z ca re Humana Fundamentos y aplicaciones en medicina EDITORIAL MEDICA panamericana >Capitulo INTRODUCCION Relaciones entre factores genéticos, ambientales y el fenotipo. Fenocopias. Utilidad del estudio de gemelos. Caracteres discretos y continuos en la especie humana. Enfoque molecular de la genética humana: del ADN al fenotipo. El problema central de la Genética Med factor genético versus factor ambiental La ciencia de la Genética se ha establecido sobre la base de algunos postulados fundamen- tales, de los cuales el primero es que Ja estructu- ray la funcidén de un organismo dependen de dos tipos de factores: los ambientales y los gené- ticos.' Este postulado esté sustentado por la ob- servacion de toda la escala biolégica, incluida la especie humana: es posible introducir cambios en un organismo (que no serin heredables) por cambios en el entornoy por ejemplo, las plantas superiores, frente a cambios en la cantidad de luz recibida, exhiben importantes diferencias en su desarrollo, desde la cantidad de color dada por la produccién de clorofila hasta la enverga- dura de la planta y su tiempo de floracién; o las variaciones en la alimentacién de los animales, que se expresan en su desarrollo, su peso y su es- tado de salud. Estos cambios son tan evidentes y conocidos que la agricultura se ha basado, hasta tiempos recientes, en lograr mejores rin- des mediante cambios ambientales. En Medici- na, se buses muchas veces cudles eran los agen- tes externos o noxas que pudieran causar enfer- medades. Estos hechos evidentes oscurecieron durante un tiempo el hecho esencial de que los cambios efectuados por el ambiente son cuanti- tativos y que consisten generalmente en las reacciones de las que el organismo es capaz frente a cambios del entorno. Es decir que exis- te, en cada organismo, un plan de desarrollo, gue es heredable y que se concreta en la medi- day forma en que el ambiente lo permite, Estas dlistinciones, entre los cambios del entorno y el plan heredable del desarrollo, con el aspecto nal del organismo, fueron enunciadas por el ge- netista Johannsen (1911) al definir el fenotipo, 0 sea el aspecto de! organismo, tanto macroscé- pico coma microscépico, con todos sus tasgos expresados, externos e intemos, funcionales y lucea, como el resultado de su constitu- cisn genética, o genotipo, heredado de sus pro- genitores, mas los factores ambientales que per- mitieron 0 modificaron la expresién de esa constitucién genética. Es decir: FENOTIPO = GENOTIPO + AMBIENTE 0, més exacramente al referirnos a cambios observados: dec VARIACIONES FENOTIPICAS \VARIACIONES -GENOTIPICAS + WARIACIONES AMBIENTALES En Genética Médica, el problema primario frente a una enfermedad determinada es resolver cul es la identidad y la importancia del factor ambiental y cudl es el de la constitucién genéti- ca (“nurture versus nature”). Hasta hace poco tiempo, la Medicina estuvo orientada a determi- nar las noxas externas pero actualmente se reco- rnoce que en casi todos los rasgos, incluidos los patoldgicos, existe un factor genético. Sin em- bargo, el genotipo y el ambiente se relacionan de una forma compleja. Uno de los ejemplos de2° GENETICA HUMANA Fig. 1-1. Nifo afectado por raquitismo hipofosfatémico (mutacion del gen HYP = PEX, ligado al sexo). Las epifisis de los miembros estén aumentadas de tamatio y son irre- gulares, y los huesos de Ia pierna, arqueados. Un aspecto ‘muy similar tienen tos nitios con deficit de vitamina D (ra- quitismo nutricional o clésico). (Reproducido con autori- zacién de Nora, J. J. Fraser, F. C. y col. Medical Genetics, Principles and Practice, Philadelphia: Lea & Febiger, 4 ed., 1993.) esta complejidad es la existencia de fenocopias, que pueden definirse como rasgos provocados por factores ambientales concretos, que reme- dan los efectos de una alteracisn del genotipo. Fenocopias: raquitismo nutricional y raquitismo hipofosfatémico El raquitismo clasico es una enfermedad por déficit nutricional, muy frecuente en los nifios pequefios hace varias décadas pero rara en la ac- tualidad, determinada por una deficiencia de vi- tamina D o calciferol. Un precursor de esta vita- mina es sintetizado en la piel por accidn de la luz de corta longitud de onda, pero en los paises de latitudes altas es necesaria una ingestion adicio nal de la vitamina, La vitamina contenida en alimentos es absorbida en el intestino como precursor de la forma activa, acoplada a protef- na sérica y modificada en el higado. Luego sigue su trayecto al rifién donde finalmente es produ- cida la forma activa, el 1,25-dihidroxicolecalci- ferol (calcitriol). Este compuesto actita por me- dio de receptores en la mucosa intestinal, favo- reciendo la absorcién de calcio alimentario y, a nivel del tejido éseo, movilizando iones de cal- cio desde el hueso hacia el plasma, de modo que tiende a remontar la concentracién de calcio hasta su nivel normal. En el hueso en forma- cién, el producto de las concentraciones de Cat y de fosfato debe pasar un umbral determi- nado para que se produzca el depdsito normal de fosfato caleico (como hidroxiapatita) en el tejido sin mineralizar; la forma activa de la vi- tamina D, al llevar la calcemia a su nivel nor- mal, favorece este proceso de mineralizacién. En caso de déficit de esta vitamina en los ali- mentos (0 de iluminacién), el hueso se calcifi- ca menos y en forma irregular. Este proceso es sobre todo visible en las epifisis de los huesos, que se presentan hinchadas y deformadas, y en los extremos de las costillas; ademas, como el hueso est menos calcificado, los huesos largos pueden arquearse, lo que le da al paciente un as- pecto caracteristico (fig. 1-1). Un aspecto similar puede ser producido por una mutacién génica de un gen conocido, loca- lizado en el cromosoma X y que produce el ra- quitismo hipofosfatémico. Cuando el genetista observa un cuadro producto de un factor am- biental, que reproduce el efecto de una muta- cién génica, se lo denomina fenocopia (en el sentido de ser una copia fenotipica del efecto de una mutacién). El raquitismo hipofosfatémico en realidad no es un raquitismo, sino una hipo- fosfatemia genética que reproduce sus sintomas; no tiene relacién alguna con la vitamina D, a la cual es completamente insensible. El gen alte- rado es HYP (sigla en inglés de hypophosphate- mia), llamado actualmente gen PEX (véase pa- nel 1-1), y se lo ha localizado en el brazo corto del cromosoma X, en Xp22 (véase cap. 7).4 En el raquitismo hipofosfatémico, el origen de la enfermedad estriba en la insuficiencia de as células de los tibulos renales en reabsorber el ion fosfato del ultrafiltrado glomerular; el defec- to se encuentra a nivel del ribete en cepillo y es especifico para el fosfato; es causado por el défi- cit del producto codificado por el gen HYP, dé- ficit que es total para el varén, puesto que el gen reside en el tinico cromosoma X (véase cap. 8, Ligamiento al X). El bajo nivel de fosfato tiene, enel hueso, un efecto semejante al descenso del calcio en el raquitismo clésico, con defectos enINTRODUCCION 3 a a Fig. 1. Genealogia de varios pacientes con raquitismo hipofosfatémico. La mutacién es dominante? Panel. 1-1. Gen PEX (HYP). Responsable del raq ismo hipofosfatémico. No siempre el avance de la Genética Molecular és lineal. El gen humano responsable de la hipotosfatemia (HYP), durante el proceso de su estudio, mostré imprevistamente que contiene la codificacién de una proteina de tipo endopeptidasa neutra. Esta proteina es una metaloproteasa porque se une a atomos de zinc. Por lo tanto, se le dio el nom- bre de PEX (de Phosphate, Endopeptidase, cromosoma X) 0 FEX, en castellano. El gen FEX = PEX posee 22 exones, ocupa unas 220 kb y su ADNc posee un marco abierto de lectura (véase cap. 4) de 2.247 pb que codifica la proteina de 749 aa y que posee tres fegiones: 1) una region intracelular corta, 2) una regién intramembranosa, que atravie- sala bicapa de la membrana cellar, y s).un region extraceluler con los “motivos” que coordinan atomos de Zn. Su funcion no es bien conocida, aunque se supone que cata- liza la conversion de una roteina transportadora de fostato y de sodio, Se han encon= trado mutaciones puntuales de este gen en pacientes con hipofosfatemia (fig. 1).2 la calcificacion del tejido osteoide, permanencia del cartflago hipertréfico sin calcificar y, final- mente, las deformaciones seas del raquitismo. Si bien el aspecto de los pacientes es muy si- ilar, los datos de laboratorio, el efecto de la vi- tamina D y los antecedentes familiares permiten distinguir ambos cuadros. Ademiés, existe otra er fermedad hereditaria similar, no ligada al sexo, que se origina en una mutacién autosdmica del gen de la enzima que origina la forma activa de la yitamina D. Esto muestra que no sélo las catsas ambientales pueden simular el efecto de una mu- tacién, sino que para un fenotipo puede haber va- tios orfgenes genéticos, provenientes de mutacio- nes de genes distintos; es decit que existe, en ge- neral, una heterogeneidad de causas genéticas, entre enfermedades reconocidas como hereditarias. Fenocopias en malformaciones: efecto de la talidomida y amelias genéticas Entre 1958 y 1963, en varios paises euro- peos, y en Canad y Australia, ocurrié una epi- demia de malformaciones graves en recién na- cidos de madres que inadvertidamente habjan sido medicadas con talidomida en las semanas 4 a 6 del embarazo. Muchos de los bebés presen- taban defectos de los miembros, parciales o to- tales (meromelias o amelias) (fig. 1-2 A), que se asemejaban al efecto de algunas mutaciones h reditarias. Este tipo de mutaciones es de muy baja frecuencia y han sido estudiadas cuidadosa- mente en algunas familias Una de estas enfermedades por mutacién es la aquiropodia, detectada y estudiada en Brasil (fig. 1-2 B). La aquiropodia consiste en la ausencia congénita de manos, pies y antebrazos, con atro- fia de las partes proximales de los miembros y que no involucra darios en otras regiones del organis- mo. Esta enfermedad se hereda con carécter au- tosGmico (es decir, residente en cromosomas no sexuales) y recesivo (véase cap. 6). Dicha ano- mala, descrita en familias de otigen portugués, es muy rara, con una frecuencia estimada en 1 cada 3,3 millones de personas. Otras mutaciones, también raras, causan la falta completa de uno 0 més miembros (amelia). Precisamente la muy baja frecuencia de estas malformaciones y su in- cidencia mayor en ciertas familias es lo que Ilevs4 GENETICA HUMANA 1-2. A. Paciente afectado por el efecto de Ia talidomida durante la gestacién. B. Paciente afectado por la mutacién determinante de la aquiropodia, (A. Reproducida con autorizacién de Langman (Sadler). Embriologia médida, 7 ed., Feitorial Médica Panamericana, 1996. B. Reproducida con autorizacién de Buyse ML [ed], Encyclopedia of Birth Defects, ‘New York: Blackwell Sci. Publications, 1990).* asospechar que la epidemia de 1958-1963 podria ser un efecto ambiental (la medicacién recibida). Interpretacién de las fenocopias Muchos otros cuaclros patolégicos heredita~ rios comparten los signos (aunque no todos, por Jo general) con ottos que tienen un origen dif rente; en cada caso un cuadro tiene un origen, claramente ambiental, y otro, parecido, es here- ditario. Asf, la sordera congénita puede estar de- terminada por una mutacién, o ser parte de un. cuadro determinado por una mutaci6n, como en el sindrome de Waardenburg (véase cap. 13), y en otros casos puede ser el resultado de 1a admi- nistracién de estreptomicina en dosis altas du- rante 1a gestacién o formar parte de las altera- ciones fetales inducidas por el virus de la rubéo- la. La conclusién de estas observaciones es que Ja discriminacién entre causas genéticas y causas ambientales siempre se debe tener en cuenta frente a un cuadro de etiologia desconocida. Caracteres discretos y caracteres cuantitativos Habitualmente, en Genética Médica se estu- dian caracteres o rasgos claramente clasifica- hiles, en general una enfermedad o un sindrome, en comparacién con una persona sana. Estos caracteres se pueden definir por su presencia 0 su ausencia y, en tiltima instancia, la hipdtesis habitual consiste en asignar la presencia del ras- g0 patologico a un gen, o factor hereditario res-INTRODUCCION 5 ponsable de esa enfermedad. Esta hipdtesis ge- neral, que comienza con Gregorio Mendel, se ha desarrollado extraordinariamente, en espe- cial en los tiltimos afios, mediante el uso de las téenicas de la Genética Molecular, que han concretado la asignacién de muchos cuadros patoldgicos a segmentos definidos y bien locali- zacos del ADN humano (véase cap. 3). La transmisién hereditaria de estos rasgos patolégi- cos asignados a genes concretos es bésicamente la que obedece a las reglas de Mendel, por lo cual la herencia de este tipo de caracteres dis- cretos (también Iamados discontinuas) es mendeliana y, como usualmente es un solo gen el responsable del rasgo, también es llamada “monogénica”. Algunos ejemplos de enferme- dades de herencia monogénica, como la enfer- medad de Huntington, las hemofilias A y B, las neurofibromatosis I y II y otras, serén explora- dos en los capitulos siguientes. Otro tipo de rasgos heredables son, por ejem- plo, la estatura, el color de la piel, el cociente intelectual y la presidn arterial. Esos rasgos son medibles (por lo que se denominan métricos 0 continuos) y son estudiados por métodos esta- disticos, bien desarrollados en la Biometria. Ellos han dado lugar a la disciplina de la Gené- tica Cuantitativa (pot lo que también se habla de herencia “cuantitativa”). La diferencia entre la genética de los rasgos métricos y la de los ras- gos monogénicos es slo metodoldgica; en rea- lidad, los rasgos cuantitativos derivan de la ac- cidn. combinada de wasies genes, 049 oxah agrega el factor ambiental (como en los mono- xenicos), 10 que resiilta en patrones de herencia que no son mendelianos. En estos casos se ha- bla de “herencia poligénica”, “herencia cuanti- tativa” y también (con algunas especificacio- nes, véase cap. 10) de “herencia multifactorial”. Muchas enfermedades, en las cuales no hay un patron claro de herencia, pero sf una incremen- tada recurrencia familiar, son supuestamente causadas por “herencia poligénica” o “herencia multifactorial”; tales son los casos de la diabetes mellitus de tipo 1, la hipertensién esencial, la esquizofrenia y muchas otras enfermedades de importancia en medicina. El estudio de la Genética Cuantitativa res- pecto de la etiologia de rasgos o enfermedades que no tienen patron mendeliano de herencia, es esencialmente provisorio, dado que se espera que el futuro conocimiento del total de las se- cuencias del ADN humano (véase cap. 4) per- mita asignar el origen de las enfermedades poli- g€nicas a grupos de genes concretos y, ademas, se podran establecer las relaciones entre ellos y con el factor ambiental. En la actualidad, el estudio de los caracteres cuantitativos y de las enfermedades que se supo- nen de herencia poligénica es més diffcil y est menos adelantado que el estudio de los raspos patoldgicos discretos con patrones de herencia mendeliana (las que tienen proporciones men- delianas en la progenie, segregacisn, dominan- cia y recesividad, etc.). El estudio de las enfermedades poligénicas y “rasgos complejos" se realiza mediante una combinacién de métodos biométricos, clinicos y de genética molecular en animales de experi- mentacién y en personas. Entre estos métodos se cuentan los estudios en gemelos, los datos de epidemiologfa genética acerca del riesgo relati- vo de recurrencia en familiares del afectado, la restricci6n del estudio a los casos clinicos mas severos y mejor definidos de cada tipo de enfer- medad y el andlisis de ligamiento (véase cap. 8). Este estudio se realiza actualmente mediante la biisqueda de los genes causantes de enfermeda- des homélogas en animales.® Este iiltimo enfo- gue se basa en la mayor facilidad para lograr ubicar genes en animales cuyas cruzas pueden set controladas y Ilevadas a cabo en grandes cantidades; si se localiza un gen en un animal, se lo afsla como un segmento de ADN (véanse caps. 2 y 3), y luego, dada la presencia de un im- portante grado de “conservacién genética” en- tre mamfferos, se investiga la presencia de un gen homélogo en la especie humana, mediante las potentes herramientas derivadas de la hibri- ackbon he Serdos mudheicos (ease cap.) Gemelos monocigéticos. Su uso en la determinacién del factor hereditario Uno de cada 87 nacimientos en promedio, en [a raza blanca, corresponde a mellizos; de ellos, un tercio son monocigéticos, es decir que aproximadamente 1 de cada 290 nacimientos es uun par de gemelos monocigéticos. La diferencia fundamental entre los gemelos monocigéticos y los dicig6ticos (fraternos o mellizos comunes) es que los primeros comparten el mismo genoma, por ser derivados de una misma célula huevo, mientras los segundos son, desde el punto de vis. ta genético, simples hermanos y, como tales, comparten én promedio sdlo el 50% de los ge. nes. Los gemelos monocigéticos son titiles para la Genética debido a que son un experimento genético natural: todas sus diferencias se deben, en principio, exclusivamente a factores ambien. tales. Ademas de ser ttiles pata medir directa mente el efecto del factor ambiental, que se ex-6 GENETICA HUMANA presa en una medida estadistica de los cambios ‘ocasionados por el ambiente (varianza ambien- tal), se ha tratado de extender la utilidad de los gemelos para medir los cambios debidos al geno- tipo (varianza genotipica), aunque esta viltima ‘es menos confiable. Los gemelos monocigéticos son del mismo sexo y presentan un parecido fi- sico obvio, en especial de los rasgos que son mas Claramente de origen genético, como la colora- cidn del iris y el tipo de cabello; fundamental- mente, expresan su genotipo idéntico al com- partir numerosos marcadores bioquimicos, como el grupo sanguineo, polimorfismos enzimaticos y polimorfismos de ADN (véase cap. 8), y morfo- Togicos: su cariotipo es idéntico, y sus dermato- elifos (véase més adelante) son parecidos, aun- que no idénticos; desde el punto de vista médico sus tejidos son intercambiables en trasplantes, ya que son inmunolégicamente idénticos. Cuando se usan gemelos para determinar la importancia de los factores genético y ambien- tal, se clasifican los rasgos en dos grandes cate- gorias: los rasgos cuantitativos, que son los medi- bles, y los rasgos discontinuos 0 cualitativos, que se aprecian por su presencia o su ausencia. Los rasgos cuantitativos pertenecen a la Genética Cuantitativa y a la Biometria; son ejemplos la estatura, el color de la piel medido en reflectan- cia, los coeficientes intelectuales y los recuen- tos de crestas dérmicas de los dermatoglifos. Los rasgos cualitativos se refieren, en Genética Mé- dica, a la presencia o ausencia de una enferme- dad o un signo patolégico. En el estudio de la importancia de los facto- res ambiental y genético en los gemelos, es con- veniente considerar separadamente los rasgos métricos o cuantitativos y los discretos. Respec- to de los primeros, el objetivo es comparar la Variabilidad del rasgo en los monocigéticos res- pecto de los dicigéticos o fraternos; para ello, se evaltia Ia varianza en cada serie (monocigsticos y dicigéticos). La varianza (medida estadistica) es V = SAN, donde N es el ntimero de pares y «dQ es la diferencia de cada medicién con la me- dia de ese conjunto. Las diferencias, estimadas por las varianzas, entre los pares de monocigéticos y los pares de fraternos pueden indicar, en principio, la im- portancia telativa del factor genético, puesto que tedricamente los monocigaticos sdlo difie- ren por factores ambientales, y los fraternos, en cambio, tienen dos fuentes de variacién: la ge- nética (sélo poseen el 50% de genes en comtin, en promedio) y ademés el factor ambiental. De alli se ha propuesto una “partici6n de la varian- za”, en la cual la de los monocigéticos, Vay € joual a la varianza debida al ambiente, V,, y la varianza de los fratemnos, Vi es: Viz 'h Va + Vow donde V, es la varianza genética (considerada Vs respecto de la poblacién general, ya que comparten el 50% de sus genes). Si se resta la varianza de monocigéticos de la de fratemos, se obtiene: Vir Var Ve de donde se mide la varianza genética; y si se la compara con la total, se obtiene una medicién de “*heredabilidad” (FH) del rasgo: vy (Ve Va) La “heredabilidad” ast concebida ha sido usada para estimar el factor genético en la esta- tura (alrededor del 80%), en el peso del adulto fen cada sexo (muy baja) y en el coeficiente in- telectual (Binet) (dispar, entre 80% y muy ba- ja). Los resultados son generalmente ambiguos, debido a las varias fuentes de error en este pro- cedimiento, que deberia ajustarse a critetios es- fadisticos estrictos para no dar resultados irre- levantes."® En general, esta “particién de la vi rianza” tiende a exagerar la importancia del factor genético (“heredabilidad”); por ejemplo, en las mediciones de cociente intelectual, si los gemelos monocigéticos reciben un trato mas parecido que el de los fraternos (como general mente es el caso), la varianza ambiental no es la misma que para los fraternos, y la f6rmula no es exacta, lo cual esta de acuerdo con los datos de gemelos monocigétices criados en forma separda, De todas maneras, puede admititse ue esta “heredabilidad” sugiere una tendencia, en especial para los rasgos fisicos bien definidos como la estatura, Respecto de los rasgos cualitativos, se deno- mina concordancia al grado en el que los geme- os presentan el mismo rasgo o enfermedad; y discordancia, al grado de diferencia entre ellos respecto de ese rasgo. La presencia de numero- sas enfermedades sospechadas de herencia po- ligenica o multifactorial ha sido estudiada en gemelos. Para ser relevantes, los datos deben ser corregidos respecto del método de diagnés- tico o clasificacién de la enfermedad usado en cada caso y, ademas, se deben cumplir otros re~ quisitos, De las diferencias de concordancia entre la serie de monocigéticos y la de fraternos, se pue- de también estimar la “heredabilidad”, que muestra tendencia a ser alta en ciertas enferme- dades como la hipertensién arterial, la diabetes, la esquizofrenia, la psicosis manfaco-depresiva y el paladar hendido (fig. 1-3) HINTRODUCCION 7 100 90 80 70 50 40 30 20 10 Infeccign aguda letal woo 90 «80 70—CO Asma bronquial Hipertensién arterial Reumatismo poliarticular agudo lad de enfermedades Val(Vg + V.) Psicosis maniaco-depresiva Luxacién congénita de cadera Paladar/labio hendido Artrtis reumatoidea Cancer (de una localizaci6n) Cr a a Factor ambiental (% relativo) Fig. 1-3. Escala de ta “heredabilidad” (definida en el texto) de algunas enfermedades. (Datos de Cavalli-Sforza y Bodmer.)* Herencia de caracteres cuantitativos. Dermatoglifos Los caracteres cuantitativos son heredables, de la misma manera que los discretos, puesto que unos y otros estsin codificados en el ADN del niicleo celular. Sin embargo, la herencia de los caracteres cuantitativos no aparenta regirse por las leyes de Mendel, simplemente porque estas leyes se refieren exclusivamente a carac- teres determinados por un solo gen, y los carac- teres cuantitativos estén determinados por més de un gen (de ahf el nombre de herencia poli- génica). YN LN Un ejemplo ilustrativo de la herencia poligé- nica, de importancia en Medicina, es la de los dermatoglifos, que son los patrones de dibujo de las crestas dérmicas en los dedos, en las palmas y plantas, y que dan lugar a las huellas digitales usadas para la identificaciGn de personas. Cada cresta de la piel en estas zonas est formada por la sucesi6n lineal de las desembocaduras de las glindulas sudorfparas, que es posible observar con lupa como una hilera de orificios a lo largo de la cresta. Las crestas se disponen segin dibu- jos especificos, que se pueden clasificar en tres tipos principales: 1) arcos, 2) presillas 0 asas y 3) verticilos o remolinos (fig. 1-4). Las crestas Fig. 1-4. Esquema de los tres patrones principales de dibujos de crestas dérmicas. A. Arco (no tiene trirradio). B. Pre- silla (= asa); tiene 1 trirradio (horqueta). C. Verticilo; tiene dos trirradios. Las lineas unen cada trirradio con el centro del dibujo y sirven para el “recuento total de crestas”.a 8 GENETICA HUMANA Frecuencia 0 140 Recuento total de crestas dérmicas se forman en el embrién temprano, entre la semana 13 y la semana 15 del desarro- Ilo; una ver formadas las crestas, los dibujos re- sultantes de las crestas permanecen inalterados pot el resto de la vida. No se evidencia précti- camente ningtin factor ambiental en el desarro- Ilo de estos dibujos, puesto que en los gemelos monocig6ticos el recuento de crestas es muy si- milar. La cortelacin entre las medidas de cres- tas dérmicas (“recuento total de crestas”, véase més adelante) entre gemelos monocigsticos es del 95%, y el 5% restante s6lo puede asignarse a varianza ambiental durante la época embrio- aria, es decir, durante la formacién de las cres- tas.!° Recuento total de crestas. Variaciones patolégicas Los dibujos formados por las crestas se clasi- fican en los tres patrones principales, que se ca- racterizan por el mimero de tritradios. Se deno- mina “trirradio” a una bifurcacién en forma de horqueta de una cresta; cada trirradio separa Total de crestas (en varones) Fig. 15. Distribucién casi gaussiana del recuento total de crestas en varones. La curva normal (Gauss) esté en pun- teado. Este tipo de distribucién es tipico para los caracteres de herencia cuantitativa (datos de S. B, Holt). tres regiones de crestas y su posicidn es relativa- mente constante. Los arcos no tienen trirradio, las presillas tienen uno y los verticilos habitual- mente tienen dos. La linea extendida entre un, tritradio y el centro del dibujo define el lugar y el niimero de las crestas que se cuentan, es de- cir, todas las erestas que cruzan dicha linea. Pa- ra obtener el valor del “recuento total de cres- tas” (RTC) se suman todos los ntimeros obteni- dos en los diez dedos. Este recuento es una cifra estadistica importante e invariable respecto de la edad. Es distintiva la diferencia entre sexos la media del RTC en varones de raza blanca es 144, y la media en mujeres es 127. La distribucién de este recuento (RTC) en una poblacién varia entre 0 y 300, y tiene una distribucién précticamente acorde con la curva “normal” (o de Gauss, en Estadistica) salvo su sesgo negativo (a la derecha). Este tipo de dis- tribucién “normal” o gaussiana es tipica de los rasgos de herencia cuantitativa (en teoria, puesto que en la practica hay desviaciones) (fig. 1-5). La herencia del recuento total de crestas es tipica: de padres a hijos, se transmite una simi-INTRODUCCION 9 laridad del 50%, es decir que coincide con la proporcién promedio de genes comunes entre tun progenitor y un hijo. Esto es demostrado por el coeficiente de correlacién de los recuentos en una serie de pares progenitor-hijo: este coe- ficiente es de 0,48 0 0,49."° El coeficiente de correlacidn entre gemelos monocigéticos es 0,95 y el de dicigéticos coincide con el de her- manos (0,49) EL RTC esta alterado en un ntimero de cro- mosomopatfas (véase cap. 14); en especial, es notable su alteracién en las polisomfas sexuales, en las que, a medida que el nimero de cromoso- mas sexuales aumenta, el RTC disminuye, con una tasa de aproximadamente 30 crestas menos por cada cromosoma X o Y excedente."! La interpretacién de la herencia del RTC y variaciones posiblemente estriba en sui codi- ficacidn en un ntimero no muy grande de genes (pero por lo menos 5 para dar un patrén casi normal en las distribuciones) que operan en el embriGn en las semanas 13-15, cuando se esta- blecen estas crestas. Un posible codificador puede ser una de las familias de genes HOX, que intervienen en el desarrollo de los miembros (véase cap. 13). Estos genes, para determinar un cardcter cuantitativo como el RTC, deben ope- rar aditivamente, es decit que cada uno de ellos contribuye con una porcién relativamente pe- quefia del toral de crestas. No hay mayores dife- rencias de potencia entre ellos, y se excluye la dominancia de uno sobre otros. En realidad, es posible que esta sumatoria de efectos parciales esté compuesta por aportes desiguales, que se nivelan por interacciones con otros genes. Este tipo de interpretacién es valida para otros ras- gos poligénicos y, en especial, para enfermeda- des de origen hipotéticamente poligénico. Alteraciones de los patrones de dibujo en los dermatoglifos Ademés del recuento total de crestas, los di- bujos de los dermatoglifos tienen valor acceso- tio para el diagndstico de cromosomopatias, en especial el sindrome de Down (véase cap. 14), para casos de retardo mental en los cuales se de- be precisar si la causa es ambiental o genética. Los dibujos, la posicién de los trirradios y otras particularidades son usados como. caracteres cualitativos (ausencia o presencia, localizacién después de un limite) o también en forma nu- mérica, asignando un valor diagnéstico a cada ftem.!2"" Los dibujos de las yemas de los dedos tienen frecuencias caracteristicas; los mas co- ‘munes son presillas hacia el lado cubital (las presillas se clasifican por el lado al cual se abren, radial y cubital o distal). Cuando hay una alta frecuencia de arcos en los dedos (més de seis), se puede sospechar la trisomia del cromosoma 18 (véase cap. 14). Los dibujos palmares y plantares son indica- dores de valor en el sindrome de Down. En la palma, en la base de los dedos, las cuatro regio- nes basales de los dedos 2-5 (indice-mefique) tienen trirtadios que pueden desplazarse en casos patoldgicos pero el dato de mayor importancia es la localizacién del mirradio axial, normalmente muy cerca del pliegue de la mufieca en la base de la mano (fig. 1-6) y desplazado distalmente en el sindrome de Down. Ademas, se observan los pliegues de flexi6n (no son dermatoglifos, son lu- gares de fijamiento de la piel a la aponeurosis), que usualmente son tres, dos transversales y uno en la base de la eminencia tenar. En el sindrome de Down, es muy frecuente que los dos transver- sales estén reemplazados pot uno solo, llamado B c Fig. 1-6. A. Dibujos palmares normales. B. Cresta o pliegue simiano (cs) y trirradio axial t”, desplazado distalmente en el sindrome de Dovm. C. Arco tibial plantar en el sindrome de Down.10 GENérica HUMANA Yah Fig. 1-7. Mapa de segmentos del cromosoma Y, realizado sobre la base de las pérdidas (deleciones) de sus regiones, y locatizacién del factor de crecimiento del Y (FCY), uno de las genes responsables de la estatura. Otro gen importante para el desarrollo de la estatura, el gen SHOX, se localiza en ta regién pseudoautosémica (RPA). Las caracteristicas del brazo corto (Yp) y det targo (Yq) se explican en el Cap. 7. “pliegue simiano”, aunque disminuye un poco su valor diagnéstico porque alrededor del 54% de los controles normales pueden tenerlo. La linea de Sydney es un pliegue (proximal) que se extiende hasta el borde cubital de la mano. Respecto de las plantas, el dibujo normal mas frecuente es una presilla distal. El reempl 20 del dibujo normal por uno muy simple, el ar- co tibial (sin trirradio) es valioso para el diagnés- tico del sindrome de Down (el coeficiente de su frecuencia, respecto del normal, es casi 150) Otros caracteres cuantitativos. Gen para la estatura en el cromosoma Y La localizacin y el aislamiento de los genes codificantes de caracteres cuantitativos son mu- cho mas dificiles que los de los caracteres discre- tos. En el caso de la estatura, que es un cardcter cuantitativo muy estudiado en Biometria, se su- perponen los efectos de varios genes y, ademas, Jos efectos ambientales. Sin embargo, numerosas cobservaciones apoyan la hipétesis de la localiza- cidn de un gen para la estatura en el cromosoma Y, que agregaria un efecto significativo a la ac- cin de otros genes de la estatura. Los varones, con cromosomas XY, son mas altos que sus her- manas, XX; en promedio, también son més altos que los varones anormales con cromosomas XX (véase cap. 7). Los varones con cromosomas XYY (véase cap. 14) son a su vez mas altos, en. promedio, que los varones XY normales. Tam- bign los pacientes con disgenesia gonadal y cro- mosomas XY (véase cap. 7) son mas altos que los pacientes con esa disgenesia y cromosomas XX.!" Sobre esta base, se ha tratado de localizar un factor de crecimiento de la estatura en el cro- mosoma Y. Ademas, se ha tenido en cuenta que el tamaiio de los dientes tiene estrecha correla- cién con la estatura y también hay indicios de la presencia de un gen para el desarrollo dental en este cromosoma Y. Recientemente, se ha locali- zado esta funcién en la regién proximal del bra- zo largo del cromosoma Y."" En este estu observaron 15 pacientes con diferentes (en ge~ neral) pérdidas de sustancia (deleciones) del cercimosoma Y y el lugar de las rupturas y la pre- sencia de “marcadores” o hitos se determiné me~ diante una técnica molecular (RCP, véase cap. 2). El cromosoma puede subdividirse en seg- mentos, de los cuales los 1 a 4A corresponden al brazo corto, 4B al centromero y los siguientes (5 a7) corresponden al brazo largo (fig. 1-7). Las pérdidas de sustancia del Y correlaciona- das con disminucién de estatura son las que in- cluyen un segmento cercano al centrémero, en los subintervalos 5A-5E. Este gen entonces es- tarfa localizado en la region Yql1.21." Resulta demostrativo que los ensayos de localizacién se hhagan por este método; los estudios de liga- miento (véase cap. 8) son poco titiles cuando se estudia un cardcter cuantitativo. Generacion de caracteres continuos a través de la segregacién de varios genes cooperativos: color de la piel humana Un cardcter continuo, como la estatura 0 el recuento de crestas dérmicas, es el resultado de la accién de més de un gen, con el agregado del factor ambiental, como es el caso'de la estatura. Otro carécter continuo es el color de la piel en la especie humana, que también est condicio- nado por vatios factores genéticos y factores ambientales. No se conoce el ntimero exacto de genes que intervienen en el color de la piel, aunque se ha postulado que pueden ser tres 0 cuatro. Como es la regla en la herencia de ca- racteres continuos, se postula que cada gen tie- ne un efecto parcial sobre el color final, que los efectos de diferentes genes son aditivos (se su- man), que no hay dominancia de un gen sobre otros, ni otto tipo de interferencia mutua entre los genes. Ademas, para esquematizar este tipo de herencia, se postulan algunas presunciones sobre la poblacién: que las cruzas (casamientos)INTRODUCCION 11 Negro Blanco Padres (homocigotas) cici xX [cteT | Generacién paterma Gametas co ot Hijos (mulatos, heterocigotas) Cici Cioi Filial 1 / \ Gametas C1 a / \ Nietos + 2(Cict) + = [ciet] | | | Frecuencias Negro Mulato Blanco a 2) (1) Fig. 1-8, Esquema de herencia basado en un solo gen de color de ta piel. no son afectadas por el rasgo cuantitativo, es decir que no hay una preferencia por el color, sino que son al azar y que las poblaciones que se analizan se hallan en equilibrio respecto de sus genes. Si se dan por sentadas esas presunciones, se puede analizar cudles son los resultados si el color de la piel resulta de un solo gen 0 de dos genes: el primer gen sera C1 para color oscuro y cl su gen homélogo o alelo para la falta de co- lor; de la misma manera, C2 para el segundo gen de color y c2 para su alelo de carencia de color. De acuerdo con las reglas de Mendel, en el pri- ‘mer caso (un solo gen determina el color) y con- siderando que los padres son puros para el gen, es decir que sus dos genes alelos son idénticos (condicién Iamada “homocigota”), el esquema de herencia seré e] observado en la figura 1-8. Este esquema, basado en un solo gen de co- lor de la piel, Ilevarfa a una transmisién mende- liana con la aparicién de clases segregantes pu- ras (negro puro y blanco puro) en la tercera ge- neracidn, y con frecuencias del 25%, lo cual no corresponde a la realidad. El segundo esquema, basado en dos genes de color, da los resultados presentados en la fi- gura 1-9. Como se observa, en este esquema de dos ge- nes, en la tercera generacién también se segre- gan los tipos puros, pero en menor proporcién (hg), se crean clases intermedias de color de piel y el maximo de frecuencia corresponde a mulatos. Si se procede igual con un esquema de eres genes para color, las clases de descendencia en la filial II (tercera generacién) serdn siete (se crearon nuevas clases intermedias), y slo oy €3 la frecuencia de una clase pura (blanca o ne- gra), mientras que se han suavizado las diferen- Cias entre clases que se producen con las fre- cuencias: 1, 6, 15, 20, 15, 6 y 1, entre las extte- mas negra y blanca Si se realiza un gréfico de cada uno de los es- quemas, es posible ver que a medida que au- menta de 1 a 3 el ntimero de genes involucta- do en el rasgo, la distribucién del rasgo (clases de color de la piel) se aproxima a una distribu- Padres CACIC2C2 x etcic2c2 Generacién paterna Gametas c1c2 c1c2 Hijos (mulatos) CiC2 tee x C102 cte2 Filial | oe ee ae 2 eee Gametas C1C2 Ctc2 ciC2 cic2 cic2 Cic2 c1C2—cle2 Nietos C1¢2 C2c2 CiC2c2c2 | + (Crotc2ce |+[C1C1c2c2) + [etetc2c2|+[ ctetc2c2 | | C1c1C202 +[etctc2ce| + [Cictcaca| | | | Filial Negro “I, Negro Mulato Mulato | %f, Blanco Blanco a) (4 ©) @) (a) Fig, 1-9. Esquema de herencia basado en dos genes de color de ta piel.12° GENETICA HUMANA — « Ly 02 03 Intermedio Negro cidn parecida a la curva de Gauss (véase an- tes), que es caracteristica de los rasgos conti- nuos (fig. 1-10). Sia esto se le agrega la varia- cién introducida por el ambiente, se suavizan aun més las diferencias entre clases, y se tiende a.una distribucién continua. Como se mencioné antes, la localizacién de genes de caracteres continuos no es sencilla, y su estimacién por métodos estadfsticos puede ser ambigua.' Sin embargo, dada la importancia de las en- fermedades que se suponen de naturaleza poli- génica, como la diabetes, la hipertensién arte- tial y otras, estos datos han sido importantes pa- ra guiar la busqueda de los genes respectivos mediante las técnicas moleculares. Complejidad en la relacién entre genes y caracteres: pleiotropia y penetrancia La relacién entre genes y caracteres no es necesariamente: un gen = un caracter; general- mente es més compleja, dado que los genes son segmentos de ADN que codifican una protefna (véanse caps. 3 y 4), y una protefna general- mente tiene efectos sobre varios tejidos u Grga- nos del organismo. Cuando la alteracién de un gen determina efectos en varios drganos y fun- ciones, aparentemente desvinculados, se habla del efecto “pleiordpico” de ese gen. Los efectos pleiotrépicos son comunes y encuentran su ex- plicacién en las distintas funciones de una pro- teina. Por ejemplo, uno de los genes del colage- no, el COLIAL, se encuentra alterado en la en- fermedad llamada osteogénesis imperfecta, carac- terizada por fracturas esponténeas (por defecto Fig. 1-10. Gréfice de te me a flectancia color de la piel) em in dearer dencia a parti res (P) puros pare color de la co, consider 0.4 05 endo, de W. F. Bodmer Cavalli-Sforza, Genetics Eee lution and Man, San Francie (9, W. H. Freema’ del coligeno en el hueso), color azulado de be esclerstica (por deficiencia de colageno en be esclerotica) y sordera congénita (por alteracsée: del colageno en Ia cadena de huesecillos del o& do medio). Mas dificultades son causadas por la denoeni- nada “penetrancia” incompleta de un gen: est es, que el efecto del gen puede estar presente si lo en un porcentaje determinado de las pers nas portadoras de ese gen. La penctrancia <= completa (100%) cuando siempre se observa el efecto en el fenotipo, ya sea cuando ¢s um gem dominante (con un solo gen alterado presente). ‘o cuando es recesivo (con dos genes alterados). Hay numerosas enfermedades mendelianas ox yos genes causantes tienen penetrancia incom pleta. En el ejemplo citado antes, el gen causam te del raquitismo hipofosfatémico presenta pe- netrancia incompleta en las mujeres portadorss del gen, que sdlo en pocos casos muestram de- formaciones éseas; sin embargo, los miveles de fosfato en la sangre estan alterados, de mode que la penetrancia incompleta se manifiesta em el aspecto pero no en los datos de lsborstore Otra raz6n de penetrancia incompleta es laapa- ricién de sintomas a edad variable, por eyemple en la corea de Huntington (véase cap. 6). Alles ‘nas personas que portan este gen dominante llecen antes de llegar a la edad de desarrollo de los sintomas y son anotados como casos “ness tivos”. Es probable que la causa mas frecsent de penetrancia incompleta sea la interaccan génica entre el gen mutante y otros genes que forman el “trasfondo genético” de cada persona. que es variable en miembros de una masma milia, Un gen mutante puede ve i expresin cuando éta se encueINTRODUCCION 13 por factores de transcripcisn diferentes en dis- tintos miembros de la familia (véase cap. 4). En general, la penetrancia incompleta se observa con genes dominantes, lo cual hace que esa do- minancia parezca irregular Se dice que un gen tiene expresividad variable cuando el cuadro ocasionado por este gen com- prende rasgos que aparecen con intensidad va- riable o en edades variables; de esta manera, la aparicin de sintomas de ‘la enfermedad ‘de Huntington a edades variables es también un ejemplo de expresividad variable. Muchos cua- dros de enfermedades hereditarias presentan rasgos de expresividad variable. Nuevamente, esta variabilidad fenotfpica puede no corres: ponderse con variabilidad en el nivel molecu- lar; por ejemplo, en la anemia falciforme los sintomas pueden ser variables pero el tipo de proteina anormal (hemoglobina S; véase cap. 12) esta siempre presente en los enfermos. En general, puede interpretarse que estos fendme- nos a nivel del fenotipo son explicables por los mecanismos de operacién de los genes, y los nombres de penetrancia, expresividad y efectos pleiotropicos generalmente encubren el desco- nocimiento del mecanismo de accién de ese gen particular o de su proteina. La heterogeneidad genética de enfermedades hereditarias En las diltimas décadas se ha afirmado la idea de que la mayor parte de las enfermedades here- ditarias son entidades de origen miltiple; es de- cir que al hablar de una determinada enferme- dad (p. ej, la fibrosis quistica), se debe pensar no en una dnica mutacin determinante de la enfermedad, sino en miltiples mutaciones, ca- da una en un lugar distinto del gen, que alteran su funcién parcial o totalmente. Este tipo de heterogeneidad es llamada “ineraalélica”, porque se trata de diversas mutaciones dentro del mis- mo gen o alelo. Esta heterogeneidad es la regla: hay enfermedades que pueden ser causadas por muchas diferentes (cientos) mutaciones del Transcripcién Procesamiento Traduccion mismo gen, por lo cual se debe investigar el “es- pectro de mutaciones” de cada gen (véase cap. 5), Otro tipo de heterogeneidad es interalélica, es decir que varios genes diferentes pueden origi- nar la enfermedad; un caso tipico es el de las re- tinitis pigmentarias, que pueden originarse en alrededor de media docena de genes diferentes (véase cap. 6) Muchas de estas causas de complicacién de la relacin entre el fenotipo y los genes se han aclarado @ medida que se conoce el mecanis- mo molecular de las enfermedades heredita- rias, por lo cual es conveniente resumir este enfoque molecular de las enfermedades huma- nas. El enfoque molecular de las enfermedades hereditarias; del ADN al fenotipo Basicamente, la Genética Molecular postula que los caracteres hereditarios (discretos y con- tinuos) estén de alguna manera codificados en el ADN del niicleo celular; en realidad, se pos- tula que este ADN codifica proteinas, de cuyo funcionamiento finalmente depende la apari- cidn de dichos caracteres. De esta manera, la re- lacién ADN-caracteres es siempre indirecta y sujeta a su concrecién en el complejo ambiente interno de la célula. Ademis, el proceso de flu- jo de la informacion desde el ADN no es sim- ple, sino que consiste en pasos regulados que pueden set modificados (véase cap. 4). Se tiene entonces una codificacién en los segmentos del ADN, que en un primer paso es transcripta en ARN (transcripto primario); luego este ARN es procesado hasta transformarse en un ARN men- sajero, apto para ser usado como templado en los ribosomas, para efectuar la traduccién de es- ta informacién en una secuencia de aminodci- dos de: una proteina, la cual generalmente es modificada antes de convertirse en una protefna funcional (fig. 1-11) Hasta aquf, la secuencia es muchas veces li- neal, es decir que a segmentos del ADN le co- Reacciones [— metadsiicas ADN ——> ARNh) —e> ARNT ee Proteina ap Regulacién Transcripto primario Integracién de estructuras Fig. 1-11. Secuencia que sigue la informacién genética desde su depdsito en el ADN para su uso en la célula. ARNhn: ARN heterogéneo nuclear 0 transeripto primario,Sem ae 14 GENETICA HUMANA rresponden secuencias de aminodcidos de una proteina codificada. De aqui en adelante, el flujo de la informacién es menos lineal; la pro- teina puede intervenir en diferentes reaccio- nes metabolicas, puede integrar la estructura de algiin organoide o puede ingresar en el n- cleo para actuar como regulador en la decodifi- cacién de otros genes; es decir, puede efectuar miiltiples funciones, incluso afectar la funcién de otros genes diferentes del que la codified a ella. Ademés, las proteinas suelen interactuar y, al hacerlo, estan confluyendo las informa- ciones de dos (o més) genes. Finalmente, la funcién de las proteinas esta sujeta a cambios ambientales que inciden sobre la célula. A pe- sar de esta diversificacisn final, toda la prime- ra parte del proceso, que es lineal, puede abor- darse mediante las técnicas moleculares con gran provecho. En este sentido, el procedi- miento seguido observa generalmente esta se- cuencia: primero, por los datos de transmisién familiar, se trata de vincular el gen causante de Ia enfermedad con algiin “marcador” de un cromosoma y luego se trata de localizarlo en tuna regién del cromosoma; luego se afsla ADN de esa regién, con uno o mas marcadores in- cluidos; ese ADN se investiga para secuencias conservadas en otras especies, como lo son los genes; con posterioridad, uno por uno se iden- tifican los ARN mensajeros transcriptos por cada gen, buscando un ARN de secuencia anormal; finalmente, se trata de correlacionar la secuencia anormal con la presencia de la en- fermedad y se realiza una contraprueba, en una especie animal, inactivando ese gen (“no- quear” el gen) y' analizando qué efectos produ- Ce en el fenotipo. Este tipo de métado se deno- mina a veces andlisis posicional. Aplicacién de las técnicas moleculares: enfermedad de Charcot-Marie-Tooth La enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT) o atrofia muscular peronea es una en- fermedad hereditaria relativamente frecuente (1 en 2.500 nacimientos). Su forma clinica més comin corresponde a una mutacién auto- ‘mica dominante y consiste en una enferme- dad desmielinizante de los nervios periféricos (motores y sensitivos). Hay otras dos formas clinicas menos frecuentes, que corresponden a otros genes diferentes del de la primera for- ma. Los signos de la enfermedad son: debili- dad y atrofia de los misculos peroneos, defor- midad de los pies (pie cavo), conduccién ner- viosa disminuida en el nervio mediano e inci dencia familiar, de patrén dominante. Hay di- ficultades para caminar desde la nifie2; las piernas se van atrofiando y dan un aspecto ca- racterfstica. Ademés, hay atrofia de los mis- culos pequefios de las manos, que pueden ter- minar deformando la mano (en garra), una disminucién notoria de la conductibilidad nerviosa en el nervio mediano y cambios en la transpiracién en los miembros. En algunos pa- cientes, hay hinchamiento de los grandes ner- vios distales de los miembros. En la anatomia patoldgica lo sobresaliente es la desmieliniza- cién de los nervios. Como esta enfermedad no pone en peligro la vida, se han recolectado numerosas genealogias de enfermos, lo que fa- cilita el estudio de la localizacisn del gen. Es- ta se detecté en la regién del cromosoma 17p11.2. Al estudiar el ADN del brazo corto del cromosoma 17, se observé que los enfer- mos posefan aparentemente un segmento re- dundante, lo cual fue verificado por varios métodos, entre ellos la amplificacién del ADN con RCP (véase cap. 2) y por hibrida- cién in situ y fluorescencia (HISYF, véase cap. 14)."7 La conclusion de estas observacio- nes es que un segmento del cromosoma 17 es- taba por triplicado, es decir que en vez de ha- ber un segmento en cada uno de los dos cro- mosomas 17, uno de los cromosomas llevaba duplicado el segmento. La duplicacién del segmento, aunque es grande desde el punto de vista del ADN (1,5 millones de bases: Mb), no es visible al mictoscopio con técnica de bandeado (véase cap. 14) pero sf es detectable por HISYF (fig. 1-12) Esta duplicacién en el cromosoma 17 fue encontrada en un ntimero considerable de pa- cientes europeos pertenecientes a familias in- dependientes, lo cual es una evidencia de peso de que se trata del cambio genético relaciona- do con la enfermedad. Ademas de transmitirse en familias que ya la poseen, esta duplicacién patece surgit espontineamente (“de novo”) con cierta frecuencia. Esta aparicion nueva probablemente esta relacionada con la presen- cia en el cromosoma 17 normal, de una secuen- cia de ADN tepetida, de alrededor de 17.000 bases (17 kb), en los extremos de la region que se duplica (fig. 1-13). Esta repeticion, llamada CMTIA-REP esta presente como 3 copias en el cromosoma con duplicacién, de manera que parece intervenir en el proceso de la duplica- cién, la cual podria originarse por un entrecru- zamiento ilegitimo en la meiosis (véase cap. 9). En la regidn de la duplicacién se localiza un gen, el PMP22 (de la Protefna de Mielina Peri- férica de 22 kDa).INTRODUCCION 15, /+—— pMP22 Cromosoma 17 normal eee Presencia del gon -—— pmP22 PMP22 por triplicado Cromosoma 17 con duplicacién Fig. 1-12. Esquema de un cromosoma 17 portador de la duplicacién de Ia enfermedad de Charcot-Marie-Tooth y su ho- ‘mdlogo normal, con 1a presencia de un total de tres genes PMP22. La duplicacién citada del cromosoma 17 fue encontrada en estado homocigético (es decir, en ambos cromosomas) al menos en un pacien- te con una forma clinica més acentuada de es- ta enfermedad. Ademas, se encontraron los sintomas de esta enfermedad en casos de una duplicacién microscépicamente visible, es decir, mucho mayor, del brazo corto del ctomosoma 17. Todos estos datos apoyan la idea de que la enfermedad expresa un desequilibrio génico producido por la presencia triple de un segmen- to del cromosoma 17.178 Se encontré ademas un modelo animal de esta enfermedad: en el ra- t6n, la mutacién trembler (Tr, Te!) produce una lesién de los nervios periféricos muy parecida; en un animal, entonces, se pudo aislar el ARN y de él producir un ADN complementario o copia (ADNe, véanse caps. 2 y 4), que a su vez sirvid para identificar el ADNc humano homé- logo en genotecas de ADNe de cerebro huma- no (véase genotecas, cap. 2). Tal como se ha- bfa previsto, este ADN se localizaba en el cro- mosoma 17, dentro de la duplicacién. Este gen se denomina, como su producto, PMP22. Ade- més, se expresa (se transcribe) muy intensa- mente en los nervios periféricos, también de acuerdo con lo esperado. Su secuencia de bases contiene un marco de lectura abierto (condicién CMT1A-REP CMT1A-REP === Contémero_| === + Telémero t PMP22 Cromosoma 17 sin duplicacién (CMT1A-REP CMT1A-REP CMT1A-REP + —> Centrémero + ea. | 7 = > Telémero I I \ pupae \ pmpoe Cromosoma 17 con duplicacion génica Fig. 1-13. Esquema de la regién de duplicacién en el cromosoma 17 en la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth. PMP22: gen de la proteina de mielina periférica 22; CMT1A-REP: secuencia repetida de 17 kb que flanquea la duplicacién de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth.16 GENETICA HUMANA Glicido Bicapa ‘COOH R. transmembranosa 1 y 2 Extracelular Fig. 1-14. Esquema de la proteina PMP22 ubica- da en la membrana celular. Se sefialan las cuatro regiones intramembranosas que atraviesan la bi- capa; los extremas arnino (NH,) y carboxiterminat (COOH) son citoplasmaticos. Citoplasma de gen funcionante, véase cap. 4) que codifica teéricamente una proteina de 18 kDa (peso molecular), con 160 aminodeidos y cuatro do- minios asociados tedricamente a membranas celulares; es decir, se previ6 qué tipo de protef- na seria el producto del gen. Proteina PMP22 y desarrollo de la neuropatia Teniendo una idea teérica de cémo serfa la proteina codificada por el gen PMP22, se buses esa proteina entre las que forman parte de la inielina, que constituye las vainas de los nervios periféricos y resulté que su secuencia de ami- nodcidos es idéntica a la de una glucoproteina previamente aislada de tejidos bovinos, tam- bién coincidente con el producto PMP22, que presenta una secuencia apta para glucosilacién, en la regién aminoterminal. La proteina PMP22 muestra un alto grado de conservacién, es decir, su secuencia de aminoacidos es muy si- milar en diferentes especies. La protefna PMP22 fue finalmente localizada en la vaina de mielina, por métodos histoguimicos, en la re- gin de la mielina compacta” (fig. 1-14). Interpretacién patogénica de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth Quedan todavia muchas incdgnitas sin resol- ver en esta enfermedad, en especial con refe- rencia a su mecanismo de produccién del dao nervioso. Se ha observado que la proteina PMP22 no sélo es producida por las células de Schwann durante la formacion de mielina, sino también por fibroblastos quiescentes, es decir, inhibidos de dividirse. La proteina PMP22 es un componente menor de las proteinas de la mielina (2-5%); a pesar de ello, las mutaciones en esta proteina, tanto en el ratén como en la especie humana, se expresan como deficiencias en la compactacién y el mantenimienta de la vaina de mielina: muchas veces se observan di- lataciones en “bulbo de cebolla” en las vainas de los nervios. Es sabido que la vaina de mieli- na sirve como aislamiento eléctrico para la con- duccién saltatoria del impulso nervioso, de ahf las fallas de conductibilidad nerviosa en esta enfermedad. Sin embargo, no esta claro cémo el desbalance génico por triplicacién puede actuar en forma de mutacién dominante y por qué las mutaciones puntuales (cambios de bases) en el mismo gen patecen producir efectos similares a los de la duplicacién. El avance extraordinario del conocimiento sobre esta enfermedad en unos pocos afios es, sin embargo, indudable (véase panel 1-2). RESUMEN La Genética Médica estudia las enfermeda- des humanas considerando que los rasgos pato- légicos son consecuencia de la suma de dos va- riables: los cambios ambientales y los cambios genéticos. Los rasgos patolégicos claramente vinculados a un factor genético son enfermeda- des mendelianas, originadas en la alteracién de un solo gen (o segmento del ADN nuclear); es decit que son monogénicas y siguen las “leyes” de Mendel. Hay, sin embargo, efectos ambien- tales que simulan un cambio genético: son las fenocopias, como el raquitismo dietario respec- to de la mutacién que produce el raquitismo hi- pofosfatémico o las malformaciones embriona- rias inducidas por la talidomida respecto de las mutaciones que afectan el desarrollo de los miembros, como la aquiropodia. Las fenocopias son un ejemplo de que el factor ambiental in- terviene tanto como el factor genético en la de- terminacién del fenotipo, es decir, el aspecto 9 las caracterfsticas del enfermo. Con referencia a los cambios fenotipicos, debe usarse un prome- dio estadistico, la varianza, observandose que la varianza fenotipica es igual a la suma de las va-INTRODUCCION 17 Panel 1-2. Mecanismos patogénicos de la enfermedad de Charcot-Marie- Tooth de tipo 1A. Recientemente, se ha demostrado que la funcién del gen PMP22 es sensible a la cantidad de dosis génica, es decir, a la cantidad de esos genes presentes en el genoma. En ratones, se ha estudiado la inactivacion de uno © de ambos alelos del gen PMP22, esto es, heterocigotas y poredels para el gen “nulo” o inactivado, y se ha observado un grado creciente, del heterocigota al homocigota, en la eso anieeon de la vaina de mielina de los nervios perifé- ricos, con la formaci6n de dilataciones en bulbo de cebolla o catafilos, similares a las lesiones observadas en los pacientes humanos.” La presencia de tres genes (por la duplicacién hallada en los pacientes) produce una desorganizacion similar le la mielina; es decir, que el producto del gen PIMP22 es requerido en una can- tidad adecuada para asegurar la estabilidad y el grosor normal de la vaina de mie- lina. Varios otros genes que ademas codifican otras proteinas de la mielina tam- bién son sensibles a la dosis génica.2° rianzas genotipica y ambiental. El raquitismo hipofosfatémico mas comin es determinado por una mutacién de un gen del brazo corto del cro- mosoma X (gen HYP), pero hay otras mutacio- nes que producen un efecto parecido, origina- das en otros genes, lo cual demuestra la hetero- geneidad genética del raquitismo hipofosfatémi- co, es decir que el origen genético puede ser de- bido a distintos genes o a distintas mutaciones. Esto es bastante comtin en las enfermedades he- reditarias. Ademés de las enfermedades heredi- tarias mendelianas 0 monogénicas, hay un ni- mero de enfermedades cuya herencia no es cla- ramente mendeliana, aunque tienen una fre- cuencia intrafamiliar mayor que en la poblacién general, tales como la diabetes comtin, la hiper- tensin arterial y diversas malformaciones. Es- tas enfermedades son consideradas de herencia poligénica (o multifactorial), es decir, debidas a la accidn concurrente de varios genes mis la ac- cin del ambiente. La herencia poligénica tam- bién determina los rasgos continuos (0 métri- cos), por oposicidn a los rasgos discretos (pre- sencia o ausencia), tales como la estatura, la presiGn arterial y el color de la piel. El estudio de los gemelos monocigéticos es titil para deter- minar la importancia del factor ambiental, da- do que su genotipo es idéntico. Ademés, con los gemelos monocigéticos es posible estimar la “heredabilidad” de un rasgo continuo por la f6 mula H = V,/(V, + Va); estas estimaciones, cuando cumplen los requisitas debidos, revelan la tendencia heredable en la estatura, el coefi- ciente intelectual y otros rasgos continuos; y con respecto a rasgos discretos, el método de la concordancia permite establecer probabilidades de heredar enfermedades. Un rasgo cuantitati- vo itil es el recuento total de crestas dérmicas, que es resultado casi exclusive del factor gené- tico, y es casi idéntico en gemelos monocigéti- cos (95%); este recuento estd alterado en varias enfermedades cromosémicas y disminuye con el aumento de cromosomas X. También los dib jos formados por las crestas (“dermatoglifos son resultado del factor genético; los tres patro- nes principales (arcos, presillas y verticilos), més la localizacién de los trirradios y los plie- gues de flexién, sufren cambios significativos en las alteraciones ctomosémicas, en especial el sindrome de Down. Estas crestas se deben a la accién de varios genes con resultados aditivos; un caso parecido es el de la estatura. La identi- ficacién de los genes para rasgos continuos es més dificil que la de los rasgos discretos. Un gen para la estatura se localiza en la parte proximal del brazo largo del cromosoma Y. El numero de genes que intervienen en un rasgo continuo puede estimarse por pruebas estadisticas; en el caso del color de la piel, debe ser superior a tres. El estudio de las progenies muestra que los c racteres continuos se originan por segregacién de varios genes que actian aditivamente. Un gen es pleiotrépico cuando determina alteracio- nes en distintos tejidos y érganos que aparentan. no estar vinculados entre si; se denomina “pe- netrancia incompleta” a la carencia de expre- sion de un gen en el 100% de sus portadores siendo dominante, lo cual. sucede principal- mente por la interaccién del gen con otros ge- nes en cada genoma. Se lama expresividad va- riable a la distinta intensidad del rasgo en dife- rentes personas portadoras de un gen. La hete- rogeneidad genética puede ser intraalélica (di- ferentes mutaciones) o interalélica (diferentes genes). Muchas imprecisiones de la genética se van explicando con el enfoque molecular: se es- tudia el ADN de los enfermos para localizar al- teraciones en la secuencia de ADN; se localiza18 GENETICA HUMANA el gen en una regién cromosémica, se afsla su ARN mensajero, se crean genotecas de ADNe y se predice el tipo de proteina codificada. El co- nocimiento de esta proteina abre el camino para estudiar la funcién alterada. Un ejemplo es la atrofia muscular peronea (enfermedad de Char- cot-Marie-Tooth), que en el lapso de 3 aos que- 6 aclarada en gran parte, debido a que es causa- da por una duplicacidn de 1,5 Mb de ADN del cromosoma 17, el cual contiene el gen PMP22, que codifica la’ protefna de mielina periférica de 22 kDa y cuyo desequilibrio genera la desmielini- zaciGn de los nervios periféricos. REFERENCIAS 1. Sinnot EW, Dunn LC, Dobshansky TH. Principles of Genetics, 4* ed. New York: McGraw-Hill Book Com- pany, 1950. 2. HYP consortium: A gene (PEX) with homologies to endopeptidases is mutated in patients with X-linked hypophosphatemic rickets. Nature Genet 1995; 11:130-136. 3. Holm LA, Huang X, Kunkel LM. Mutational analysis of the PEX gene in patients with X-linked hypophospha- temic rickets. Am J Hum Genet 1997; 60:790-797. 4. Rasmussen H, Tenenhouse HS. Hypophosphatemias. En: The metabolic hasis of inherited disease (Editores: Seriver CL et al), New York: McGraw-Hill Book Company, 1989. 5. Buyse ML. Encyclopedia of Birth Defects (Editor: Buy- se ML). New York, 1990, 6. Lander ES, Schork NJ. Genetic dissection of complex traits, Science 1994; 265:2037-2048, 10, IL 2 13, 14 15 Smith C. Concordance in twins: methods and inter pretations. Amer J Human Genet 1974; 26:454-466. Lewontin RC. The analysis of variance and the analy- sis of causes. Amer J Human Genet 1974; 26:400. Cavalli-Sforza LL, Bodmer WF. The genetics of human populations. San Francisco: WH Freeman, 1971 Hole SB. Quantitative genetics of finger-print patterns. Brit Med Bull 1961; 1 50. Polani PE. Abnormal sex chromosomes and mental di- sorder. Nature 1969; 223:680-686. Preus M, Fraser FC. Dermatoglyphics and syndromes. ‘Amer J Dis Children 19725 124:933-043. Reed T. Review: Dermatoglyphics in Medicine - Pro- bblems and use in suspected chromosome abnormalities Amer] Med Genetics 1981; 8:411-429. (Ogata T, Matsuo N. Comparison of adult height bet- ‘ween patients with XX and XY gonadal dysgenesis support for a Y specific growth gene. } Med Genet 1992; 29:539-541, Salo P, Kisiriainen H, Page DC, de la Chapelle A. De- letion ‘mapping of stature determinants on_ the long arm of the Y chromosome, Hum Genet 1995; 95:283- 286. Byard P}, Lees FC. Estimating the number of loci deter- mining skin colour in a hybrid population. Ann Hum Biology 1981; 8-49-58. 7. Patel Pl. Charcot-Marie-Tooth disease type LA: muta- tional mechanisms and candidate gene. Current Op Genet Develop 1993; 3438-444. Lemke G. The molecular genetics of myelination: an update. Glia 1993; 7:263-271 ). Snipes G), Suter U. Molecular anatomy and genetics of myelin proteins in the peripheral nervous system. J Anat 1995; 186:483-494 ‘Aalkofer K, Martini R, Aguzzi A, Zielasek J, Toyka KV, Suter U. Hypermyelination and demyelinating pe- ripheral neuropathy in Pmp22-deficient mice. Nature Gen 1995; 11:274-280.Capitulo INTRODUCCION Relaciones entre factores genéticos, ambientales y el fenotipo. Fenocopias. Utilidad del estudio de gemelos. Caracteres discretos y continuos en la especie humana. Enfoque molecular de la genética human EI problema central de Ia Genética Médicaz factor genético versus factor ambiental La ciencia de la Genética se ha establecido sobre la base de algunos postulados fundamen- tales, de los cuales el primero es que la estructu- ray la funcion de un organismo dependen de dos tipos de factores: los ambientales y los gené- ticos.! Este postulado esté sustentado por la ob- servacin de toda la escala biol6gica, incluida la especie humana:,es posible introducir cambios en un organismo (que no serén heredables) por cambios en el entornoy;por ejemplo, las plantas superiores, frente a cambios en la cantidad de luz recibida, exhiben importantes diferencias en su desarrollo, desde la cantidad de color dada por la produccién de clorofila hasta la enverga- dura de la planta y su tiempo de floracién; o las variaciones en la alimentacién de los animales, que se expresan en su desarrollo, su peso y su es- tado de salud. Estos cambios son tan evidentes y conocidos que la agricultura se ha basado, hasta tiempos recientes, en lograr mejores rin” des mediante cambios ambientales. En Medici- na, se bused muchas veces cudles eran los agen- tes extemnos o noxas que pudieran causar enfer- medades. Estos hechos evidentes oscurecieron durante un tiempo el hecho esencial de que los bios efectuados por el ambiente son cuanti- os y que consisten generalmente en las reacciones de las que el organist es capaz frente a cambios del entorno. Es decir que exis- del ADN al fenotipo. te, en cada organismo, un plan de desarrollo, gue es heredable y que se concreta en la medi- da y forma en que el ambiente lo permite. Estas dlistinciones, entre los cambios del entorno y el plan heredable del desarrollo, con el aspecto fi- nal del organismo, fueron enunciadas por el ge- netista Johannsen (1911) al definir el fenotipo, o sea el aspecto del rictoscépico, con todos sus rasgos expresados, externos e intemos, funcionales y de conducta, como el resultado de su constitu- cidn genética, o genotipo, heredado de sus pro- genitores, mas los factores ambientales que per- mitieron o modificaron la expresién de esa constitucién genética. Es decir: FENOTIPO = GENOTIPO + AMBIENTE 0, més exactamente al referirnos a cambios observados: organismo, tanto macrosco- pico como VARIACIONES FENOTIPICAS = VARIACIONES GENOTIPICAS + VARIACIONES AMBIENTALES En Genética Médica, el problema primario frente a una enfermedad determinada es resolver cual es la identidad y la importancia del factor ambiental y cudl es el de la constitucién genéti- ca (“nurture versus nature”). Hasta hace poco tiempo, la Medicina estuvo orientada a determi- nar las noxas externas pero actualmente se reco- noce que en casi todos los rasgos, incluidos los patolégicos, existe un factor genético. Sin em- bargo, el genotipo y el ambiente se relacionan de una forma compleja. Uno de los ejemplos de20 GENETICA HUMANA Fig, 2-1. Microfotoarafta electrénica (izquierda: 210.000K)" y esquema (derecha) de un bacteridfago. En el esquema se observa que el ADN forma un filamento enrollado en ta eabeza del fago y que es inyectado a la bacteria a través de un canal en la cola, Una vee dentro de la bacteria, este ADN es capaz de replicarse y sintetizar nuevos fagos. Si este ADN es cortado por las enzimas de restricién de la bacteria, no se forman bacteriéfegos. cierta manera, puede ser equiparado al de un prototipo de sistema inmunitario. Las enzimas de restriccién se denominan asf porque restrin- gen el crecimiento de los virus pardsitos de bac- terias: los bacteriéfagos. El mecanismo se basa en que cortan Ia molécula de ADN de bacteris- fagos y, de esa manera, los eliminan (fig. 2-1). El tipo de corte del ADN que producen estas enzimas es muy especffico: cada enzima de res- triccién corta solamente cuando encuentra una secuencia de bases determinada y especifica pa- ra esa enzima de restriccidn (p. ej., para la enzi- ma EcoRI es la secuencia de seis pares de bases GAATTC/CTTAAG (véase mas adelante). Dado que estas enzimas cortan el ADN cuando encuentran su secuencia especifica a To largo de ladoble hélice y no en sus extremos, se denomi- nan “endonucleasas de restriccién” (cortan por dentro). Cuando una endonucleasa de restr cién corta un ADN, produce “fragmentos de restriccidn”, pero en la naturaleza esto ocurre exclusivamente en el ADN de los bacterisfagos ynoataca al ADN de la propia bacteria, porque simulténeamente los sitios o secuencias que re- conoce la enzima han sido modificados (metila- dos) en el ADN de la bacteria. Se conocen més de 1.200 diferentes enzimas de restriccién y ca- dla una reconoce su especial secuencia de bases del ADN? Nomenclatura Los nombres de las endonucleasas de restric- cién se basan en los nombres cientificos de la bacteria de la cual se extrajeron. Las primeras tres letras corresponden al nombre de la bacte- ria, de la siguiente forma: la 1° letra es la inicial del género, la 2 y la 3" son letras del nombre, de la especie, la 4* letra designa la cepa especial y el ntimero (romano) indica el orden histérico de las enzimas descubiertas en esa bacteria. Asf, Ta 1° enzima de restriccién descubierta en la ce~ pa RY13 de Escherichia colé (bacteria usual en la flora intestinal) se designa EcoRI, Algunas otras de las enzimas de restricciGim mas usadas son: HindIII (de Haemophilus influenzae, cepa Rd, 3 en aislarse), Notl (de Nocardia otitidis) y BamHI (de Bacillus amiloliquefaciens H). Mecanismo de accién Muchas enzimas de restricci6n actian reco- nociendo una secuencia especifica de bases del ADN que es palindrémica, es decir, que puede leerse, invertida, en la hélice complementaria (fig. 2-2) Estas secuencias palindrémicas tienen otras propiedades extraordinarias: =————_—________________ FENGMENos BAsicos Y TECNICAS DE GENETICA MOLECULAR GaAshet= hc CTTAAG Secuencia especitica para EcoRI Fig. 2: nocida por la enzima EcoRI. 2) tienen un eje de simetria en cada hélice, lo cual hace que cada hélice tenga autocom- plementariedad en su secuenciaj asf, ese seg mento palindrémico puede escribirse en for- ‘mato cruciforme; estas secuencias palindrémicas en general pueden adoptar més de una forma espacial cuando se encuentran en una molécula de ADN y en ciertas condiciones de su entorno. b) A su vez, las enzimas que reconocen estos palindromos, como la EcoRI, tienen una estruc- tura particular.sLa EcoRI esta constituida por dos subunidades simétricas (estructura cuater- naria), cada una de las cuales tiene‘un sitio (do- minio) de reconocimiento (de la Secuencia de una hélice) y un sitio activo de corte (catsllisis) (fig. 2-3). De esta manera, cada subunidad Ileva a cabo un corte, es decir, una ruptura de unidn fosfo- digster por hidrélisis en una hélice y, en con- junto, se realizan dos cortes, uno a cada cadena; los dos cortes, en EcoRI y otras enzimas, se ha- cen a distinto nivel pero en forma simétrica res- pecto del centro de la secuencia reconocida, y deja un fosfato sobre un C-5 y un hidroxilo en. el sitio 3” en el extremo de cada cara del corte (fig. 2-4). Es decir que, al producirse el corte, a cada pedazo le queda un “extremo colgante" de ( cuatro nucledtidos jen una de las dos cadenas. Estos “extremos colgantes” son extremadamen- te provechosos porque permiten la unién espe- cifica con un extremo complementario (se de- minan también “extremos pegajosos” por su afinidad por extremos similares). Los “extremos pegajosos” permiten el corte y repegado de las moléculas de ADN Las enzimas de restriccién han hecho posi- bles casi todos los demas adelantos del conoci- 21 Forma en cruz de la secuencia Forma lineal (izquierda) y cruciforme (derecha) de la secuencia (patindrémica) de bases del ADN que es re- miento del genoma (humano y de otros organis- mos) por dos espectaculates propiedadles({)son capaces de cortar regular e infaliblemente el ADN en secuencias especificas y2) muchas de ellas, al cortar el ADN, dejan en cada extremo tun segmento pegajoso monocatenario, capaz de unirse_exactamente a su complementario. Es decir que estas enzimas no sdlo cortan especiti- camente, sino que dejan un puente especifico y articulado para repegarse cuando se agrega una ligasa (véase mas adelante). Para que se ptoduzca el repegado de las dos caras de corte inferidas por una enzima de res- triccién, es necesario el consumo de energia Fig. 2-3. Esquema de ta enzima EcoRI colocada sobre la se- cuencia que reconoce en el ADN. La enzima es un dimero; cada unidad (en azul) posee un sitio de corte para una ca- dena (simbolizado por la tijerita), un sitio de reconocimien- to de bases (muesca) y una protongacién interna.?22 GENETICA HUMANA Fig. 2-4, Esquema de un extremo de ADN cortado con la enzima EcoRI. (provisto por ATP) y una enzima ligasa de ADN (p. ej. la ligasa T4) (fig. 2-5). Por consiguiente, queda posibilitado el corte y tepegado de moléculas de ADN de diferente rigen usando la misma enzima de restriccién (fig. 2-6) Propiedades de las enzimas de restriccién No todas las enzimas de restriccién tienen las propiedades descritas con anterioridad (es decir, cortar el ADN dentro de la secuencia re- conocida, dejar “extremos pegajosos”, recono- cer secuencias palindrémicas). En realidad, las enzimas de restriccién pueden clasificarse en G AATTEC a —+ LL CT TAA G GAATIC CTTAAG + AMP + Pos + H.0 tres grupos: grupo I, endonucleasas (cortadoras de ADN), que ademas pueden metilar el ADN, lo cortan aproximadamente a 1.000 nuclestidos de distancia del lugar donde la enzima recono- ce una secuencia y no tienen una secuencia pre- decible de corte. Ademés, requieren la presen- cia de ATP. Las enzimas del grupo II son las ac- tualmente usadas en Genética Molecular, cor- tan el ADN en secuencia especifica, no requie- ren ATP y en su mayorfa dejan extremos de corte pegajosos. Las del grupo III cortan el ADN en la cereanfa del lugar reconocido por la enzima pero poseen accién metilante y tequie- ren ATP. Las enzimas de restricci6n usadas en Genéti- ca Molecular son extremadamente termosensi- + ————— + ligasa T4 + ATP = Fig. 2-5. Dos extremos de fragmentos de ADN cortados con EcoRI; debido a que poseen sus “extremos colgantes” com plementarios, se unen permanentemente fen presencia de ligasa T4 y ATP.FENOMENOS BASICOS Y TECNICAS DE GENETICA MOLECULAR 23 ¢ Cele f FY CP ign wake cliauchc A A li T A 7 A pla lA 4 + Nena T A T A A A A Tool T 7 ‘A Sek i A T 1 Ei + ATP i | c a c q c ADN de virus ADN humano Moléculas de ADN mestizo (“‘tecombinante’) Fig. 2-6. Dos moléculas de ADN (una viral, linea gruesa; y una humana, linea fina), cortadas con EcoRI, pueden reu- vse y formar dos moléculas de ADN mestizo (humano-viral). bles y pierden su actividad en pocos dias o aun en horas si se mantienen a temperatura ambien- te. Por ello, las enzimas de restriccién se man- enen en una solucién de 50% de glicerina y a OC y se llevan a temperatura ambiente 0 a sélo durante la reaccién para cortar ADN. La mayoria de estas enzimas se inactiva total- mente por calentamiento a 68°C durante 10 minutos. Esta termosensibilidad y su creciente demanda han originado una floreciente indus- tia de extraccién y comercializacién de enzi- mas de restriccién. La concentracién de enzimas de restriccién se mide en unidades; la unidad es la cantidad de encima requerida para cortar completamente (en todos los sitios donde esté secuencia reconocida) una cantidad (1 41g) de fago lambda u otro ADN bien caracteriza- do, en una hora y en condiciones determina- das de temperatura y concentracion del ADN. Generalmente, se usan en concentraciones de 10 unidades de preparado comercial por A (WL) ©, en la préctica, 1 L de preparado comercial por reaccion de 50 [1L. Las enzimas de restric- isn (grupo IL) necesitan Mg"*, de modo que la mezcla de reacci6n contiene Cl,Mg ademds de otras sales. Generalmente, se usa un buffer con- centrado (10 X) del cual se usan 5 lL por reac- cin de 50 pL. Enzimas de restriccién de alta y baja frecuencia de corte Ya que cada enzima de restriccién reconoce ycorta slo en una secuencia especifica, es légi- co que si esa secuencia es muy rara en el ADN de un organismo, la enzima cortaré en muy po- cos lugares ese ADN, y producira entonces frag- mentos de mucha longitud (o peso molecular) puesto que el ADN natural es muy largo (varios cm, el correspondiente a los cromosomas huma- nos medianos). Esas enzimas de baja frecuencia de corte existen, como la enzima Notl (de No- cardia otitidis) y son stiles para el clonado de fragmentos muy largos de ADN. Sin embargo, la mayorfa de las enzimas de restriccién cortan el ADN con frecuencia moderada o alta, pues- to que sus secuencias especificas no son muy ra- ras. Como puede observarse en el cuadro 2-1, cuanto mas larga es la secuencia reconocida, mds baja es la frecuencia de corte y esto se basa en la probabilidad de encontrar, por azar, una secuencia de bases. Las bases del ADN no estan. dispuestas al azar pero al ser tan numerosas (3 10” en el genoma humano), para cada secuen- cia se puede hacer el siguiente planteo: si una enzima de restriccién reconoce y corta una se- cuencia de cuatro bases (como la Hpall, véase cuadro), la probabilidad de encontrar esa se- cuencia al azar es 1 en 4 = 1 vez en 256 bases; pero la probabilidad de encontrar al azar una se- cuencia de 6 bases (EcoRI) es de 1 en 4° = len 4.096 bases y la probabilidad de encontrar al azar una secuencia de 8 (como Notl) es 1 en 4° = 1 en 65.536. Por ello, Notl es usada para cortar el ADN en grandes fragmentos (en reali- dad, mayores que 65.536 bases; corta aproxima- damente a 100-150 kb). Caracterizacién primaria de un ADN: sitios de restriccién y mapas de restriccién. Un ADN de- terminado, no muy largo (p. ej., el ADN de un virus o el ADN de una sub-banda de un cromo- soma humano), puede caracterizarse en forma