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INGENIERÍA ENZIMÁTICA
PROBLEMARIO
NOTA: Los ejercicios presentados en este problemario, son una recopilación de problemas:
encontrados en internet en páginas de libre acceso y de otras Universidades e Instituciones,
y pretenden ser una herramienta para reforzar conceptos de cinética enzimática.
División de Ciencias Biológicas y de la Salud
Ingeniería Bioquímica Industrial
1. ECUACIÓNDE MICHAELIS-MENTEN
Un análisis inicial de las tasas de reacción para la reacción en solución, con E0 = 0.10
µM y varias concentraciones de sustrato S0, produce los siguientes parámetros de la
ecuación de Michaelis-Menten:
Vmax = 0.60 µM/s; KM = 80 µM.
Solución:
De la definición de Vmax tenemos:
Vmax = k 2 [E 0 ]
( ) ( )
k −1 = K M k1 − k 2 = (80 ⋅ µM ) 2 ⋅ µM −1s −1 − 6 ⋅ s −1 = 154 ⋅ s −1
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Ingeniería Bioquímica Industrial
En experimentos de laboratorio, se utilizaron dos decarboxilasas (A y B) obtenidas de
diferente microorganismo (ver tabla). Decida cual enzima demuestra un mayor
coeficiente de especificidad, (Vmax/ Km), recuerde que entre mayor sea el valor del
coeficiente de especificidad más específica es la enzima por el substrato.
Enzima A Enzima B
[S] Velocidad [S] Velocidad
(mM) (µM/min) (mM) (µM/min)
0.0002 0.3373 0.005 0.3962
0.0002 0.3364 0.005 0.3857
0.0005 0.6945 0.01 0.6163
0.0005 0.6957 0.01 0.6413
0.001 1.0764 0.05 1.5606
0.001 1.1407 0.05 1.5689
0.005 1.9636 0.1 1.9862
0.005 1.7706 0.1 1.7909
0.01 2.0641 0.25 2.2011
0.01 2.0751 0.25 2.2047
Solución:
3.5000
y = 0.5081x + 0.4224
R² = 0.999 Vmax = 2.36719094 (µM/min)
3.0000
KM = 1.20279143 (μM)
2.5000
2.0000
-1
1.5000 Vmax/KM = 1.968 min
1.0000
0.5000
0.0000
0 2 4 6
3.0000
y = 10.814x + 0.4323
2.5000 R² = 0.9967 Vmax = 2.31346294 (µM/min)
KM = 25.0185663 (μM)
2.0000
1.5000 -1
Vmax/KM = 0.092 min
1.0000
0.5000
0.0000
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
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Tiempo Sustrato
(min) (µM)
0 20.00
2 18.32
4 16.64
6 14.97
8 13.30
10 11.63
12 9.96
14 8.31
16 6.66
18 5.02
20 3.40
Utilizando la ecuación
[S ]0 − [S ] = − K + V t
ln
[S ]0 M max
[S]
ln 0
[S ] [S ]
y transformando los datos para obtener los ejes adecuados
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ln(So/S) x y
0.087685 22.8089171 19.1482267
0.18369012 21.7758032 18.2705913
0.28974888 20.7075863 17.3632081
0.40819718 19.5983716 16.4210948
0.5422881 18.4403825 15.4376837
0.69674291 17.2229954 14.4040112
0.87878828 15.9310272 13.3072822
1.10030511 14.5414212 12.128099
1.38291271 13.0160059 10.8344243
1.77265446 11.2825147 9.36582479
25
(So-S)/[ln(So/S)]
20
15
10 y = 0.8488x - 0.2134
5
0
10 15 20 25
t/[ln(So/S)]
Solución:
Se observa que se utilizó la ecuación de Hanes-Woolf [S]/v
[S ] = 1 [S ] + K M
v Vmax Vmax
Los datos del problema son: KM/Vmax 1/Vmax
m = 0.3684 s µM-1
-KM
[S]
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b = 590.6 s
1
Vmax = = 2.7144 ⋅ µM ⋅ s −1
0.3684
K M = 590.6 ∗ Vmax = 590.6 ∗ 2.7144 = 1,603.12 ⋅ µM
Sabemos que Vmax = kcat [E]t, por lo tanto
Vmax 2.7144 ⋅ µM ⋅ s −1
k cat = = = 904.8 ⋅ s −1
[E ]t 0.003 ⋅ µM
Solución:
Re-arreglando la ecuación de Michaelis-Menten
v
=
[S ]
Vmax K M + [S ]
despejando [S] tenemos
3 ⋅ µM
[S ] = KM
= = 9 ⋅ µM
1 1
− 1 − 1
v / Vmax 0.75
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2. PROBLEMAS DE INHIBICIÓN
Solución:
En cada inciso calculamos la velocidad sin (v0) y con (vi) efectos de inhibición
a).
v0 =
Vmax [S ]
=
(270nM / min ) 2 x10 6 nM( = 135nM / min
)
K M + [S ] 2 x10 6 nM + 2 x10 6 nM
vi =
Vmax [S ]
=
(
(270nM / min ) 2 x10 6 nM )
= 17.61nM / min
[I ]
K M 1 + ( 6
+ [S ] 2x10 nM 1 + )
2x10 6 nM
5
+ 2 x10 nM
6
Ki 1.5x10 nM
v
∗ 100 = 1 −
17.61nM / min
i% = 1 − i ∗ 100 = 86.96%
v0 135nM / min
b).
Vmax [S ] (270nM / min )(4x10 5 nM )
v0 = = = 45nM / min
K M + [S ] 2x10 6 nM + 4x10 5 nM
vi =
Vmax [S ]
=
(270nM / min )(4x10 5 nM ) = 3.72nM / min
[I ]
+ [S ] (2x10 nM )1 +
2 x10 6 nM
K M 1 + 6
5
+ 4x10 nM
5
K i 1 .5 x10 nM
v 3.72nM / min
i% = 1 − i ∗ 100 = 1 − ∗ 100 = 91.74%
v0 45nM / min
c).
v0 = =
(
Vmax [S ] (270nM / min ) 7.5x106 nM )
= 213.16nM / min
K M + [S ] 2 x106 nM + 7.5x106 nM
vi =
Vmax [S ]
=
(
(270nM / min ) 7.5x10 6 nM )
= 210.21nM / min
[I ]
K M 1 + ( 6
)
+ [S ] 2x10 nM 1 +
1x10 4 nM
5
+ 7.5x10 nM
6
Ki 1.5x10 nM
v 210.21nM / min
i% = 1 − i ∗ 100 = 1 − ∗ 100 = 1.38%
v0 213.16nM / min
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Solución:
a). La fórmula del grado de inhibición para inhibición competitiva es:
100[I ]
i% =
K i 1 +
[S ] + [I ]
K M
Despejando [I]
i% K I 1 +
[S ] (75) 2 x10 −5 M 1 + 1.5 x10 −3 M
( )
K M 2.9 x10 −4 M
= 3.7 x10 − 4 M
[I ] = =
100 − i% (100 − 75)
b)
v Sin inhibición Con inhibición
(Ec. Michaelis) (Inhibidor Competitivo)
v0 vi
v0 = vi
Solución:
Para un inhibidor no-competitivo el grado de inhibición está dado por
100[I ]
i% =
K i + [I ]
despejando KI
100
K I = [I ] (
− 1 = 2x10− 4 M )
100
− 1 = 6.67 x10−5 M
%i 75
Solución:
v0 =
Vmax [S ]
=
( )(
5.15x10-7 M / min 6 x10−4 M )
= 1.93x10-7 M / min
K M + [S ] 1x10-3 M + 6 x10− 4 M
5.15x10−7 M
Vmax
[I ]
[S ]
2.5x10 M −4
(6 x10− 4 M )
1 + 1 +
K I 3x10−5 M
vi = = = 2.07 x10−8 M / min
K M + [S ] −3
1x10 M + 6 x10 M−4
v 2.07x10-8 M / min
i% = 1 − i ∗ 100 = 1 − -7
∗ 100 = 89.29%
v0 1.93x10 M / min
Solución:
Para un inhibidor competitivo la actividad relativa está dada por:
K M + [S ]
a= ; despejando [S]
K M 1 +
[I]
+ [S ]
K i
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[I ]
a ⋅ K M 1 + − K M
[S ] = Ki = 4.28x10−3 ⋅ M
(1 − a )
En un experimento se midió la tasa inicial de una reacción enzimática, v, a varias
concentraciones de substrato [S]. La concentración de la enzima es 10 nM. Se graficó
1/v versus 1/[S] y se observó una línea recta en la cual el intercepto-y es 0.005 nM-1 seg
y la pendiente es 200 seg. ¿Cuál es el valor de KM y el de Vmax para esta reacción
enzimática? ¿Cuál es el valor de kcat para esta enzima? ¿Determine el coeficiente de
especificidad? 30 µM de un inhibidor, E, es adicionado y se observó que el intercepto-
y es 0.0065 nM-1 seg y la pendiente es 260 seg. ¿Qué tipo de inhibición se observó?
¿Cuál es el valor de Ki para el inhibidor con esta enzima?
Solución:
Se observa que se utilizó la ecuación de Lineweaver-Burk
1 KM 1 1
= +
v Vmax [S ] Vmax
1/v
1/Vmax KM/Vmax
Vmax
app
Vmax =
1 +
[I ]
K i
Despejando Ki
Ki =
[I ] =
30,000
= 100,000 ⋅ nM
V max 200
app
−1 −1
V max 153.846
Solución:
Para un inhibidor competitivo la relación [S]0 a [S]i para observar una misma velocidad es:
[S ]i = [S ]0 1 + [I ]
Ki
Despejando Ki
[I ]
−4
3.7 x10 M
= = 2 x10 −5 M
Ki
[S ]i − 1 = 1.5x10 M−3
−1
[S ]0 7.69x10 −5 M
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Solución:
Primero se determina qué tipo de inhibición se tiene, por lo tanto
Vmax = Vmax
app
= 100nM / min
K M = 999,860 ⋅ nM < K Mapp = 2,999,900 ⋅ nM
Ki =
[I ] =
6,000 ⋅ nM
= 2,999.52 ⋅ nM
app
K 2,999,900nM
M
−1 −1
KM 999,860nM
Despejando [S] de:
100[I ]
i% =
K i 1 +
[S ] + [I ]
K M
se tiene:
Solución:
Se observa que se utilizó la ecuación de Hanes-Woolf
[S ] = 1 [S ] + K M
v Vmax Vmax [S]/v
-KM
[S]
1
Vmax = = 2.7144 ⋅ µM ⋅ s −1
0.3684
Vmax 2.7144 ⋅ µM ⋅ s −1
k cat = = = 904.8 ⋅ s −1
[E ]t 0.003 ⋅ µM
kcat 904.8 ⋅ s −1
α= = = 0.564 ⋅ s −1µM −1
K M 1,603.12 ⋅ µM