento sin ninguna predicción previa.
5. Agregación vs reconfiguración.
Tras el plegado in vitro, tanto el plegamiento incorrecto como la agregación compiten con la vía
de plegado correcta (Figura. 1). Los procesos de agregación improductivos pueden originarse
tanto de interacciones inespecíficas (hidrófobas) de cadenas polipeptídicas predominantemente
desplegadas como de interacciones incorrectas de intermedios de plegamiento parcialmente
estructurados. Estas reacciones de agregación son procesos de segundo orden (o superior),
mientras que el plegamiento correcto generalmente se determina mediante reacciones de primer
orden.
Figura 1. Plegamiento y agregación durante la renaturalización de proteínas. Reacciones de plegamiento
correctas que conducen al estado nativo [(1), (2)]. Reacciones de agregación irreversibles, partiendo de
diferentes conformaciones durante el proceso de renaturalización [(3), (4)].
También tenemos el caso de las proteínas más complejas, donde el plegamiento correcto in vitro
compite con el mal plegamiento o la agregación. Estos procesos improductivos pueden
predominar en condiciones de plegado convencionales. En donde, se ha intentado producir
proteínas recombinantes en forma soluble mediante la coexpresión de una clase de proteínas
huésped denominadas chaperonas, ya que estas proteínas ayudan al plegamiento evitando
reacciones secundarias improductivas como la agregación.
Una estrategia para recuperar la formación de los enlaces disulfuro de las proteínas es por medio
de reacciones de intercambio con tioles de bajo peso molecular en forma reducida y oxidada. Se
pueden usar aditivos como el glutatión reducido y oxidado (GSH, GSSG), otros tioles de bajo
peso molecular tales como cisteína / cistina, cisteamina / cistamina o dihidroxietil disulfuro / 2-
mercaptoetanol pueden ser superiores para la formación de enlaces disulfuro dependiendo de la
proteína del cuerpo de inclusión a una concentración reducida de 1-3 mM y aproximadamente
una quinta parte a una décima parte de esa concentración de la forma oxidada respectiva.
Otra estrategia para el plegamiento in vitro de proteínas son los detergentes no iónicos, así como
iónicos y bipolares los cuales tienen un efecto favorable sobre la renaturalización. Por ejemplo,
se puede emplear el reactivo lauril-maltósido o también se pueden añadir chaperonas al tampón
de replegamiento o mezclas compuestas de detergentes (por ejemplo, Triton X-100 o lauril-
maltósido) y fosfolípidos. Con estos se logra un plegamiento eficaz siendo que estas micelas
mixtas contienen restos polares y apolares que pueden interactuar con varios sitios en los
intermedios de plegado, evitando así el plegamiento incorrecto o la agregación.
Bibliografía
Firmas