NORMA TÉCNICA NTC

COLOMBIANA 2736

1990-06-20

INDUSTRIAS AGRÍCOLAS.
CAFÉ. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE
CAFEÍNA (MÉTODO DE REFERENCIA)

E: AGRICULTURAL INDUSTRIES. COFFEE. DETERMINATION

OF CAFFEINE CONTENT (REFERENCE METHOD)

CORRESPONDENCIA:

DESCRIPTORES: industrias agrícolas; determinación de

cafeína; café; producto agrícola.

I.C.S.: 67.140.20

Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)

Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. 6078888 - Fax 2221435

Prohibida su reproducción Editada 2004-05-10

 PRÓLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo

nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993.

ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.

La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica

está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último
caracterizado por la participación del público en general.

La NTC 2736 fue ratificada por el Consejo Directivo de 1990-06-20. Organismo de estudio:
Comité Técnico 150003 Café.

Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.

ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales.

DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 2736

INDUSTRIAS AGRÍCOLAS.
CAFÉ. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE CAFEÍNA
(MÉTODO DE REFERENCIA)

0. INTRODUCCIÓN

Esta norma contempla el método escogido después de un estudio comparativo que se realizó
debido a su aplicabilidad general, reproducibilidad, especificación, facilidad de aplicación y
rapidez.

Sin embargo, el método es particularmente sensitivo a las variaciones en su aplicación, por

consiguiente es esencial seguir las instrucciones con todo detalle.

1. ALCANCE Y CAMPO DE APLICACIÓN

Esta norma tiene por objeto establecer el método de referencia para la determinación del
contenido de cafeína en el café. El método es aplicable a café verde, café verde descafeinado,
café tostado, café tostado descafeinado, extractos de café tanto secos como líquidos y
extractos descafeinados, tanto secos como líquidos.

El límite inferior de detección es 0,02 % de cafeína con base seca.

2. REFERENCIAS

NTC 2323, Café verde en sacos. Muestreo.

NTC 2325, Café verde. Determinación de la pérdida de masa a 105 °C.

ISO 1447, Café verde. Determinación del contenido de humedad. (Método de rutina).

ISO 3726, Café instantáneo. Determinación de la pérdida de masa a 70 °C bajo presión

reducida.

ISO 6670, Café instantáneo. Café instantáneo en cajas con recubrimiento. Muestreo 1).

1)
Actualmente se encuentra en estado de draft.
1
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3. PRINCIPIO

Extracción de cafeína de una muestra en un medio amoniacal. Purificación sucesiva, con éter
dietílico, en dos columnas cromatográficas, la primera en un medio alcalino, la segunda en un
medio ácido, seguido por elusión de la cafeína en cloroformo.

Medición espectrométrica del eluyente a la longitud de onda de máxima absorbancia (en la

región ultravioleta).

4. REACTIVOS

Todos los reactivos serán de conocida calidad analítica. El agua utilizada será destilada o de
por lo menos pureza equivalente.

4.1 Ácido sulfúrico 200 g/l solución [c (H2SO4) ≈ 2 mol/1)].

4.2 Hidróxido de sodio, 80 g/l solución [c(NaOH) ≈ 2 mol/1)]

4.3 Tierra diatomácea. El producto usado (célite 545 o el más apropiado) garantizará por lo
menos 98 % de recuperación de la cafeína de la muestra ensayada.

4.4 Amonio 70 g/l solución (1 volumen de solución amoníaco concentrado 20 = 0,9 g/ml + 2
volúmenes de agua).

4.5 Éter dietílico, puro o repurificado (véase el numeral 7.5) por cromatografía y saturado
con agua, de la siguiente forma:

Se pesan 800 ml de éter dietílico a través de una columna que contiene 100 g de óxido de
aluminio básico de grado 1 de actividad. El éter dietílico así repurificado será guardado en
botellas oscuras hasta ser usado.

(Alternativamente) el éter dietílico recién destilado y libre de peróxidos, puede ser usado en
lugar del éter dietílico repurificado por cromatofrafía).

4.6 Cafeína [1, 3, 7 trimetil 2,6 dioxopurina (CaH10N4O2)] puro, anhidro.

4.7 Cloroformo puro o repurificado (véase el numeral 7.5) por cromatografía, como está
descrita en el numeral 4.5, y saturado con agua.

5. APARATOS

5.1 Columnas cromatográficas (véase la Figura 1), 250 mm de longitud, 21 mm de diámetro

(columna I) y 17 mm de diámetro interior (columna II) con llaves de paso preferiblemente PTFE.

5.2 Espectrómetro ultravioleta, exactitud dentro de 0,004 unidades de absorbancia dentro

del intervalo usado.

5.3 Celdas de sílice de 10 mm de longitud de trayectoria óptica.

5.4 Equipo usual de laboratorio.

5.4.1 Vaso de precipitado de 100 ml de capacidad.

2
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Ø 21mm

COLUMNA I
(Alcalina)
250 mm. long.

Algodón o lana de vidrio

Mezcla de tierra diatomácea

y muestra

3 g de tierra diatomácea y
2 ml de NaOH (5,16g)

Lana de virio o algodón

Llave de paso
preferiblemente PFTE.

Ø 17mm
COLUMNA II
(Ácido)
250 mm. long.

Lana de vidrio

3 g de tierra diatomácea y
3 ml de H2SO4 (6,36 g)

Lana de virio

Llave de paso
preferiblemente PFTE.

Figura 1. Columna de cromatografía

3
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5.4.2 Baño de agua hirviendo.

5.4.3 Frascos volumétricos aforados de 50 ml, 100 ml y 1 000 ml de capacidad.

5.4.4 Pipetas aforadas de capacidades 2 ml y 5 ml

5.4.5 Balanza analítica.

5.5 Molino de café, apropiado para granos de café tostado.

5.6 Molino de disco dentado con camisa de enfriamiento o molino analítico, con cortadora
disponible y camisa de enfriamiento o molino similar apropiado para granos de café verde.

5.7 Tamiz de tejido de alambre. Con apertura nominal de 600 µm ó 630 µm y que cumpla
con el requisito de la norma ISO 3310/1.

6. MUESTREO

Muestra de acuerdo con el método especificado en la norma correspondiente.

Nota. Para café verde, el muestreo se efectúa de acuerdo con lo establecido en la NTC 2323. Para café instantáneo
en cajas de recubrimiento véase la norma ISO 6670.

Los métodos para otros tipos y productos de café todavía no han sido elaborados.

7. PROCEDIMIENTO

7.1 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Si es necesario se muele la muestra usando los aparatos especificados en los numerales 5.5 ó
5.6 hasta que pasen por el tamiz (véase el numeral 5.7).

7.2 DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE MATERIA SECA

Se calcula el contenido de materia seca después de determinar el contenido de humedad sobre

una parte de la muestra de ensayo (véase el numeral 7.1) de acuerdo con el método
especificado en la norma correspondiente.

Nota. Para determinar la humedad en café verde, véase la norma ISO 1447 y para la pérdida de masa a 105 °C de
café verde, véase la NTC 2325; para la determinación de la pérdida de masa a 70 °C bajo presión reducida en café
instantáneo, véase la norma ISO 3726. Los métodos para otros tipos y productos de café todavía no han sido
elaborados.

7.3 TAMAÑO DE MUESTRA

7.3.1 Café verde y café tostado

Se pesa con una tolerancia de 0,1 mg alrededor de 1 g de la muestra (véase el numeral 7.1).
Se transfiere a un vaso de precipitado de 100 ml (véase el numeral 5.4.1), se agregan 5 ml de
solución de amoníaco (véase el numeral 4.4) y se calientan por 2 min en un baño de agua
hirviendo (véase el numeral 5.4.2). Se deja enfriar y luego se transfiere a un frasco volumétrico
4
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de 100 ml (véase el numeral 5.4.3) se diluye hasta volumen con agua y se mezcla. Se deja
reposar la solución turbia y después, usando una pipeta (numeral 5.4.4), se transfieren 5,0 ml
de solución en un vaso de precipitado de 100 ml (véase el numeral 5.4.1), se añaden 6 g de
tierra diatomácea (véase el numeral 4.3) y se mezcla cuidadosamente.

7.3.2 Extracto de café seco

Se procede de acuerdo con el numeral 7.3.1, pero usando una muestra de 0,5 g y una alícuota
de la solución turbia de 2 ml y 3 g de tierra diatomácea.

7.3.3 Extracto de café líquido

Se procede de acuerdo con el numeral 7.3.1, pero usando una muestra entre 1 g y 2,5 g
correspondientes a aproximadamente 0,5 g de café sólido y una alícuota de la solución turbia
de 2 ml y 3 g de tierra diatomácea.

7.3.4 Café verde descafeinado y café tostado descafeinado

Se pesa con aproximación a 0,1 mg un gramo de muestra (véase el numeral 7.1). Se transfiere
a un vaso de precipitado (véase el numeral 5.4.1), se adicionan 5 ml de solución de amoníaco
(véase el numeral 4.4) y se calienta por 2 min en un baño de agua hirviendo (véase el numeral
5.4.2). Se añaden 6 g de tierra diatomácea (véase el numeral 4.3) y se mezcla
cuidadosamente.

7.3.5 Extracto de café descafeinado seco

Se procede de acuerdo con el numeral 7.3.4, pero usando un tamaño de muestra 0,5 g.

7.3.6 Extracto de café líquido descafeinado

Se procede de acuerdo con el numeral 7.3.4, pero usando un tamaño de muestra entre 1 g y
2,5 g correspondiente a aproximadamente 0,5 g de café sólido y 7 g a 8 g de tierra diatomácea.

7.4 DETERMINACIÓN

7.4.1 Llenado de columnas

7.4.1.1 Columna I (columna alcalina).

- Capa A. Se mezclan cuidadosamente, con una espátula de hoja flexible, 3 g de

tierra diatomácea (numeral 4.3) y 2 ml de solución de hidróxido de sodio (numeral
4.2) hasta homogeneizar (véase nota). Se obtiene un polvo ligeramente húmedo y
se transfieren 2 g de éste dentro de una columna de 21 mm de diámetro (numeral
5.1), la parte inferior de éste, está empacada con un tapón de algodón o lana de
vidrio. Se tapona la mezcla después de cada adición sin fuerza excesiva, usando
una vara de vidrio con un extremo aplanado hasta obtener una capa compacta. Un
pequeño tapón de algodón o lana de vidrio se puede colocar en la parte superior
de la capa A.

Nota. El material de empaque de la columna se puede preparar en grandes cantidades y almacenarlo en

envases cerrados. Se requiere una masa de 5,16 g para cada columna alcalina.

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- Capa B. Se transfiere la mezcla de tierra diatomácea y el tamaño de muestra

(véase el numeral 7.3) dentro de la columna, sobre la capa A. Se seca el vaso de
precipitado dos veces con una porción de aproximadamente 1 g de tierra
diatomácea (véase el numeral 4.3) transfiriéndola a esta columna. Se tapona para
obtener una capa homogénea y se coloca un tapón de algodón o lana de vidrio
sobre la parte superior de la capa B.

7.4.1.2 Columna II (columna ácida). Se coloca en la parte inferior de la columna cromatográfica

de 17 mm de diámetro (numeral 5.1) un tapón de lana de vidrio 3 g de tierra diatomácea
(numeral 4.3) y 3 ml de ácido sulfúrico (numeral 4.1). Cuidadosamente, se mezcla y se empaca
en la columna, como está descrito para la capa A de la columna I en el numeral 7.4.1.1. Se
coloca un tapón de fibra de vidrio arriba de esta capa.

Nota. El material de empaque de la columna se puede preparar en grandes cantidades y almacenarlo en envases
cerrados. Se requiere una masa de 6,36 g para cada columna ácida.

7.4.2 Cromatografía

Se montan las columnas una encima de otra, para que el efluente de la columna I pueda gotear
directamente en la columna II. Se pesan 150 ml de éter dietílico (numeral 4.5) a través de las
dos columnas. Se ajusta la llave de cierre de la columna II para que la cantidad del líquido
flotante permanezca encima de la capa. Se remueve la columna I. Sse pasan 50 ml de éter
dietílico (numeral 4.5) a través de la columna II usando la porción inicial para mojar el extremo
de la columna I y se pasa esta porción también en la columna II desechando esta efluencia.

Nota. El éter dietílico usado se puede recuperar por agitación con sulfato de hierro (II).

Se pasa el flujo de aire desde la parte superior a la parte inferior de la columna II (por ejemplo,
usando un soplador de goma inflado hasta que deje de gotear éter dietílico de la columna I y el
flujo de aire de la llave de cierre sólo conduzca un débil olor a éter dietílico. (Ver la advertencia)
se eluye la columna II con 45 ml a 50 ml de cloroformo, se reúne el eluyente en un frasco
volumétrico aforado de 50 ml (numeral 5.4.1) se diluye a volumen con el cloroformo (numeral
4.7) mezclando cuidadosamente.

El flujo del éter dietílico y el cloroformo bajo las condiciones de flujo natural deberán estar
dentro de 1,5 ml/min y 3 ml/min. Si éste excede la canalización, se reinicia la determinación.

ADVERTENCIA: las adiciones de éter dietílico y cloroformo se deben realizar en un lugar bien
ventilado para prevenir la posibilidad de inhalación de vapores de los solventes y una
posibilidad de explosión.

7.4.3 Medición espectrométrica (véase la Figura 2)

7.4.3.1 Medición de la solución de la muestra. Para evitar una falla de evaporación del
cloroformo. Se mide la absorbancia de la solución de cafeína en cloroformo (véase el numeral
7.4.2) usando celdas de sílice (véase el numeral 5.3), contra el mismo (véase el numeral 4.7)
para obtener la longitud de onda de máxima absorbancia (alrededor 276 nm). Una longitud de
onda de 30 nm por encima o por debajo de esta lectura verifica la pureza de la cafeína
obtenida.

6
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Si la máxima absorción excede el límite de la medición exacta del instrumento usado, se repite
la medición sobre la alícuota diluida de la solución de cafeína en el cloroformo (véase el
numeral 7.4.2). En este caso, se tiene en cuenta la dilución en el cálculo. Los factores
apropiados de la fórmula de los numerales 8.1.1, 8.1.2 y 8.1.3 se tendrá que ajustar
convenientemente. Si la máxima absorción medida es menor que 0,2, se repite la
determinación usando un tamaño de muestra mayor en masa.

Celdas: Silicio de nm de longitud de trayectoria óptica.

Solvente: Cloroformo.
Blanco: Cloroformo.

Absorbancia 0,276 nm

12

10

0,8
Absorbancia

Absorbancia corregida

0,6

0,4

Absorbancia 0,246 nm

0,2

Absorbancia 0,306 nm
0,0
220 240 260 280 300 320

Longitud de onda nm.

Figura 2. Ejemplo de medición espectrométrica

7.4.3.2 Preparación y medición de la solución de referencia. Se prepara una solución de

referencia de cafeína, de la siguiente manera:

Se pesan 100 mg ± 20 mg de anhidro puro de cafeína (véase el numeral 4.6) se colocan en un

frasco volumétrico aforado de 1 000 ml (véase el numeral 5.4.3), se disuelven en cloroformo y
se diluyen a volumen. Usando una pipeta (véase el numeral 5.4.4) se transfieren 5,0 ml de esta
solución a un frasco volumétrico aforado de 50 ml (véase el numeral 5.4.3) y se diluyen hasta
volumen con cloroformo.

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 2736

Se mide la absorbancia de esta solución, como está descrito en el numeral 7.4.3.1. La

absorbancia correcta de la solución de referencia (véase el numeral 8.1.1 y Figura 2) deberá
estar en 0,4.

7.4.4 Número de determinaciones

Se realizan dos determinaciones sobre el tamaño de muestras separadas, tomadas de la

misma muestra.

7.5 ENSAYO EN BLANCO

Se realiza un ensayo en blanco sobre los reactivos, usando el procedimiento descrito, pero
omitiendo el tamaño de muestra.

Antes de usar reactivos repurificados (véanse los numerales 4.5 y 4.7), y se repite ensayo en
blanco y se verifica su pureza.

8. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

8.1 MÉTODO DE CÁLCULO Y FÓRMULAS

8.1.1 Café verde y café tostado

El contenido de cafeína de la muestra, expresada en gramos por 100 g de material seco, es

igual a:

10 x C x A1
A2 x m x P

Donde:

C = concentración en gramos por ml de cafeína en la solución de referencia

(numeral 7.4.3.2).

A1 = absorbancia corregida del extracto purificado (numeral 7.4.2) obtenido en

el numeral 7.4.3.1 por ejemplo.

A1 =
(A1 ) − 30 nm + (A1 ) + 30 nm
2

Donde el sufijo se refiere a la longitud de onda de máxima absorbancia, (aproximadamente 276 nm)

A2 = absorbancia corregida de la solución de referencia de cafeína (numeral

7.4.3.2). Por ejemplo:

(A2 ) = (A2 ) − 30 nm + (A2 ) + 30 nm

2

8
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 2736

m = masa en gramos del tamaño de muestra.

P = material seco contenido, expresado como un porcentaje de masa de la

muestra (véase el numeral 7.2)

8.1.2 Extracto de café seco y extracto de café líquido

El contenido de cafeína de la muestra expresada en gramos por 100 g de materia seca es igual
a:

25 x 106 x C x A1
A2 x m x P

Donde los símbolos tienen el mismo significado indicado en el numeral 8.1.1.

8.1.3 Café verde descafeinado, café tostado y descafeinado, extracto de café seco
descafeinado y extracto de café líquido descafeinado.

El contenido de cafeína de la muestra expresada en gramos por 100 g de material seco es igual
a:

5 x 10 x C x A1
A2 x m x P

Donde los símbolos tienen el mismo significado indicado en el numeral 8.1.1.

8.1.4 Resultados

Se toma como resultado el promedio aritmético de los valores obtenidos, dado que el requisito
para repetibilidad es satisfecho.

8.2 REPETIBILIDAD

La diferencia entre los valores obtenidos en las determinaciones llevadas a cabo

simultáneamente o en rápida sucesión, sobre la misma muestra, en un laboratorio con el
mismo analista, no excederá el valor dado en la Tabla.

8.3 REPRODUCIBILIDAD

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones llevadas a cabo en dos laboratorios
diferentes, sobre la misma muestra, no excederá el valor dado en la Tabla.

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Tabla. Repetibilidad y reproducibilidad

Muestra Contenido de g Repetibilidad* Reproducibilidad* g de

cafeína/100 g de café g cafeína/100 g de café cafeína/100 g de café
Gramos de café verde alrededor de 2 0,12 0,38
alrededor de 1 0,08 0,31
descafeinada < 0,1 < 0,01 0,01
Gramos de café tostado alrededor de 2 0,10 0,32
alrededor de 1 0,04 0,19
descafeinada < 0,1 < 0,01 0,01
Café soluble alrededor de 4 0,17 0,39
alrededor de 2 0,12 0,20
descafeinada < 0,3 < 0,01 0,01

* En estos valores de repetibilidad y reproducibilidad son críticos sus diferencias a 95 % del nivel de
probabilidad.

10. DOCUMENTO DE REFERENCIA

INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Coffee. Determination of

Caffeine Content (Reference Method) ISO 1983 6p. (International Standard ISO 4052).

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