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Tarea 5

Análisis de caso

La globina es una proteína globular que forma parte de la hemoglobina.


Estructuralmente, la hemoglobina es una heteroproteína tetramérica que en
adultos está formada por dos cadenas α y dos β (HbA1), mientras que en el feto
se encuentra formada por dos cadenas α y dos cadenas γ (HbF). Con menor
presencia existe un tipo de hemoglobina en adultos formada por dos cadenas α y
dos cadenas δ (HbA2). Cada una de las globinas constituyentes de la
hemoglobina es susceptible mutaciones en los genes que las codifican y cuya
consecuencia funcional conduce a una entidad clínica conocida como
hemoglobinopatía. Si bien, para el año 2003 cerca de 950 mutaciones habían sido
descritas para los genes que codifican las globinas, tan solo 10 han sido
asociadas con sintomatología clínica. De las alteraciones estructurales de la
hemoglobina, es quizás la Talasemia la que mayor presentación clínica tiene; de
hecho, se considera que cerca del 5% de la población mundial es portador de
mutaciones relacionadas con las diferentes cadenas de globina. A la fecha, se han
descrito mutaciones en regiones promotoras, sitios de reconocimiento de splicing,
sitio aceptor de señales poli-A así como cambios en el marco de lectura tanto para
los genes que codifican las globinas α como las β, siendo más frecuentes las
mutaciones reportadas en la cadena β (β-Talasemia).

En un comité interdisciplinario usted es llamado para dar su asesoría técnico-


científica sobre un caso clínico de un hombre de 39 años que consulta por dolor
óseo de dos semanas de evolución y quien refiere la misma presentación durante
la niñez y adolescencia. En un hemograma realizado por su laboratorio fueron
reportados los siguientes paraclínicos: hemoglobina: 9.6 g/dL y un extendido de
sangre periférica caracterizado por hipocromía, anisocitosis: ++ y poiquilocitosis
con presencia de dianocitos. Durante la electroforesis de hemoglobina no se
observa presencia de bandeo para HbS, pero si un incremento en la banda de
HbA2. La sospecha clínica del grupo médico tratante es una β-Talasemia. Con el
fin de confirmar el diagnóstico le solicitan a usted un concepto y su sugerencia es
llevar a cabo una ARMS-PCR (Sistema de Mutación Refractario a la Amplificación
por PCR) para las mutaciones IVSII-1, IVSI-6, IVSU-110 y el codón 39, las cuales
son mutaciones comunes que dan origen a β-Talasemia. Los resultados de la PCR
se muestran en la figura 1.

Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa del producto de la ARMS-PCR

.
1. Individuo Sano. 2. Paciente en estudio. WT: Amplificación alelos sanos.
MUT: Amplificación alelos mutados. Marker: Marcador de peso molecular.

A partir de la figura anterior obtenido responda:

1. Cuál es el fundamento de la ARMS-PCR.

El sistema de mutación refractaria a la amplificación (ARMS) es un método


simple para detectar cualquier mutación que implique cambios de base o
pequeñas deleciones. ARMS se basa en el uso de cebadores de PCR
específicos que permiten la amplificación del ADN, solo cuando el alelo
diana está contenido en la muestra. 
Después de una reacción ARMS, la presencia o ausencia de un producto
de PCR es diagnóstico de la presencia o ausencia del alelo diana. Se
pueden utilizar para analizar el ADN genómico humano en busca de una o
más mutaciones. El ARMS multiplex para el análisis de dos o más
mutaciones.

2. Como explica el resultado de la ARMS-PCR para el carril MUT del individuo


sano (1).

Como se evidencia el individuo sano, no posee ninguna banda de las


mutaciones más comunes que presenta esta enfermedad por lo cual se
descarta alguna hemoglobinopatía. Sin embargo, se evidencia la banda del
control interno avalando la corrida y verificando que no es un falso negativo.

3. Cuál es la intención de usar un control interno en una PCR como la


mostrada en el ejercicio.

El control interno en una amplificación se basa en ser un sistema para la


detección de los falsos negativos. La detección paralela de un fragmento
diferente al del patógeno, independientemente de la presencia o no del
patógeno en la muestra y por tanto siempre debe detectarse.

Está constituído por un molde de ADN o ARN y los oligonucleótidos y la


sonda que permiten su detección específica.

4. Dado que el estudio buscaba determinar diversas variantes en un mismo


gen, la PCR adicionalmente fue de tipo Multiplex. Mencione dos
desventajas y dos ventajas de la PCR multiplex.

Ventajas Desventajas
1. Tiene el potencial de ahorrar 1. Requiere que varios
tiempo y esfuerzo en el aspectos sean optimizados
laboratorio, sin comprometer la como los componentes o las
utilidad del experimento condiciones del
termociclador.
2. La amplificación de un 2. El número de pares de
número casi ilimitado de cebadores está limitado por
fragmentos de la misma el aumento de la posibilidad
cantidad de plantilla de ADN alineamiento incorrecto
como se utilizaría para un
producto de PCR estándar
único.

5. Teniendo en cuenta el resultado mostrado en el gel de agarosa, ¿considera


que el diseño experimental estuvo bien? ¿Incluiría algún control adicional?
Explique.

El diseño cuenta con los criterios para evaluar las mutaciones más
comunes, sin embargo, debería existir un control positivo para evaluar la
corrida de una manera efectiva, tanto en la integridad como en la capacidad
de migración que tienen las muestras y lo controles.

Adicionalmente, logrando clasificar de una manera asertiva y adecuada la


patología del paciente.
REFERENCIAS:
1. TRABAJO PRÁCTICO N 5 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
Cátedra: Genética Molecular. http://www.aulavirtual-
exactas.dyndns.org/claroline/backends/download.php?
url=L1RSQUJBSk9TX1BSwUNUSUNPUy9UUF9OujVfUENSL0luZm9ybWV
zX2RlX3JlZmVyZW5jaWEvRzFfVFBOX281LV9QQ1JfMjAxOC5wZGY
%3D&cidReset=true&cidReq=GENMOL#:~:text=Ventaja%3A%20alta
%20sensibilidad%20y%20especificidad,nos%20permite%20cuantificar
%20la%20muestra.
2. Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa. Aislamiento y
caracterización electroforética de DNA plasmídico. Carmen Alicia Padilla
Peña, Jesús Diez Dapena, Emilia Martínez Galisteo, José Antonio Bárcena
Ruiz, Concepción García Alfonso. https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/17%20ELECTROFORESIS%20ACS%20NUCLEICOS%20GELES
%20AGAROSA.pdf
3. Herramientas moleculares. aspectos teóricos y prácticos Secretaría de
Medio Ambiente y Recursos Naturales (Semarnat) Instituto Nacional de
Ecología y Cambio Climático (INECC) Universidad Autónoma
Metropolitana-Iztapalapa (UAM-I) Amelia Cornejo Romero, Alejandra
Serrato Díaz, Beatriz Rendón Aguilar, Martha Graciela Rocha Munive.
http://www2.congreso.gob.pe/sicr/cendocbib/con4_uibd.nsf/770DBBBD5AD
F759505257D4900580FE6/$FILE/HerramientasMolecularesAplicadasEcolo
g%C3%ADa.pdf
4. Little S. Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point
mutations. Curr Protoc Hum Genet. 2001 May;Chapter 9:Unit 9.8. doi:
10.1002/0471142905.hg0908s07. PMID: 18428319.