Diversidad filogenética y metabólica de bacterias que degradan compuestos aromáticos en

condiciones desnitrificantes y descripción de Thauera phenylacetica sp. nov., Thauera

aminoaromatica sp. nov., y Azoarcus buckelii sp. nov.
Resumen

Se caracterizaron seis cepas de bacterias desnitrificantes aisladas de diversos hábitats óxicos y anóxicos en
diferentes sustratos aromáticos monocíclicos mediante la secuenciación de genes de ARNr 16S, determinación
de rasgos fisiológicos y morfológicos e hibridación ADN-ADN. De acuerdo con estos criterios, las cepas S100,
SP y LG356 fueron identificadas como miembros de Thauera aromatica. Las cepas B5-1 y B5-2 se afiliaron
provisionalmente a la especie Azoarcus tolulyticus. Las cepas B4P y S2 estaban relacionadas sólo de forma
distante entre sí y con otras especies de Thauera descritas. Estas dos cepas se proponen como cepas tipo de
dos nuevas especies, Thauera phenylacetica sp. nov. y Thauera aminoaromatica sp. nov., respectivamente.
Mediante el análisis del gen de ARNr 16S, la cepa U120 estaba altamente relacionada con las cepas tipo de
Azoarcus evansii y Azoarcus anaerobius, mientras que los valores de reasociación ADN-ADN correspondientes
indicaban solo un bajo grado de relación genómica. Basado en un valor de similitud de ADN bajo y la presencia
de propiedades fisiológicas distintivas, la cepa U120 se propone como la cepa tipo de una nueva especie,
Azoarcus buckelii sp. nov. Casi todos los nuevos aislados se obtuvieron con diferentes sustratos. Los espectros
de sustratos muy variados de los aislados indican que se descubriría una diversidad aún mayor de bacterias
desnitrificantes que degradan compuestos aromáticos en los diferentes hábitats utilizando un espectro más
grande de sustratos aromáticos para el enriquecimiento y el aislamiento.

Palabras clave Thauera · Azoarcus · Thauera phenylacetica sp. nov. · Thauera aminoaromatica sp. nov. ·
Azoarcus buckelii sp. nov. · Reducción de nitratos · Compuestos aromáticos · Degradación anaeróbica

Introducción desnitrificantes, como benzoato y sus derivados

hidroxilados, compuestos fenólicos, hidrocarburos
Los compuestos aromáticos son estructuralmente
aromáticos y benzoatos halogenados, pero no
complejos y representan uno de los grupos más
compuestos aromáticos polihalogenados (Anders
diversos de sustratos orgánicos para
et al. 1995; Bakker 1977; Gallus et al. 1997; Khoury
microorganismos. Están muy extendidos en el
et al. 1992; Rabus y Widdel 1995; Rudolphi et al.
medio ambiente y son productos naturales de
1991; Seyfried et al. 1991; Song et al. 1998, 1999,
plantas (Harborne, 1980), microorganismos y
2000, 2001; Springer et al. 1998; Tschech y Fuchs
animales; también se liberan como resultado de
1987; Zhou et al. 1995). Rockne y col. (1999)
procesos industriales. Tarvin y Buswell (1934)
informaron de una degradación anóxica de
fueron los primeros en demostrar que los
naftaleno dependiente de nitratos por cultivos
compuestos aromáticos monocíclicos se
puros. Estas bacterias también son capaces de usar
degradaban a metano y dióxido de carbono en
una variedad de sustratos orgánicos no aromáticos
condiciones anóxicas. Desde entonces, numerosas
tales como alcoholes, hidrocarburos alifáticos,
investigaciones han demostrado que los
aminoácidos y ácidos orgánicos; sólo se utilizan
compuestos aromáticos se pueden degradar a CO2
pocos azúcares. Algunas de estas bacterias exhiben
o ácidos grasos volátiles en condiciones anóxicas
otras propiedades interesantes, como la fijación de
mediante bacterias que reducen el sulfato, reducen
N2 (Anders et al. 1995) y la desnitrificación
los nitratos, reducen el hierro férrico, fotosintéticas
aeróbica (Scholten et al. 1999).
o fermentan.
La mayoría de los compuestos aromáticos se
Los desnitrificantes utilizan una amplia variedad de
convierten a través de diferentes rutas periféricas
sustratos aromáticos en condiciones óxicas o

1
en el intermedio central benzoil-CoA (Harwood et
al. 1999; Heider y Fuchs 1997a, b), que se reduce
aún más a un compuesto cíclico no aromático y se
escinde hidrolíticamente. Sin embargo, la
degradación anaeróbica de -resorcilato y
resorcinol procede a través de una ruta diferente,
que no implica benzoil-CoA sino hidroxiquinol
(Gallus et al. 1997).
Aquí, informamos el aislamiento de ocho cepas de
bacterias desnitrificantes que degradan
compuestos aromáticos. Las cepas se
caracterizaron por hibridación ADN-ADN, análisis
de la secuencia del gen 16S rARN y características
fisiológicas, morfológicas y bioquímicas. Estas
bacterias se enriquecieron a partir de diferentes
muestras de suelo o lodo óxicas o anóxicas en
condiciones de desnitrificación con sustratos
aromáticos y se aislaron usando condiciones
mesófilas y medio sal mineral tamponado con
fosfato, ligeramente alcalino. Algunos de los
aislados se utilizaron antes en estudios de
metabolismo anóxico de fenol y cresoles (Rudolphi
et al. 1991) y ácidos fenilacéticos (Seyfried et al.
1991), pero se desconocían su estado taxonómico
y muchas propiedades. Como cepas de referencia
para comparación, usamos la cepa K172T de -
Proteobacteria Thauera aromatica (DSM 6984T), la
cepa KB740T de Azoarcus evansii (DSM 6898T) y la
cepa EbN1 de Azoarcus (Anders et al. 1995; Rabus
y Widdel 1995).
MATERIALES Y MÉTODOS
Medios de cultivo y crecimiento
El medio utilizado para el enriquecimiento, el
aislamiento y el cultivo de rutina contenía por litro
de agua destilada: 1,08 g de KH2PO4, 5,6 g de
K2HPO4, 0,54 g de NH4Cl, 0,15 g de CaCl2 · 2H2O,
0,2 g de MgSO4 · 7H2O, 1,27 g de NaNO3, 1 ml de
solución de oligoelementos SL-10 (Widdel et al.
1983), 1 ml de solución de selenito / tungstato
(Tschech y Pfennig 1984) y 1 ml de solución de
vitamina VL-7 (Pfennig 1978). El medio se dispensó
en botellas de 150 ml (100 ml) o en tubos Hungate
de 18 ml (10 ml) (Bellco Glass, Vineland, NJ) y se
2
hizo anóxico aplicando 10 ciclos (3 min por ciclo) de
vacío y enjuagando con nitrógeno gaseoso exento
de oxígeno a temperatura ambiente. El pH del
medio de crecimiento se varió agregando una
solución estéril de HCl, Na2CO3 o NaHCO3.
Utilización del sustrato
Para determinar el espectro de sustrato para todas
las cepas, se probaron los siguientes compuestos a
28 ° C como únicas fuentes de carbono y energía,
ya sea en condiciones de desnitrificación con
nitrato de sodio 10 mM o en condiciones óxicas, a
la concentración indicada (en mM): benzoato (2.5),
2-hidroxibenzoato (2.5), 3-hidroxibenzoato (2.5),
4-hidroxibenzoato (2.5), 2-aminobenzoato (2.5), 3-
aminobenzoato (2.5), 4-aminobenzoato (2.5), 2-
metilbenzoato ( 1), 3-metilbenzoato (1), 4-
metilbenzoato (1), 2-fluorobenzoato (2.5),
hidroquinona (1), resorcinol (1), catecol (1),
indoleacetato (1), fenol (1), o -cresol (1), p-cresol
(1), m-cresol (1), adipato (2.5), pimelato (2.5),
ciclohexanocarboxilato (2.5), L-lactato (2.5), D-
glucosa (2.5), D -fructosa (2.5), acetato (2.5),
succinato (2.5), gentisato (1), protocatecuato (1),
tolueno (1), o-ftalato (2.5), L-tirosina (2.5), L-
triptófano (2.5 ), L-fenilalanina (2.5), benzaldehído
(1), ácido p-anísico (1), fenilacetato (1),
fenilpropionato (1), 4-hidroxip acetato de fenilo
(1), sacarosa (2,5), maltosa (2,5) y acetona (2,5).
Prueba de utilización de aceptores de electrones y
fijación de nitrógeno
Se probaron sulfato, tiosulfato, sulfito, nitrato,
nitrito, oxígeno y fumarato como aceptores de
electrones a una concentración final de 5 mM con
acetato (20 mM). La fijación de nitrógeno se probó
en condiciones microóxicas utilizando un medio de
crecimiento semisólido (agar al 0,8%) sin
nitrógeno. Una zona de crecimiento de unos pocos
milímetros por debajo de la superficie se tomó
como signo de fijación de nitrógeno. Esta prueba se
complementó con el ensayo de reducción de
acetileno con medio líquido (Postgate 1972).
Métodos analíticos
El crecimiento se midió espectrofotométricamente Electroforesis de proteínas de células enteras
a 578 nm (trayectoria de luz de 1 cm). Los
Las células de todas las cepas probadas se
compuestos aromáticos se determinaron usando
cultivaron aeróbicamente en medio mineral líquido
HPLC equipado con un detector de UV fijado a 280
suplementado con acetato 10 mM a 30 ° C. Las
nm usando una columna Ultrasphere (4,6 ± 250
células se recolectaron en la fase de crecimiento
mm, tamaño de partícula de 5 µm) (Beckman)
medio exponencial y se pasaron a través de una
mantenida a temperatura ambiente. La fase móvil
celda de presión French, seguido de centrifugación
que comprende una mezcla de dos disolventes, (1)
(100.000 g, 40 min). La concentración de proteína
agua y (2) ácido acético al 0,01% (v / v) en
soluble se midió de acuerdo con el método de
acetonitrilo al 50% (v / v), se utilizó a un caudal de
Bradford (1976), y la misma cantidad de proteína
1 ml min – 1. La fase de disolvente (acetonitrilo al
de todas las cepas se cargó en un gel de
25% (v / v)) se mantuvo inicialmente durante 20
poliacrilamida SDS- (12%) y se separó por
min, luego la concentración aumentó al 50%
electroforesis. Las proteínas se tiñeron con azul de
durante un período de 5 min y se mantuvo durante
Coomassie.
5 min. La columna se volvió a equilibrar con
acetonitrilo al 25% durante al menos 5 minutos Inmunotransferencia
antes de la siguiente inyección. La cuantificación se
realizó utilizando estándares externos. Los nitratos Los extractos de células cultivadas en benzoato en
y nitritos se estimaron mediante la prueba condiciones anóxicas de reducción de nitrato se
Quantofix (Macherey-Nagel). El N2O en la fase separaron mediante SDS-PAGE, y las proteínas se
gaseosa de los tubos Hungate se determinó a 26 ° transfirieron a una hoja de nitrocelulosa (Scheicher
C mediante cromatografía de gases (Neyra et al. y Schüll) usando un sistema multiphor (Pharmacia).
1977), y la cantidad total de N2O producido se Las proteínas se detectaron mediante
calculó teniendo en cuenta el espacio de gas y inmunotinción según Rao et al. (1983). El antisuero
líquido y asumiendo que el N2O 24 mM es disuelto utilizado se preparó contra benzoil-CoA reductasa
a 26 ° C a 1 bar de presión. nativa purificada de T. aromatica. Se demostró que
este antisuero reacciona específicamente con las
Determinación del contenido de G + C cuatro subunidades de la benzoil-CoA
reductasa y mostró la interacción más fuerte con la
El ADN se aisló y purificó mediante cromatografía
subunidad (Heider et al. 1998).
en hidroxiapatita, y el contenido de G + C se
determinó por HPLC (Mesbah et al. 1989). Se usó Secuenciación del gen 16S rRNA y análisis
ADN de fago lambda no metilado (Sigma) como filogenético
estándar.
La extracción de ADN genómico, la amplificación
Hibridación ADN-ADN mediada por PCR del gen de ARNr 16S y la
secuenciación de los productos de PCR se llevaron
El ADN se aisló mediante el método de Cashion et
a cabo como describen Rainey et al. (1996). Los
al. (1977). La hibridación ADN-ADN se llevó a cabo
productos de PCR purificados se secuenciaron
como describen De Ley et al. (1970), con la
directamente usando el kit de secuenciación del
modificación descrita por Escara y Hutton (1980) y
ciclo Taq DyeDeoxy Terminator (Applied
Huss et al. (1983) utilizando un modelo Gilford
Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del
System 2600 equipado con un termoprogramador
fabricante. El analizador genético de ADN Applied
y trazador Gilford modelo 2527-R. Las tasas de
Biosystems 310 se utilizó para la electroforesis de
renaturalización se calcularon con TRANSFER.
los productos de reacción de secuencia.
Programa BAS de Jahnke y Bahnweg (1986) y
Jahnke (1992).

3
 Tabla 1 Características de la cepa K172T de Thauera aromatica (Anders et al. 1995) y Thauera sp. cepa LG356
(este estudio), cepa S100 (Tschech y Fuchs 1987, y este estudio), y cepa SP, cepa B4P y cepa S2 (Seyfried et al.
1990, y este estudio). + Positivo o presente, - negativo o ausente, nd no determinado.

Las secuencias de genes de ARNr 16S casi completas de Enriquecimiento y aislamiento de cepas
los aislados se alinearon manualmente con las de todas
Se aislaron varias cepas de bacterias desnitrificantes en
las secuencias de nucleótidos disponibles actualmente
estudios previos del metabolismo aromático
de representantes de -Proteobacteria recuperadas de
anaeróbico, pero estas cepas no se caracterizaron más.
las bases de datos de GenBank y EMBL utilizando el
La cepa U120 se enriqueció y aisló de una muestra de
editor ae2 (Maidak et al. 1997). Se utilizó el método de
suelo óxico (Ulm, Alemania) en el medio descrito por
Jukes y Cantor (1969) para calcular las distancias
Tschech y Fuchs (1987), en o-cresol 1 mM como fuente
evolutivas. Los dendrogramas filogenéticos se
de carbono y nitrato 5 mM como aceptor de electrones
reconstruyeron de acuerdo con el método de DeSoete
(Rudolphi et al. 1991). ). La cepa S100 se enriqueció y
(1983) y los métodos de unión de vecinos y de máxima
aisló de lodo anóxico (Konstanz, Alemania) en fenol 1
verosimilitud contenidos en el paquete PHYLIP
mM como fuente de carbono y nitrato 5 mM como
(Felsenstein 1993). Las secuencias del gen del ARNr 16S
aceptor de electrones (Tschech y Fuchs 1987). Las cepas
se han depositado en EMBL con los números de acceso
SP y S2 se enriquecieron a partir de lodos de acequia
AJ315676 (U120), AJ315678 (BP4), AJ315677 (S2),
anóxicos (Konstanz, Alemania) y B4P de lodos activados
AJ315681 (S100), AJ315680 (Lg356) y AJ315679 (SP).
de una planta de tratamiento de aguas residuales (Ulm,
RESULTADOS Alemania) en nitrato y los aminoácidos aromáticos L-

4
fenilalanina (SP), L-triptófano (S2) y L-tirosina (B4P)
primero, luego se transfiere a nuevos medios de
enriquecimiento que contienen nitrato y fenilacetato
(SP), salicilato (S2) y 4-hidroxifenilacetato (B4P)
(Seyfried et al. 1991).
Además, la cepa LG356 se enriqueció y aisló del lodo
activado de una planta de tratamiento de aguas
residuales (Ulm, Alemania) en fenilacetato 1 mM y
nitrato 5 mM; las cepas B5-1 y B5-2 se enriquecieron y
aislaron de una muestra de suelo oxic (Ulm, Alemania)
en 3-metilbenzoato 1 mM y nitrato 5 mM.
Propiedades morfológicas y fisiológicas
Se estudiaron diferentes características morfológicas y
fisiológicas de las cepas aisladas (Tablas 1 y 2). Todas las
cepas analizadas fueron gramnegativas, oxidasa y
catalasa positivas, móviles y capaces de crecer con
oxígeno, nitrato y nitrito como aceptor de electrones en
presencia de acetato. Todas las cepas pudieron reducir
el nitrato a N2, pero solo las cepas B5–1 y B5–2 fueron
capaces de fijar nitrógeno; esta característica también
se comprobó en la cepa KB 740T de A. evansii y se
confirmó que era positiva. Todas las cepas, excepto la
cepa S2, produjeron grandes cantidades de N2O,
correspondientes al 16-53% del nitrato consumido que
se transformó en N2O.
La temperatura óptima para el crecimiento de todas las
cepas estuvo entre 28 y 30 ° C; no se observó
crecimiento por debajo de 4 ° C o por encima de 40 ° C.
El pH óptimo para el crecimiento estaba entre 7 y 7,6
con un rango de pH para el crecimiento de 6,5 a 8,6.
La morfología celular de las distintas cepas se muestra
en la Figura 1; los tamaños de las células se dan en las
Tablas 1 y 2. Las células de las cepas SP, LG356, S2 y S100
eran varillas cortas rectas; las células de la cepa B4P
eran de varillas ovaladas a cocoides; las células de la
cepa U120 eran cocoides de tamaño irregular, y las de
las cepas B5-1 y B5-2 eran cocoides o bastoncillos
cortos. A modo de comparación, las células de la cepa
K172T de T. aromatica y la cepa KB740T de A. evansii
también se muestran en la Fig. 1.
5
El crecimiento en medios sólidos pareció verse
afectado por la fuente de agar. La cepa B4P y la cepa
KB740T de A. evansii crecieron mejor en un medio
elaborado con agar Difco purificado, mientras que la
cepa K172T de T. aromatica y las cepas SP y LG356
crecieron mejor en un medio elaborado con agar
Oxoid purificado. Las cepas U120, B5–1, B5–2 y S100
pueden crecer igualmente bien en ambos tipos de
agar. La diferente respuesta de crecimiento puede
explicarse por la diferente sensibilidad hacia las
impurezas en el agar.
Las Tablas 1 y 2 describen algunas otras propiedades
fisiológicas tales como la reacción de catalasa y
oxidasa y la utilización del sustrato en condiciones
desnitrificantes.
Comparación del patrón electroforético de
proteínas
Todas las cepas ensayadas se cultivaron
aeróbicamente sobre acetato y se prepararon
extractos a partir de células de la fase de crecimiento
exponencial. Los perfiles de proteínas solubles se
examinaron mediante SDS-PAGE (figura 2). Las
bandas de proteínas observadas mostraron dos
grupos de patrones diferentes. El primer grupo está
constituido por cepas filogenéticamente
relacionadas con T. aromatica, y el segundo grupo
por cepas relacionadas con A. evansii (ver más
abajo). Dentro del grupo Thauera, el patrón de
proteínas de la cepa K172T es similar al de las cepas
S100, SP y LG356. Los perfiles de proteínas de las
cepas B4P y S2 difieren notablemente y también
difieren de los de todas las demás cepas. Se
observaron tres perfiles de proteínas diferentes para
las cepas que constituyen el grupo Azoarcus (U120,
B5-1 y KB740T). El perfil de proteínas de las cepas B5-
1 y B5-2 es más similar al de la cepa KB740T que al
de la cepa U120. Los perfiles de proteínas de las
cepas B5–1 y B5–2 son prácticamente indistinguibles
(no se muestran), lo que sugiere cepas idénticas.
Tabla 2 Características de la cepa KB740T de Azoarcus evansii (Anders et al. 1995), cepa EBN1 (Rabus y Widdel
1995), cepa B5-1 (este estudio), cepa U120 (Rudolphi et al. 1991, y este estudio), y Azoarcus anaerobius DSM
12081T (Springer et al. 1998). + Reacción positiva o presente, - negativa o ausente, nr no reportado, nd no
determinado.

Fig. 1 Micrografías de contraste de

fase de células en la fase de
crecimiento exponencial de las
cepas: Fila superior (de izquierda a
derecha): cepa KB740T de Azoarcus
evansii, cepa B5-1, cepa B5-2, cepa
U120, cepa S100. Fila inferior (de
izquierda a derecha: cepa S2, cepa
SP, Thauera aromatica cepa K172T,
cepa B4P, cepa LG356. Barra de 10
µm. Se realizaron montajes
húmedos para microfotografías de
los microorganismos según Pfennig
y Wagener (1986)

6
Diferenciación de las cepas mediante Western blots y
antisuero contra benzoil-CoA reductasa
Se utilizó un antisuero producido contra benzoil-CoA
reductasa de T. aromatica cepa K172T para la
inmunotinción de proteínas de células cultivadas
anaeróbicamente en benzoato y nitrato. El antisuero
reaccionó específicamente con las cuatro subunidades
de la benzoil-CoA reductasa. La Figura 3 muestra
la transferencia de Western de extractos celulares de
T. aromatica cepa K172T (control), A. evansii cepa
KB740T, cepas S100, SP, S2, B4P, U120, B5–1 y B5–2
separados por SDS-PAGE. El antisuero reaccionó
fuertemente con cuatro bandas de proteína específicas
de las cepas K172T, S100, SP y LG356 pero con solo una
banda de proteína de las otras cepas o no mostró
reacción. Esto sugiere que las cepas K172T, S100, SP y
LG356 albergaban reductasas de benzoil-CoA similares
compuestas por cuatro subunidades similares.
Las cepas KB740T, S2, B4P, U120, B5-1 y B5-2 contenían
sólo una banda de proteína principal que reaccionaba
de forma cruzada con el antisuero. La cepa KB740T
contenía una pequeña banda de proteína de fuerte
reacción cruzada que podría corresponder a la más
pequeña (subunidad ) de las cuatro subunidades
enzimáticas; esta banda también se tiñó más fuerte en
la cepa LG 356. Curiosamente, las cepas B5-1 y B5-2
tenían una banda de proteína fuertemente teñida que
podría corresponder a la segunda subunidad más
pequeña (subunidad ) de la benzoil-CoA reductasa. La
cepa U120 no contenía ninguna proteína de reacción
cruzada. Las diferencias entre las especies de Thauera
y Azoarcus se reflejan en diferencias considerables en
las secuencias y tamaños predichos de las subunidades
de benzoil-CoA reductasa en T. aromatica y A. evansii
(números de acceso al banco de genes AJ 224959 y AJ
428529, respectivamente).
Análisis filogenético basado en la comparación de la
secuencia del gen del ARNr 16S
Las secuencias casi completas del gen de ARNr 16S se
alinearon con las de las cepas relacionadas Thauera y
Azoarcus. El análisis filogenético mostró que las cepas
formaron tres grupos diferentes (ver más abajo) que
surgieron con cualquier algoritmo utilizado. En la figura
7
4 se muestra un dendrograma de matriz de distancias.
El primer grupo abarca las cepas S100, S2, SP, B4P y
LG356 relacionadas con la cepa K172T de T. aromatica,
con valores de similitud de 100, 99,1, 99,7, 99,7 y
98,8%, respectivamente. El segundo grupo engloba las
cepas U120 y EbN1 relacionadas con Azoarcus
anaerobius, con valores de similitud de 99,1% y 98,5%,
respectivamente, y con la cepa de A. evansii KB740T,
con valores de similitud de 96,6% y 96,5%,
respectivamente. El tercer grupo comprende las cepas
B5-1 y B5-2 relacionadas con la cepa Td1 de A.
tolulyticus (no se muestra), con un valor de similitud
del 99,9%.
Hibridación ADN-ADN
Las cepas estaban estrechamente relacionadas
filogenéticamente, y la similitud de la secuencia del gen
del ARNr 16S era mayor que el valor umbral que
permitiría una discriminación inequívoca entre
especies del mismo género. Por lo tanto, se realizaron
experimentos de hibridación ADN-ADN utilizando ADN
de varias cepas y ADN de la cepa K172T de T. aromatica
como referencia (dos mediciones). La cantidad
observada de hibridación ADN-ADN entre la cepa
K172T de T. aromatica y las cepas SP, LG356 y S100
(72,4–76, 64,4–64,0 y 90,9–88,0%, respectivamente)
indica pertenencia a la especie T. aromatica. Otros
experimentos de hibridación con las cepas SP y LG356
mostraron un 75% de hibridación ADN-ADN entre sí.
Las cepas B4P y S2, por otro lado, están
moderadamente relacionadas con las cepas de T.
aromatica, ya que la cantidad de hibridación del ADN
con el ADN de la cepa K172T es baja, es decir, 31-33,8%
y 26,9-41%, respectivamente. El nivel de hibridación de
ADN entre las cepas B4P y S2 es bajo (39,2%), lo que
indica la presencia de entidades genómicas separadas
por valor del estado de especie.
La cepa U120 mostró valores de similitud de ADN del
50 al 57% con la cepa EbN1. Estas dos cepas estaban
moderadamente relacionadas con A. anaerobius (DSM
12081T) (54,2 y 62,9% de similitud de ADN,
respectivamente), mientras que los valores de similitud
de las cepas U120 y EbN1 con la cepa KB740T de A.
evansii fueron casi insignificantes (10-25%).

Fig. 2 Patrón electroforético de proteínas del
extracto celular (sobrenadante 100.000g) de las
cepas desnitrificantes. Los carriles están
etiquetados de acuerdo con las respectivas
designaciones de cepas. Parámetros del
dendrograma: Los algoritmos utilizados son:
correlación producto-momento de Pearson entre
perfiles densitométricos obtenidos de los
patrones, para generar una matriz de similitud;
método de grupos de pares no ponderados con
promedios aritméticos (UPGMA), para calcular el
dendrograma a partir de la matriz de similitud. La
barra de escala se refiere a valores de similitud.
Optimización de la correlación de Pearson: rango
de 0,21% (0,0% -100,0%)
Fig. 3 Análisis de inmunotransferencia Western de
extractos de células de diferentes cepas cultivadas en
benzoato en condiciones de desnitrificación anóxicas.
Se utilizó antisuero producido contra benzoil-CoA
reductasa purificada de T. aromatica cepa K172T.
Enzima se refiere a benzoil-CoA reductasa purificada
(control positivo); otros carriles contienen extracto
celular de cepas como se indica
DISCUSIÓN
Diversidad de bacterias reductoras de nitratos y
degradantes de compuestos aromáticos y sus hábitats
Hemos aislado bacterias mesófilas reductoras de
nitratos de muestras de lodo de tratamiento de aguas
residuales, sedimentos y suelos anóxicos y óxicos que
difieren significativamente en su espectro de sustrato y
otras propiedades. Aún así, todos son miembros de la
subclase de las Proteobacterias y pertenecen a los
géneros relacionados Thauera y Azoarcus.
Obviamente, se encuentran en muchos tipos de suelos
y hábitats de sedimentos donde se benefician de su
capacidad común para metabolizar una gran variedad
de sustratos aromáticos y no aromáticos de bajo peso
molecular, tanto en condiciones de desnitrificación
óxicas como anóxicas. Casi todos los nuevos aislados se
obtuvieron con diferentes sustratos. Los espectros de
sustrato altamente variados de los aislados indican que
8
se descubriría una diversidad aún mayor de bacterias
desnitrificantes que degradan compuestos aromáticos
en los diferentes hábitats mediante el uso de un
espectro aún mayor de sustratos aromáticos para el
enriquecimiento y el aislamiento.
Fig. 4 Árbol filogenético basado en el gen 16S-rRNA
que muestra las relaciones entre las cepas reductoras
de nitratos que degradan compuestos aromáticos
U120, S2, B4P, S100, SP y LG356 y sus parientes más
cercanos de los géneros Azoarcus y Thauera. Los
números en los puntos de ramificación se refieren a
valores de arranque (1000 remuestreos). Barra de
escala 2 sustituciones de nucleótidos en 100 bases.
Los nombres en negrita se refieren a las cepas
utilizadas en este estudio.
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De muchos otros hábitats naturales se han obtenido
bacterias facultativas similares reductoras de nitratos y
degradantes de compuestos aromáticos. La mayoría de
las cepas descritas son neutrofílicas (pH óptimo para el
crecimiento 7-8), mesófilas (temperatura óptima de
crecimiento 28-40 ° C) y móviles (se observa motilidad
o flagelos). Las cepas que pertenecen al género
Thauera son T. aromatica (Anders et al. 1995), T.
mechernichensis (Scholten et al. 1999) y T.
chlorobenzoica (Song et al. 2001; Heider y Fuchs 2002).
Las nuevas especies validadas del género Azoarcus son
A. evansii (Anders et al. 1995), A. tolulyticus (Zhou et al.
1995), A. anaerobius (Springer et al. 1998), A.
toluvorans y A. toluclasticus ( Song et al. 1999).
Se han aislado y caracterizado varias bacterias
reductoras de nitratos y degradantes de compuestos
aromáticos, como las cepas EbN1, PbN1, ToN1 y
mXyN1, pero no estaban afiliadas a ninguno de los
géneros o especies conocidos (Rabus y Widdel 1995).
Estas cepas utilizan en condiciones desnitrificantes
etilbenceno, propilbenceno, tolueno y m-xileno,
respectivamente. Mientras tanto, Widdel et al.
Pusieron a disposición las secuencias del gen 16S rRNA
de estas cepas; El análisis indica que las cepas EbN1 y
PbN1 están estrechamente relacionadas y forman un
grupo que se ramifica dentro de las cepas de Azoarcus.
La cepa ToN1 está estrechamente relacionada con A.
evansii (DSM 6898T) y la cepa mXyN1 está
estrechamente relacionada con T. aromatica (DSM
6984T).
Dentro de la especie T. aromatica, varias cepas exhiben
diferencias en sus características metabólicas y
fisiológicas o en su morfología (Heider y Fuchs 2002);
esto también puede ser cierto para algunas especies de
Azoarcus. Por ejemplo, T. aromatica (DSM 6984T)
forma barras cocoides, mientras que las cepas 3CB-1 y
T1 tienen forma de barra. Además, a diferencia de las
cepas K172T y T1, la cepa 3CB-1 usa alcohol bencílico y
caproato pero no propionato y tolueno, mientras que
las cepas K172T y T1 pudieron usar tolueno y
propionato pero no caproato ni alcohol bencílico. La
cepa AR-1 se diferencia de todas las cepas de T.
aromatica por su capacidad para crecer de manera
óptima a 37 ° C y utilizar -resorcilato. Varias de las
cepas estudiadas aquí también pertenecen a T.
aromatica, lo que demuestra su amplia presencia y
versatilidad.
Bakker (1977) y Khoury et al. (1992) reportaron la
presencia de bacterias espirales en un cultivo mixto
que degrada el fenol bajo condiciones desnitrificantes,
pero no caracterizaron estas bacterias. Recientemente,
Shinoda et al. (2000) informaron del aislamiento de una
nueva cepa bacteriana en espiral de bacterias
reductoras de nitratos que degrada compuestos
aromáticos y pertenece al género Magnetospirillum, un
miembro de la subclase de las Proteobacterias.
Además, el degradador de naftaleno descrito por
Rockne et al. (1999) está relacionado
filogenéticamente con Pseudomonas stutzeri o Vibrio
pelagius.
Comparación de las cepas B4P, S2, S100, LG356 y SP
con la cepa de T. aromatica K172T
Las cepas caracterizadas aquí que pertenecen al género
Thauera compartieron muchos rasgos fenotípicos. Sin
embargo, se observaron varias diferencias en este
grupo, como se informa en la Tabla 1. Mientras que la
cepa S100 es fenotípicamente cercana a T. aromatica,
las cepas SP y LG356 muestran algunas diferencias. Sin
embargo, valores altos de similitud de ADN y perfiles
de proteínas similares apoyan la afiliación de las cepas
S100, SP (valor de similitud de ADN> 70%) y la cepa
LG356 (valor de similitud de ADN ligeramente por
debajo del 70%) a T. aromatica.
A pesar de los altos niveles de similitud de sus
secuencias de genes de ARNr 16S, las pruebas de
hibridación ADN-ADN y los perfiles de proteínas indican
que las cepas B4P y S2 son genotípicamente diferentes
de T. aromatica. El valor de similitud de ADN de las
cepas B4P y S2 del 39% y valores que oscilan entre el
27 y el 41% con la cepa tipo de T. aromatica indicaron
la presencia de dos entidades genómicas separadas. La
cepa B4P se diferencia de las otras cepas por su forma
celular (Fig. 1); el organismo es un bastón ovalado o
coco mientras que las células de otras cepas son
bastones rectos. La cepa B4P es el único organismo que
requiere p-aminobenzoato como factor de
crecimiento; tiene el mayor contenido de G + C y se
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diferencia de las otras especies de Thauera también por
su espectro de sustrato (Cuadro 1) y su perfil proteico
(Fig. 2).
Curiosamente, el contenido de G + C (% en moles) del
ADN de las cepas Thauera difirió significativamente,
hasta un 7%, mientras que las secuencias del gen del
ARNr diferían como máximo en un 1,2%. La gran
desviación en el contenido de G + C puede deberse a
un cambio en el uso de nucleótidos en las regiones
intergénicas no codificantes por razones que no se
comprenden. En el A. evansii relacionado, se observó
que las regiones intergénicas de dos operones que
están presentes como duplicados en el cromosoma
diferían drásticamente, mientras que los genes
variaban solo ligeramente, principalmente en la
posición de oscilación (Schühle et al. 2001).
Las cepas S2 difieren de la cepa B4P significativamente
en el espectro del sustrato, p. Ej. crece bien en
condiciones desnitrificantes sobre los ácidos
dicarboxílicos pimelato y adipato, y sobre fenol y
tolueno. La cepa S2 es más similar en su morfología y
espectro de sustrato a las cepas S100 y K172T que a las
cepas B4P, SP y LG356. Sin embargo, difiere
considerablemente en su patrón electroforético de
proteínas de las cepas S100 y K172T. La hibridación
ADN-ADN de la cepa S2 con la cepa tipo T. aromatica
K172T y con la cepa B4P indicó que las tres cepas eran
genómicamente significativamente diferentes. Por lo
tanto, proponemos las cepas S2 y B4P como cepas tipo
de nuevas especies del género Thauera, Thauera
aminoaromatica y Thauera phenylacetica.
Comparación de las cepas U120 y B5 con especies
pertenecientes al género Azoarcus
La cepa B5-1 es obviamente idéntica a la cepa B5-2 y
muestra una identidad de secuencia de genes de ARNr
del 99,9% con A. tolulyticus. Basándonos en la alta
similitud de la secuencia del gen ARNr 16S con A.
tolulyticus, asignamos provisionalmente los dos
aislados a esta especie. Las cepas también pueden
crecer en condiciones anóxicas con tolueno. La cepa
U120 está estrechamente relacionada con miembros
del género Azoarcus (Fig. 4); las especies más cercanas
fueron A. anaerobius (DSM 12081T) (Springer et al.
1998), cepa EbN1 (Rabus y Widdel 1995) y A. evansii
(DSM 6898T) (Anders et al. 1995). La cepa U120 se
agrupa junto con A. anaerobius DSM 12081T y la cepa
EbN1, mientras que A. evansii (DSM 6898T) y las
especies de Azoarcus que degradan el tolueno A.
toluvorans, A. toluclasticus y A. tolulyticus forman un
grupo separado. Las similitudes de genes de ARNr intra-
grupo oscilan entre el 98,1 y el 99,7% de similitud,
mientras que los miembros de este grupo muestran
solo entre el 94,5 y el 95,2% de similitud con las cepas
tipo de especies que se ramifican fuera de este grupo.
Este patrón de ramificación es consistente con el
dendrograma de relación mostrado por Song et al.
(2001). A pesar de las similitudes relativamente altas en
las secuencias del gen del ARNr 16S entre las cepas de
Azoarcus, mostraron muchas diferencias fisiológicas y
morfológicas. A. anaerobius (DSM 12081T) es una
bacteria desnitrificante obligada, en contraste con
todas las otras cepas de Azoarcus, que pueden usar
también nitrito y oxígeno como aceptores de
electrones. Además, la cepa DSM 12081T de A.
anaerobius se diferencia de la cepa U120 por la forma
de sus células y su capacidad para utilizar resorcinol,
fenilalanina, tirosina y fenilacetato en condiciones
desnitrificantes. La cepa U120 se diferenciaba por el
valor de similitud del ADN de la cepa EbN1 de Azoarcus
(50-57%) y de A. anaerobius (DSM 12081T) (54,2%), así
como por el patrón de proteínas. Teniendo en cuenta
las diferencias entre la cepa U120 y las cepas de
Azoarcus relacionadas, proponemos describir la cepa
U120 como la cepa tipo de una nueva especie de
Azoarcus, Azoarcus buckelii. Debe notarse, sin
embargo, que las especies de Azoarcus que degradan
compuestos aromáticos desnitrificantes (algunas de las
cuales también fijan nitrógeno) se agrupan por
separado de las especies de Azoarcus que fijan
nitrógeno.
Descripción de Thauera phenylacetica sp. nov.
Thauera phenylacetica (phe.nyl.a.ce’ti.ca) M.L. acidum
phenylaceticum perteneciente al 4-OH-fenilacetato, el
sustrato utilizado para el aislamiento.
Las células son ovaladas, de bastoncillos cortos a
cocoides (0,75–1 1,5–2 µm), gramnegativas, catalasa y
oxidasa positivas y móviles. Crecimiento entre pH 6,9 y
11
8,9 con un crecimiento óptimo entre pH 7 y 7,5. El
rango de temperatura de crecimiento es de 4 a 40 ° C
con un óptimo a 28 ° C. El crecimiento requiere 4-
aminobenzoato. Se utilizan nitrato, nitrito y oxígeno
como aceptor de electrones; el nitrógeno no se fija. En
condiciones óxicas, se utilizan benzoato, 3-
hidroxibenzoato, 4-hidroxibenzoato, L-fenilalanina,
acetato, glutarato, succinato y L-glutamato.
Crecimiento lento en 2-aminobenzoato, catecol,
fenilacetato, fenilpropionato, pimelato, tolueno, fenol,
L-aspartato, D-glucosa y D-fructosa. No hay
crecimiento en gentisato, D-ribosa y hexadecano.
En condiciones anóxicas, se utilizan benzoato, 3-
hidroxibenzoato, 4-hidroxibenzoato, 2-
fluorobenzoato, L-fenilalanina, p-cresol, acetato,
succinato, L-lactato y glutarato. Solo crecimiento
deficiente en 2-aminobenzoato, gentisato,
protocatecuato, fenilacetato, indol, fenol, o-cresol, m-
cresol, tolueno y 3-clorobenzoato. Sin crecimiento en
2-hidroxibenzoato, 4-aminobenzoato, 2-
metilbenzoato, o-ftalato, resorcinol, hidroquinona,
fenilpropionato, cinamato, L-tirosina, L-triptófano, 3-
acetato de indolilo, etilbenceno, benceno, hexadecano,
adipato, pimelato, ciclohexanocarboxilato, D-glucosa,
D-fructosa, D-ribosa y lactosa.
El contenido de G + C del ADN es del 70,6% en moles.
Hábitat y país de origen: lodos activados de una
depuradora municipal en Ulm, Alemania
El tipo de cepa es la cepa B4PT (= DSMZ 14743T)
Descripción de Thauera aminoaromatica sp. nov.
Thauera aminoaromatica (a.mi.no.ar.o.ma’ti.ca). M.L.
adj. aminoaromatica se refiere a la capacidad de crecer
con compuestos aminoaromáticos como 2-
aminobenzoato o aminoácidos aromáticos.
Las células son bastoncillos cortos (0,5–0,75 2-3 m),
gramnegativas, catalasa y oxidasa positivas y móviles.
Crecimiento entre pH 7,2 y 9 con pH óptimo para
crecimiento entre 7,5 y 8,6. El rango de temperatura de
crecimiento es de 4 a 40 ° C con un óptimo a 28 ° C. No
se requiere factor de crecimiento. Se utilizan nitrato,
nitrito y oxígeno como aceptor de electrones; el
nitrógeno no se fija.
En condiciones óxicas, se utilizan benzoato, L-
fenilalanina, acetato, glutarato, D-ribosa, succinato, L-
glutamato, tolueno y fenol. Crece mal con 4-
hidroxibenzoato, fenilacetato, fenilpropionato,
pimelato, D-glucosa, D-fructosa y L-aspartato. No hay
crecimiento en 3-hidroxibenzoato, 2-aminobenzoato,
catecol, gentisato y hexadecano. En condiciones
anóxicas, se utilizan benzoato, 2-hidroxibenzoato, 3-
hidroxibenzoato, 2-aminobenzoato, 2-fluorobenzaote,
p-cresol, tolueno, acetato, succinato, L-lactato y L-
glutarato; crecimiento deficiente en 2-metilbenzoato,
catecol, L-fenilalanina, L-tirosina, indol y fenol; sin
crecimiento en 3-hidroxibenzoato, 3-aminobenzoato,
4-aminobenzoato, 2-metilbenzoato, 4-metilbenzoato,
o-ftalato, resorcinol, hidroquinona, protocatecuato,
gentisato, fenilacetato, fenilpropionato, cinamato, p-
anisato, L-triptófano, indol 3-acetato, o-cresol, m-
cresol, etilbenceno, benceno, hexadecano, 3-
clorobenzoato, adipato, pimelato, ciclohexano
carboxilato, D-fructosa, D-ribosa y lactosa.
El contenido de G + C del ADN es 68,4% en moles.
Hábitat y país de origen: lodo de acequia anóxico de
Konstanz, Alemania.
La cepa tipo es la cepa S2T (= DSMZ 14742T).
Descripción de Azoarcus buckelii sp. nov.
Azoarcus buckelii (buck'e.li.i.) M.L. gen. norte. buckelii
de Buckel, en honor al profesor Wolfgang Buckel,
bioquímico y fisiólogo bacteriano.
Las células son cocoides (1,5 ± 0,5 µm de diámetro),
gramnegativas, catalasa y oxidasa positivas.
Crecimiento entre pH 6 y 8.4 con un crecimiento
óptimo entre pH 7 y 7.4. El rango de temperatura de
crecimiento es de 4 a 40 ° C con un óptimo a 28 ° C. El
crecimiento requiere vitamina B12. El metabolismo es
12
estrictamente oxidativo. Se utilizan nitrato, nitrito y
oxígeno como aceptores de electrones, pero no
sulfato, tiosulfato, sulfito o fumarato. El nitrógeno no
es fijo. Se acumula poli- - hidroxibutirato. En
condiciones óxicas, se utilizan benzoato, 3-
hidroxibenzoato, L-fenilalanina, acetato, metanol,
etanol, glicerol, L-lactato, L-malato, succinato, piruvato
y glutarato; crecimiento lento en 4-hidroxibenzoato,
fenilacetato, L-aspartato, L-glutamato; no hay
crecimiento en formato, citrato, 2-aminobenzoato,
catecol, gentisato, fenilpropionato, pimelato, D-
glucosa, D-fructosa, hexadecano, o-cresol, p-cresol y
fenol. Bajo condiciones de desnitrificación anóxicas,
benzoato, 3-hidroxibenzoato, 4-hidroxibenzoato, 2-
aminobenzoato, o-ftalato, protocatecuato, fenol, o-
cresol, p-cresol, ciclohexanocarboxilato, 4-
hidroxifenilacetato, heptanoato, caproato, 2-
hidroxibenzaldehído -hidroxibenzaldehído, 4-
hidroxibenzaldehído, 2-hidroxibenzoato, 3-
hidroxibenzoato, 4-hidroxibenzoato, 2,4-dimetilfenol y
4-hidroxi-3-metilbenzoato; crecimiento lento con 3-
metilbenzoato, 2-fluorobenzoato, gentisato,
fenilacetato, fenilpropionato, L-tirosina, L-fenilalanina
y 3-acetato de indol; sin crecimiento en m-cresol, 2-
hidroxibenzoato, 3-aminobenzoato, 4-aminobenzoato,
2-metilbenzoato, 4-metilbenzoato, catecol, resorcinol,
hidroquinona, cinamato, p-anisato, L-triptófano, indol,
etilbenceno, benceno, 3 -clorobenzoato, adipato,
pimelato, D-glucosa, D-fructosa, D-ribosa, lactosa,
ciclohexanol, ciclohexanona, 1,3-ciclohexanodiona,
adipato, pimelato, D, L-mandelato, D, L-4-
hidroximandelato y Alcohol 2-hidroxibencílico.
El contenido de G + C del ADN es del 66% en moles.
Hábitat y país de origen: suelo oxic de Ulm, Alemania
La cepa tipo es la cepa U120T (= DSMZ 14744T)