“Efecto del complejo enzimático producido por Aspergillus oryzae sobre la producción de alcohol etílico por Saccharomyces cerevisiae

en condiciones de laboratorio”

"Effect of enzyme complex produced by Aspergillus oryzae on the production of ethyl alcohol by Saccharomyces cerevisiae under laboratory conditions" Liz Sánchez-Torres1
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Escuela de Microbiología y Parasitología, Universidad Nacional de Trujillo1. ABSTRACT In order to determine the effect of the concentration of the enzyme complex produced by Aspergillus oryzae CECT 2094 and CECT 2095 on the production of ethyl alcohol by Saccharomyces cerevisiae in laboratory conditions, four fermentation’s systems were conditioned using bottle with 400 mL molasses broth, which was added enzymatic extract at concentrations of 2, 4, and 6% (v / v) and a control without enzyme extract. The systems were inoculated with Saccharomyces cerevisiae and incubated at 28 ° C for 2 days under anaerobic conditions, then it was proceeded to measure the concentration of alcohol expressed in percent in each of the fermentation systems. The highest percentage of alcohol was obtained in the treatment with 4% extract enzyme, with an average of 4.47% alcohol as opposed to the control which was obtained 3.73%, differ also in alcohol tolerance because biomass at the end of fermentation was 1.36 x 108 cells / mL in the treatment with 4% while the control was 9.92 X107 Cel / mL. In both treatments a decrease of the Brix was observed to 6,6ºB. The conclusion was that the enzyme complex produced by Aspergillus oryzae has an effect on ethanol production by Saccharomyces cerevisiae under laboratory conditions. Keywords: Aspergillus oryzae, Saccharomyces cerevisiae, percentage of alcohol, amylase, protease, fermentation.

INTRODUCCIÓN El mundo encara el agotamiento progresivo de sus recursos energéticos basados mayoritariamente en combustibles no renovables. Al mismo tiempo, el consumo de energía aumenta a ritmo cada vez más creciente. De otro lado, el consumo global de combustible genera enormes cantidades de gases contaminantes que son liberados a la atmósfera. La única forma de encarar esta problemática es mediante recursos energéticos renovables; una solución renovable es el uso de energía solar en forma de biomasa, la cual está representada en los materiales lignocelulósicos y los cultivos de plantas ricas en energía, a partir de los cuales se producen biocombustibles líquidos (bioetanol, biodiesel)1,2. El biocombustible más importante es el alcohol carburante (etanol, EtOH) el cual permite un aumento del índice de octano y por lo tanto, la reducción del consumo y reducción de la contaminación (10 a 15% menos de monóxido de carbono e hidrocarburos). Así mismo el etanol podría sustituir al metil ter-butil éter (MTBE) para reducir las emisiones de CO 2. Está acción es muy importante pues el MTBE, por ser un compuesto muy estable de baja degradación y muy soluble en agua, ha resultado ser un contaminante de aguas subterráneas2,3. Una de las opciones para producir etanol es por fermentación a partir de materias primas ricas en carbohidratos (azúcar, almidón, celulosa, etc.). Por tal razón, es común designar al etanol obtenido por esta vía “bioetanol”. Entre estas materias primas se encuentran vegetales como la caña de azúcar y la remolacha, los cereales (trigo, maíz, sorgo), los tubérculos (papas, yuca) y en general, materias provenientes de ligno-celulosa o de residuos orgánicos. El proceso de obtención es más eficiente en aquellos productos que tienen más azúcar; de esta manera el proceso más eficiente se logra a partir de caña de azúcar y de maíz, siendo la mejor

Saccharomyces cerevisiae. en un proceso que sigue los siguientes pasos: transformación del almidón del cereal en glucosa. por cada mol de hexosa consumida. El uso de los biocombustibles se implementa e incrementa en países como Alemania. impulsados por la disminución de las reservas de petróleo. para enriquecer el contenido alcohólico y posteriormente se deshidrata por medio de tamices moleculares2. Este microorganismo tiene también la capacidad de convertir las hexosas en CO2 aeróbicamente. esto implica la mayor tolerancia a la inhibición por concentración de alcohol.3. la especie de levadura usada con más frecuencia en los procesos de fermentación. convierte las hexosas en EtOH en condiciones anaeróbicas. en algunos casos es necesario emplear complejos enzimáticos sobre el almidón no convertido. para que pueda ser usado como fuente de carbono durante la fermentación. es así como la opción española de producción industrial de bioetanol se ha concretado en la utilización de cereales. A nivel mundial se está dando mucha importancia a la producción de bioetanol. además de dos moles de EtOH. generando 2 moles del compuesto generador de energía en los seres vivos. así mismo para mejorar la asimilación de . Estados Unidos. Algunas levaduras tienen la ventaja adicional de tolerar concentraciones relativamente altas de EtOH (hasta 150g. Italia. el adenosín trifosfato (ATP).L-1)1. El proceso de fermentación y su eficiencia para producir etanol depende en alto grado de la acción de levaduras. obteniéndose un mosto azucarado que se fermenta por medio de levaduras. Brasil y Colombia entre otros. presentando muchas opciones de producción.materia prima para los principales productores a nivel mundial como Brasil y EE UU respectivamente3. Australia. el incremento en su precio y la preocupación por el impacto de los combustibles sobre el medio ambiente. Francia. El mosto alcohólico obtenido se somete a destilación. dependiendo del sustrato utilizado.

Produce amilasas. Al comenzar su desarrollo.0 y temperatura de 37ºC 7. . aislado de lentejas. y ácido kójico. por lo tanto es importante el empleo de enzimas hidrolíticas como las amilasas y proteasas 4.9. peroxidasas. calcio. y luego se convierten en amarillo verdosas o de color castaño. lo que otorga una mejor estructura conformacional de la membrana celular de las levaduras. Por lo general los cultivos de microorganismos en medio sólido se realizan utilizando sustratos agrícolas como salvado de trigo. bagazo de caña. las colonias son blanco-amarillentas.). antibióticos y otros muchos principios activos usados en medicina y en industrias alimentarias y textil 8. La técnica de fermentación en medio sólido (FMS) ha sido y sigue siendo utilizada por numerosos investigadores para producir enzimas y otros metabolitos primarios y secundarios. El hongo a utilizar en este proyecto pertenece al Género-forma Aspergillus especie Aspergillus oryzae. y ha sido utilizado en Bogotá como sustrato en la Obtención de amilasas por Aspergillus sp. cáscara de cereales y de remolacha etc. fósforo. ácidos orgánicos. pectinasas. harina de yuca. proteasas. y vitaminas del complejo B. proteasas. puede tener una o dos filas de esterigmas con conidiosporos piriformes. demostrando que estas amilasas son activas en el desdoblamiento de la molécula de almidón a pH 5. además son los microorganismos más adaptados a cultivo en medio sólido y son la base de muchas fermentaciones y fuentes de muchas enzimas comerciales (amilasas.6. magnesio. hierro. a estos sustratos se les agrega una solución de sales y una suspensión de esporas de hongo como inoculante5. El salvado de trigo es más rico en celulosa. Los hongos filamentosos producen una variedad de metabolitos secundarios originados a partir de intermediarios del metabolismo primario.nitrógeno. etc.

pero el elevado costo no es apropiado desde el punto de vista económico10. Actualmente. aún no se ha desarrollado mucho la producción de etanol. que sin embargo. no supera el rendimiento que se obtiene con la adición de la enzimas comerciales 10.11. En nuestro país. La melaza presenta aproximadamente entre 4 y 7% de componentes como maltosa. Argentina por su parte.5% p/v obtenidas por fermentación en sustrato sólido con Rhizopus niveus. almidón y celulosa que no pueden ser metabolizados por la levadura en condiciones normales de proceso. Hoyos y Carrera (2004) reportaron un incremento del grado alcohólico del 10% v/v con la adición de de enzimas de 0. valor muy satisfactorio. y se demostró que la producción óptima de amilasa se obtiene durante la fase exponencial de crecimiento con bajas concentraciones de CO2 (de 2 a 5%) al contrario de las proteasas que necesitan una concentración elevada de CO2 (5%) durante la fase estacionaria 8. la falta de una tecnología desarrollada que pueda suplir las necesidades de la industria productora de alcohol hace necesario el estudio de nuevas alternativas y metodología de producción que permitan aprovechar al máximo los recursos . planea para los próximos cinco años la transición hacia mezclas de gasolina con un 5% de EtOH. obteniendo muy buenos resultados. en América Latina está aumentando el interés por la producción de etanol. por esta razón ha evaluado una mezcla de enzimas comerciales (0. por ejemplo en noviembre del 2005 Colombia inicia la adición de un 10% de EtOH a la gasolina.05% p/v). se ha estudiado el efecto de la concentración de CO2 y del O2 en la fase gaseosa sobre el crecimiento y el metabolismo de Aspergillus oryzae para la producción de amilasas y proteasas en FMS. Muchas Industrias biotecnológicas de bioprocesos han evaluado la adición de una serie de enzimas que mejoran la producción de alcohol etílico empleando melaza como sustrato.Dentro de las investigaciones realizadas en este campo.

cerevisiae a partir de melaza utilizando una mezcla de enzimas denominado complejo enzimático. ellipsoideus MIT-L51. Propagación de Aspergillus oryzae. Método 1.de Valencia. Procedente del Molino San Francisco. La libertad. Fermentación en sustrato sólido con Aspergillus oryzae. Nac. El presente trabajo tuvo como objetivo optimizar el rendimiento en la producción de etanol por S. Las cepas CECT 2094 y 2095 de A. Proporcionado por el Laboratorio de Microbiología Industrial y Biotecnología del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Univ. de Trujillo. producido por A. Material Biológico • Cepas de Aspergillus oryzae CECT 2094 y CECT 2095 Procedente de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). oryzae.1. • Salvado de Triticum aestivum “Trigo”.Procedente del Mercado Central de Trujillo.12. 2. Trujillo. 1. fue rehidratado con Caldo Sabouraud estéril y sembrado en Agar Extracto de Malta y Papa Dextrosa (PDA) . oryzae mediante fermentación en sustrato sólido. • Melaza de Saccharum officinarum “Caña de azúcar”.1. MATERIAL Y MÉTODO 1. • Cepas de Saccharomyces cerevisiae var.industriales como la melaza (para producir etanol) y el salvado de trigo (para producir enzimas) 1. cuyo efecto se verá reflejado en el aumento del porcentaje alcohólico. Univ.

Posteriormente se le adicionó una suspensión de esporas por gramo de materia seca y con una bagueta estéril se extendió el medio tratando de formar una superficie plana. seguidamente se humedeció el salvado con solución tampón a pH 5. 1.1 % de Tween 80 para facilitar el desprendimiento de esporas. Se dejó incubar durante cinco días a 28ºC tiempo suficiente para el crecimiento del hongo y producción de esporas. Este sistema se ubicó horizontalmente en la incubadora a 24ºC. La solución del lavado se centrifugó a 2800g. Preparación del inóculo. Seguidamente se tomó una alícuota de esta suspensión y se llevó a la cámara de Neubauer para el recuento de esporas por mL haciendo las diluciones necesarias para obtener la concentración de 2X107 esporas/mL en el medio de fermentación. se realizó partiendo de un cultivo en placa de Agar Papa Dextrosa (PDA) y Agar Extracto de Malta para las cepas CECT 2095 y CECT 2094 respectivamente. .0 (previamente autoclavada) en cantidad suficiente para alcanzar una humedad relativa de 50%. Finalmente las esporas se resuspendieron en 10ml de agua destilada estéril. para semejar las condiciones del cultivo en bandeja. durante 3 minutos. se lavó la superficie del cultivo con 10 mL de solución al 0. Preparación del sustrato sólido e inoculación de esporas13 En botellas de vidrio planas de 1000 mL se colocó 80 gr de salvado de trigo y se llevó a autoclave a 121ºC durante 20 minutos.3. La preparación del stock de esporas de Aspergillus oryzae.respectivamente. se repitió el proceso de centrifugación y decantación. 1. se decantó y se resuspendió las esporas en 10 mL de agua destilada estéril.2. La fermentación se llevó a cabo durante cinco días.

luego al tubo I y III se agregó 0. Se recolectó el sobrenadante (preparado enzimático) y se centrifugó a 2500 rpm por 10 minutos a 4 °C y finalmente se filtró a través de un filtro bacteriológico estéril. Finalizando dicho tiempo se le añadió 4. Una vez cumplido el tiempo de incubación. Luego se incubó los tres tubos por un tiempo de 7. Extracción de enzimas14. se agitó aproximadamente por una hora en un agitador magnético para extraer la enzima. el sustrato de fermentación se pasó a un matraz estéril y se le agregó 200 mL de la solución tampón.2.1. En los tubos II y III se agregó 10µL del extracto enzimático.5 minutos.4. Prueba de Actividad de Alfa Amilasa15 Se prepararon 3 tubos de la siguiente manera: Tubo I (Blanco Reactivo).5mL de la solución reveladora a los tres tubos y se completaron los volúmenes con 0. y el filtrado se guardó en refrigeración a 4ºC hasta la determinación de las unidades de enzima. luego se separó la fracción soluble de la insoluble filtrando a través de un lienzo (prensado). Tubo II (Blanco Muestra) y Tubo III (Muestra). Luego se midió la absorbancia a 574nm.01mL y 0.5mL de la solución de almidón bufferado pH 5. 2. Para cálculo de resultado se usó la siguiente fórmula: Absorbancia (Blanco) – Absorbancia (Muestra) Amilasa UA/dL ₌ ―––––––––––––––––––––––––––––––––––––––* 1000 Absorbancia (Blanco) Donde: .5mL de agua destilada en los tubos I y II respectivamente.

II. y se incubó a 30ºC durante 36 horas.5 mL de cada uno de los tubos y se trasladó a otro sistema de tubos igualmente numerados (I. se agregó 2mL de buffer fosfato 0. sólo a dos de ellos (I. Preparación del inóculo de Saccharomyces cerevisiae 13.4. III) a los cuales se les agregó 1 mL de solución de ninhidrina a cada uno de los tubos. se tomó alícuotas de 0. III) . luego se retiró y agregó 3. Luego se “cosecharon” las células de levaduras utilizando de 2 a 3 ml de Solución Salina Fisiológica (SSF) por placa de cultivo. II. Con el objeto de verificar si el complejo enzimático contiene proteasas se empleó la siguiente metodología basado en la hidrólisis proteolítica de un sustrato de caseína. La actividad enzimática se comparó con la curva estándar de caseína.3. III).1 M pH 8 a los tres tubos ( I. II) contuvo 2mL de caseína al 1%. III) se les colocó 2mL del preparado enzimático. Determinación de la actividad de las enzimas proteolíticas13. 2.Absorbancia del Blanco= Abs. Finalmente se mezcló por inversión y se leyó en espectrofotómetro (640 nm). Seguidamente se reunieron todas las suspensiones en un tubo estéril y se . De Blanco reactivo + Abs. Se trabajó con tres tubos (I. De Blanco muestra Absorbancia de Muestra= Absorbancia de cada eluído enzimático.5 mL de agua destilada. para igualar los volúmenes se añadió agua destilada a los tubos II y III. 2. II. se mezcló y se colocó en baño de agua a 37ºC durante 30 minutos. Finalizando el tiempo de reacción. de los cuales dos de ellos (I. A partir del cultivo conservado en agar sabouraud se activó la levadura sembrando en placas conteniendo Agar Sabouraud Glucosa Enriquecido (ASGE). se mezcló y llevó a un baño de agua hirviendo (franca ebullición) durante 3 a 5 minutos.

Para determinar la curva de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae se tomó un volumen de 300mL de melaza diluida.7. se realizó una observación en fresco utilizando azul de metileno para determinar la viabilidad de las levaduras. . 4 y 6% (v/v) a los tres biorreactores problemas.6. el proceso de fermentación duró 48 horas. el biorreactor control se trabajó sin adicionar complejo enzimático. Producción de etanol.5. 2. Determinación del porcentaje de etanol. En 4 biorreactores debidamente acondicionados y esterilizados se colocaron 400 mL de caldo melaza (Anexo 8).05 Kg/dm3 y a pH 4. Luego se inoculó la levadura (10% de inóculo) y se incubó a temperatura ambiental (19±1ºC) durante 48 horas. se inocularon con 40 mL de suspensión de levaduras en fase logarítmica y se les adicionó el complejo enzimático en concentraciones de 2.homogenizó la suspensión. Determinación de la fase logarítmica de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae13.5. con una densidad de 1. Se esterilizó a 121ºC por 15 minutos. Los recuentos de células se llevaron a cabo cada hora. 2. 2. A las 48 horas se midió el porcentaje (%) de etanol utilizando el Ebulloscopio de Malligan en cada uno de los cuatro biorreactores cuyos resultados se organizaron y analizaron estadísticamente en base a la prueba de análisis de varianza (ANAVA).

existe diferencia estadísticamente significativa entre los porcentajes de alcohol promedio de un nivel de Concentración Enzimático a otro para un nivel de confianza del 95.0% haciendo un total de dos poblaciones estadísticas (grupos homogéneos). Además se observó que el extracto favoreció el crecimiento celular en un medio dónde puede ser inhibido por el porcentaje de alcohol (fig.).1).RESULTADOS Se observó que el porcentaje de Alcohol producido por Saccharomyces cerevisiae fue mayor en los sistemas que se trabajaron con el extracto enzimático producido por Aspergillus oryzae en comparación con el control donde no se añadió dicho extracto (fIg.73% como se puede observar en la figura 1. 2 y 6% al igual que 4 y 6% no hubo diferencia significativa (p> 0. Dicho crecimiento celular puede observarse también en la caída del Brix inicial del medio caldo melaza (fig. Según el ANAVA. Así mismo se puede observar que se obtuvo mayor población celular en el tratamiento con 6% de extracto enzimático (Fig. ANAVA (Tests de Rangos Múltiples). También se observó que el mayor porcentaje de Alcohol se obtuvo en el tratamiento con 4% de extracto enzimático obteniéndose una media de 4. 2).0%. .2 y 3).4).47% de alcohol a diferencia del control en el cual se obtuvo 3.05) por lo tanto a dichas concentraciones se obtiene igual efecto. se identificó que en el rango de 2 y 4 %. 2. considerando al control como una de ellas ( Fig. Según el Post. sin embargo en los tres pares de medias restantes (comparación con la media control) se observó que éstos muestran diferencia estadísticamente significativas a un nivel de confianza 95.

0 + 7 6 0E 0 . de fermentación.4 3.4.2 Concentración de extracto enzimático producido por Aspergillus oryzae a.2 4. Población celular de Saccharomyces cerevisiae (Cel/mL) en presencia de diferentes concentraciones de fermentación.0 + 7 2 0E 0 .61E+08 1.0 + 7 4 0E 0 . b : p ≤ 0. Porcentaje de alcohol producido por Saccharomyces cerevisiae empleando diferentes concentraciones del extracto enzimático de Aspergillus oryzae a los 48 hrs.92E+07 1. Población celular Sacchromyces 1 0E 0 .27E+08 9.6 producido por saccharomyces Porcentaje (%) de alcohol 4. 1.6 3.2 + 8 1 0E 0 .8 + 8 1 0E 0 . 2.4 + 8 1 0E 0 .73% a 0% 2% 4% 6% 4. complejo enzimático de Aspergillus oryzae a los 48 hrs. de .0 + 0 0 % 2 % 4% 6 % C ncentra n d extracto enzim o ció e ático p ucid p r rod o o A sperg illus oryza e Fig.27% b cerevisiae 4 3.47% 4.6 + 8 1.0 + 7 0 0E 0 .8 3.27% b b 3.05  Hay diferencia significativa Fig.0 + 8 8 0E 0 .4 4.36E+08 cerevisiae (cel/mL) 1 0E 0 .

92E+07 6. 3.096 Fig.6 7 2% 1. Grados Brix inicial (14ºB) y finales de los medios de fermentación (caldo melaza) con la correspondiente Población celular de Saccharomyces cerevisiae evaluado a las 48hrs.6 5 4% 1.5 7 6% Población celular de Saccharomyces cerevisiae Fig. . 14 14 12 Grados Brix (ºB) 10 8 6 4 2 0 6.27E+08 1.0513X+18. Fase exponencial de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae (millón/mL) cultivado en medio Caldo Melaza y evaluado durante las 25 hrs.6 7 0% 2. 4.36E+08 6.76E+07 9.61E+08 (Cel/mL) 6.Población Celular deSaccharomyces cerevisiae (millón/mL) 400 350 300 250 200 150 100 50 0 3 4 7 8 9 10 12 25 Tiempo (h) Y=0.

6 logrando disponer para la levadura nuevos componentes. Esto justifica también la disminución final de los azúcares . oryzae contiene enzimas de diferentes tipos. se asegura que la levadura está pasando en las mejores condiciones a la fase anaerobia10. Saccharomyces cerevisiae es una levadura que posee alta actividad metabólica.DISCUSIÓN En lo que se refiere a la estandarización de la metodología de la fermentación alcohólica. por lo que en la fase aerobia se caracteriza por la producción de biomasa y la fase anaerobia generalmente por la producción de etanol. Para la presente investigación se decidió evaluar el contenido de amilasas y proteasas. hay una etapa muy importante que es el momento de pasar la levadura de fase aerobia a fase anaerobia.42 UA/dL (Anexo 3). Es importante la fase aeróbica.25. ya que la levadura presenta una fase de adaptación para que produzca enzimas necesaria tipo invertasa que le permitan metabolizar el sustrato y así alcanzar la biomasa adecuada para la fermentación en donde la mayor parte del carbono se emplea como energía y sólo el 2% se asimila como material celular26 .Para determinar este grado de desarrollo fue necesario realizar una curva de crecimiento. Al realizar la fermentación de esta forma. en la cual se observó que el momento óptimo para hacerlo era a las 5 horas 23 minutos después de iniciada la fase aerobia. La levadura se debe pasar a la fase anaerobia cuando la curva de crecimiento del cultivo está en la fase logarítmica de desarrollo (véase figura 3).4 y alfa 1. que indica que el complejo enzimático puede hidrolizar residuos de maltosa y de almidón (amilosa amilopectina). El resultado de la prueba de actividad para amilasas arrojó un concentración de 676. Realizando la prueba de actividad de la amilasa se demuestra que el complejo actúa sobre enlaces alfa 1. El complejo enzimático obtenido de A.

26.20. Él en conjunto con otros investigadores han reportado que las α-amilasas afectan la concentración final del etanol dándoles como resultado un aumento de 10. Como se observa en la figura 2. fue incluida por la baja especificidad que presentan las enzimas proteolíticas de la levadura.8 U/g de maíz seleccionado para la molienda en seco a nivel de laboratorio11.6%(v/v) a una concentración de αamilasa de 42. Las proteasas mejoran la asimilación del nitrógeno presentes en la melaza como proteínas y aminoácidos. Como se sabe. está investigando nuevos procesos usando enzimas proteasas de microbios y hongos para producir etanol más eficazmente.totales reductores y el aumento del porcentaje de alcohólico con respecto al blanco10. David Johnston.5 hasta 11.27.7305mg de caseína a 37ºC por 30 minutos (Anexo 2) 10. tecnólogo alimentario en la Unidad de la Ciencia de Conversión de Cultivos e Investigación de Ingeniería. 1 y 4). muestra un notable aumento de la población celular por la adición del extracto enzimático. Él ha descubierto que las enzimas hacen más nutrientes disponibles para la levadura. existen muchos métodos bioquímicos que nos permiten identificar su presencia en una muestra. La prueba de la proteasa. acelerando la fermentación de los azucares. dentro éstos destacan la formación de complejos cromóforos por interacción del aminoácido y un reactivo especifico. lo que representa una mejor estructura conformacional de la membrana celular de la levadura y por tanto una mayor tolerancia a la inhibición por concentración de alcohol. Al desarrollar la metodología propuesta para evaluar la presencia de esta enzima. en esta . (Fig. Además que las enzimas proteasas también pueden facilitar el proceso de quitar el agua de los restos sólidos después de la extracción del etanol. el resultado de la prueba arrojó la presencia de proteasas en el medio que hidrolizan 2. solamente 20 aminoácidos componen el alfabeto a partir del cual se forma la gran variedad de proteínas existentes.

incremento del porcentaje de compuestos orgánicos no azúcares. con fundamento en las propiedades que tienen algunos microorganismos de metabolizar azúcares y producir como residuo. ganancia de azúcares reductores. en forma no asimilables por los microorganismos. el ácido actúa como catalizador y se obtiene una mezcla de glucosa y xilosa con algunos productos de degradación como ácido acético. Los principales cambios notados durante el almacenamiento de la melaza son: pérdida de sacarosa. agente que al entrar en contacto con aminoácidos libres da lugar a un complejo visible de color azul-violáceo. los carbohidratos presentes en las melazas ya se encuentran disponibles y no requieren tratamiento. En la descomposición de la melaza se producen varias reacciones siendo la más importante la de los aminoácidos con estos azúcares reductores. en la cual se forman productos coloreados como las melanoidinas (impurezas coloidales coloreadas con alto contenido de carbono) y los residuos fermentables a los cuales se les ha encontrado un contenido de 68% de nitrógeno combinado. tiene como finalidad la transformación de azúcares complejos (polisacáridos) en carbohidratos sencillos.ocasión se trabajó con la Ninhidrina. papa. La obtención de alcohol de melazas se diferencia de otras materias primas. estos materiales deben pasar por un proceso de pretratamiento de cocción o tratamiento enzimático para hidrolizarlos y obtener azúcares fermentables. alcohol etílico. Esto se logra con ácido sulfúrico o clorhídrico a altas temperaturas y tiempos de operación cortos o largos. como maíz. en que éstos son productos de plantas con alto contenido de carbohidratos almacenados en la forma de almidón. Para reducir la probabilidad de . y gran incremento de color. milo y otros. Por lo tanto. Por ello podemos afirmar que el extracto enzimático tiene proteasas por dar positiva la reacción de la ninhidrina con los grupos aminos de los aminoácidos libres16. Para el caso particular de hidrólisis de materiales lignocelulósicos de la caña de azúcar o ruptura de las moléculas en medio acuoso. furfural y derivados de la ruptura de la lignina1.19. En contraste. pérdida de sólidos totales.

Suele ser satisfactoria una concentración de azúcar del 10 al 18%. el valor más corriente es del 12%. la melaza debe almacenarse a la menor temperatura posible26. muestra una disminución al final de la fermentación con respecto al blanco (fermentación alcohólica sin la adición de enzima) como se observa en la figura 4. se ha reportado que en un cultivo para levaduras en melaza la relación carbono/nitrógeno debe ser 1:1 para que la productividad celular sea máxima26. La evaluación de los grados brix (sólidos solubles).82% de sacarosa con un Brix de 80.cambios químicos originados por las temperaturas.31% de azúcares. aminoácidos y ácidos nucleicos. Pues se sabe que el carbono sirve como fuente de energía y como material constitutivo de la masa celular y el nitrógeno se encuentra en la célula formando parte esencial de las proteínas. por el contrario. el proceso resulta antieconómico ya que requiere un mayor volumen para la fermentación. son factores que se debió considerar ya que esa puede ser la causa de que la levadura no produjo porcentajes de alcohol más altos al no tener la fuente de carbono y nitrógeno libres ya que se formaron impurezas coloidales debido a un mal almacenamiento (temperatura ambiente). lo cual es indicativo de que hubo conversión a etanol. Cuando se trabaja con concentraciones de azúcar muy altas. Una de las etapas en el proceso de fermentación es la preparación del “mosto”.5 la cual se diluyó hasta obtener 14ºB y 13. Además según investigaciones realizadas. Por esto se utiliza como sustrato la melaza. La disminución del grado Brix puede estar dada . que tiene de 10 − 15% de azúcar. La melaza con la que se trabajó tuvo 26. se observa una deficiencia respiratoria en la levadura y un descenso de la velocidad de fermentación. La cantidad de melaza almacenada y la duración del período de almacenamiento. del orden de 22%. el cual consiste (en este caso particular) en una dilución de la melaza hasta 12-14º Brix por adición de la cantidad adecuada de agua. al trabajar con concentraciones muy bajas.

Se ha demostrado que las membranas citoplasmáticas y de varios organelos son el blanco principal para la inhibición por etanol.28.23. el tipo de azúcares también es un factor importante. esenciales para la actividad de enzimas involucradas en la glicólisis y producción de alcohol. por lo que a medida que se genera durante la fermentación. Sin embargo. el porcentaje de alcohol que se puede obtener en la fermentación está limitado por la tolerancia de la levadura a las concentraciones de alcohol. Estos cambios en la permeabilidad. la capacidad de la levadura para producirlo se ve reducida. lo cual varía de una especie a otra.76X107 cel/mL).21. El alcohol tiene un efecto negativo sobre las enzimas que la levadura emplea para desdoblar el azúcar. la levadura solo metaboliza directamente azúcares simples (glucosa y fructosa). almidón amilasa hidrolizados por el complejo enzimático1. coenzimas y nucleótidos. la levadura emplea la enzima invertasa para desdoblar la sacarosa en sus azúcares simples glucosa y fructosa.18. basta con diluir hasta conseguir concentraciones apropiadas (se diluyo hasta los 14ºB) y luego agregar cantidades de levadura suficientes (2. son suficientes para explicar el efecto inhibitorio del mismo20.17.por la asimilación de maltosa. Para fermentar disacáridos como la sacarosa. . Las condiciones de fermentación también pueden ser un factor importante en la producción de etanol. así el pH óptimo para el metabolismo de la levadura es de pH 4. como las mieles de la industria de la caña de azúcar. La pérdida de estas biomoléculas.5. El alcohol ocasiona alteraciones en la organización y permeabilidad de las mismas al afectar su composición lipídica y el funcionamiento de proteínas de membrana involucradas en el transporte de azúcares y aminoácidos. por ejemplo.22. Para procesar materiales que contienen azúcares simples y disacáridos. causan la fuga de cofactores. presentes en jugos y mieles de caña.

95 . surte a las levaduras de una fuente externa de nitrógeno en exceso. lo cual da como resultado un decremento de las enzimas intracelulares que intervienen en la producción de etanol24.9.56% y en ninguno de los casos se excedió el 10% respectivamente. Concepción y Col24 reportaron rangos de 4. se ha reportado que es posible alcanzar hasta 21% de alcohol con especies genéticamente adaptadas y bajo ciertas condiciones. haciendo corridas experimentales con nitrógeno (sulfato de amonio) y sin nitrógeno concluyeron que la adición de la fuente de nitrógeno exógena no tuvo influencia sobre el rendimiento de alcohol además que en 4 y 8% de alcohol existe una meseta que demuestra la estabilidad en la actividad celular.) hecho que se puede explicar como lo hacen Hoyos y Carrera que reportaron un incremento del grado alcohólico del 8% a 10% v/v con la adición de de enzimas obtenidas por fermentación en sustrato sólido con Rhizopus niveus. El aumento progresivo de los niveles de sólidos en el medio incrementan las presiones osmóticas.84 % y 4. la cual no es una cepa mejorada y específica para obtención de alcohol pero al añadir el complejo enzimático la cepa presentó tolerancia (cepas clasificadas así cuando soportan de 9 a11% de alcohol)10. Sin embargo a nivel de laboratorio.No obstante.9. Lo común en la industria del alcohol es alcanzar porcentajes de entre 9 a 15%.47% (Fig 1. La adición de sulfato de amonio como fuente de nitrógeno a las distintas concentraciones de miel durante la fermentación. En el presente estudio el porcentaje de alcohol producido por Sacharomyces cerevisiae empleando diferentes concentraciones del extracto enzimático de Aspergillus oryzae también dio valores bajos entre 4. lo que conlleva a un incremento en la concentración de etanol intracelular. aumentando las presiones osmóticas del medio que se oponen a los procesos celulares.88 . Por una parte el sulfato de amonio favorece la reacción fermentativa y por otra incrementa el ªBrix inicial. .27 y 4.24. concluyendo que es un valor satisfactorio pero muy bajos probablemente por la cepa de Saccharomyces usada.

AGRADECIMIENTOS A la Ms.C. Se obtuvo un incremento del porcentaje alcohólico de 3. 2. en condiciones de laboratorio.Por las razones mencionadas anteriormente no se le añadió sulfato de amonio al medio Caldo Melaza debido a que la fuente de nitrógeno exógeno no ejerce efecto en cuanto al aumento de la producción de alcohol. .7305mg de caseína a 37ºC por 30 minutos.47% v/v con un porcentaje de adición complejo enzimático de 4% valor estadísticamente significativo pero bajo debido a que la cepa de Saccharomyces usada no es una cepa mejorada. Julio Arrellano Barragán. Sin embargo si hay diferencia significativa entre estas concentraciones y el control. 3. Otiniano García. CONCLUSIONES 1. se observó que no hay diferencia significativa entre estas concentraciones. El complejo enzimático producido por Aspergillus oryzae. Al comparar estadísticamente el porcentaje de alcohol con los tratamientos de 2. por su asesoramiento.73 % a 4.4 y 6% de concentración del complejo enzimático. tiene efecto sobre la producción de alcohol etílico por Saccharomyces cerevisiae aumentando la producción de etanol. a una concentración de 676.3% proteínas) para el metabolismo celular a estas concentraciones18.42 UA/dL (unidades aminolíticas) y proteasas con una actividad de hidrolizar 2. por ayudarme a resolver algunas inquietudes que se han estado presentando durante el desarrollo de la tesis. Nélida Milly E.24. constante apoyo y sus acertados consejos sin los cuales no hubiera sido posible la realización de la presente tesis. Esto evidencia que la melaza utilizada contiene la suficiente cantidad de nitrógeno alfa amino (6. Al Ms C.

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