Chapitre 2 : Matériels et méthodes

Chapitre II: Matériels et Méthodes

I- Matériels 
I-1 Epices:

Les épices ont été achetées chez un épicier à Sfax. Ces produits sont : le Curcuma, le Carvi, la
coriandre, le poivre noir, le gingembre, la noix de muscade, la cannelle, la réglisse, le fenouil,
l’anis étoilé, le cubèbe, le clou de girofle, la cardamome, la nigelle, le genévrier.

I-2 Solvants 

Eau distillée, Eau bidistillée, Acétone, Ethanol absolu 96%, Ether diétylique, DMSO

I-3 Réactifs 

DPPH (2,2-diphényl 1-picrylhydrazyle), BHT (butylhydroxytoluéne), Vitamine E, Na2SO4

(sulfate de soduim), DNTP (Reactif d’ Ellman), DNS (dinitrosalicylique), MTT (bromure de
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium), Tris-Hcl ( le
trishydroxymethylaminométhane), Phénol cristallin, Tartrate de sodium, Sulfite de sodium,
Soude de 1% (eau/volume).

I-4 Souches

Gram-positif : Bacillus cereus (ATCC 14579),Bacillus subtilis (ATCC ), Brevibacterium

flavum, Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Enterococcus faeccium (ATCC 29212),

Staphyloccocus xylosus, Staphyloccocus epidermidis, Micrococcus luteus (ATCC 4698),

Gram-négatif: Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883), Escherichia coli (ATCC 25922),
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), salmonella (ATCC), Enterobacter cloacae .

Fatma kaaniche Page 28

 Chapitre 2 : Matériels et méthodes

I-5 Enzymes et substrats

L’α-amylase, L’acétylcholinestérase (isolé d’Electrophorus electricus, Sigma, C2888, Type

V-S), maltose, ATCI (Acetylthiocholine iodide).

I-6 Appareillage 

Ampoule à décanter, évaporateur rotatif (Buchi), fiole jaugée, spectrophotomètre à longueur

d’ondes variables (shimadzu UV-1240(japon), balance de précision, Evaporateur rotatif
(Buchi Rotavapor R) hotte, auto-clave, CPG : Hewlett Packard 6890 SM : Hewlett Packard
5973), lecture ELISA.

II- Méthodes
II-1 Extraction de l’huile essentielle par Hydrodistillation

Parmi les différents procédés d’extraction d’HE nous avons choisi l’hydrodistillation : il s’agit
de la technique la plus simple et la plus pratique. Pour cela on utilise le montage qui est
constitué par une cocotte, un réfrigérant et une bouteille pour récupérer l’hydrolat.
On place le matériel végétal et l’eau dans une cocotte placée sur une plaque chauffante. Le
chauffage est ensuite maintenu pendant 6 heures, au cours desquelles la vapeur formée va
entraîner avec elle l’huile essentielle volatile qui sera ensuite condensée par le réfrigérant et
récupérée dans la bouteille. Dans chaque fois on prend seulement les 700 premiers millilitres
d’hydrolat (tête de distillation) qui sont riches en HE. Par suite , on utilise le procédé
d’extraction liquide-liquide par un solvant volatil tel que l’éther (Et 2O). La phase organique
obtenue est déshydratée par le sulfate de sodium (Na2SO4), puis évaporée sous pression
réduite pour donner les huiles essentielles.

II-2 Chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse

(CPG-SM)

Fatma kaaniche Page 29

 Chapitre 2 : Matériels et méthodes

Le système CPG-SM est de type « Hewlett-Packard model 5872 ». La colonne utilisée est
une colonne capillaire  « HP5MS » de longueur 30 m et de diamètre intérieur égal à 0,25mm.
Les températures de l’injecteur, de l’interface et de la source sont égales à 260°C, 280°C et
175°C respectivement. Le gaz vecteur est l’hélium utilisé avec un débit égale à 1,7 ml/min.
L’énergie d’ionisation est de 50 eV et le balayage de masse s’étend entre 50 et 600 uma à
raison de deux scannes/ms. La température de la colonne augmente de 100°C jusqu'à 260 °C
pendant 10 minutes.

II-3 Activité antioxydante

a) Principe

C’est une méthode colorimétrique assez simple qui a été adoptée en vue d’évaluer le pouvoir
anti-radicalaire d’un extrait ou d’une substance pure. Son principe est basé sur la décoloration
du radical DPPH (2,2-diphényl 1-picrylhydrazyle). Ce radical libre, stable à la température
ordinaire, présente une intense coloration violette qui disparaît lors de la saturation des
couches électroniques, c'est-à-dire lors du passage à une forme non radicalaire.
La diminution de la coloration est contrôlée par spectrophotométrie à une longueur d’onde λ=
517 nm et rend compte du pouvoir piégeur des radicaux libres de la substance ajoutée.
L’activité anti-radicalaire ou antioxydante est exprimée en concentration efficace à 50%
(CE50) qui est la concentration de l’échantillon étudié (mg/ml) pour laquelle la diminution de
l’absorbance atteint 50% de l’absorbance du blanc (solution dépourvue de l’échantillon à
analyser). Elle est déterminée à partir de la courbe donnant la variation du pourcentage
d’inhibition (PI) en fonction de la concentration de l’échantillon à analyser.
A partir de cette courbe, on détermine la concentration efficace CE50 (relatives à PI=50%)
qui sera comparée avec celle de la référence utilisée.
Notons, que pour tous les tests effectués, chaque point porté sur la courbe PI= f(C) représente
la moyenne de deux mesures :
PI%= [1-(Ateste /A contrôle)]x 100
A teste : Absorbance avec produit à tester
A contrôle : Absorbance sans produit à tester

Antioxydant de référence : L’antioxydant de référence utilisé est le BHT et la vitamine E (α-

tocophérol). Sa concentration efficace (CE50) sera comparée avec celles des autres

Fatma kaaniche Page 30

 Chapitre 2 : Matériels et méthodes

échantillons. Cette comparaison nous renseigne sur le pouvoir antioxydant de chaque

échantillon analysé.

b) Mode opératoire

On pèse 2 mg de DPPH dans une fiole jaugée de 50 ml et on complète jusqu’au trait de jauge
avec de l’Ethanol. Cette solution protégée de l’air, de la lumière et de la chaleur, doit être
utilisée dans les minutes qui suivent. Pour chaque échantillon à tester, nous avons préparé
plusieurs solutions à différentes concentrations comme suit :
Dans des flacons protégés de la lumière, on met 1 ml de la solution de DPPH préparée ci-
dessus (C=10-4 mol /l) et 1 ml de la solution à analyser. Après agitation, les mélanges sont
gardés pendant 30 minutes à l’obscurité. La densité optique à 517 nm des différentes solutions
est par la suite mesurée. L’essai à blanc, constitué de 1ml de la solution de DPPH et 1 ml de
méthanol, est gardé à l’abri de la lumière pendant 30 min.

II-4 Activité antimicrobienne

a) Détermination des diamètres des zones d’inhibitions

L’étude de l’activité antimicrobienne est réalisée par la méthode de diffusion sur milieu
gélosé (tagg et McGiven, 1971). Des boites de pétri contenant 20 ml de milieu gélosé muller-
hinton, sont inoculées par 200 µl d’une suspension bactérienne à 107 CFU/ml en phase
exponentielle de croissance. Ensuite, des puits sont creusés à l’aide d’une pipette pasteur
stérile et sont remplis par 10µl d’huile essentielle à tester. Les boites ainsi préparées sont
incubées à +4°C pendant 3h à 4h pour permettre la diffusion de la substance active présente
dans le puits (Gulhan et al.,2003). Enfin, les boîtes sont incubées à l’étuve à 37°C ou 30°C
pendant 24h ou 48h selon le microorganisme testé. Une zone d’inhibition est obtenue autour
des puits pour les extraits actifs. L’ampicilline à 10µg/puits est utilisée comme antibiotique de
référence.

b) Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) et concentration

minimale bactéricide (CMB)

La CMI est déterminée sur une plaque de 96 puits en utilisant une gamme de concentration en
extraits allant de 10 mg/ml à 19,5 µg/ml préparée en cascade. L’inoculum bactérien est ajouté

Fatma kaaniche Page 31

 Chapitre 2 : Matériels et méthodes

à 107 CFU/ml dans chaque puit. Les plaques sont incubées par la suite à 37°C ou 30°C sous
agitation pendant 24 h ou 48 h suivant le microorganisme ciblé.
La CMI est définie comme étant la plus faible concentration de l’extrait capable d’inhiber
toute croissance bactérienne visible à l’œil nu. Pour faciliter sa lecture, 20µl MTT (0.5
mg/ml) sont ajoutés dans chaque puits, un virage de la couleur vers le bleu indique une
croissance bactérienne. La CMB correspond à la plus faible concentration de l’extrait capable
de tuer 99,9 % de bactéries contenues dans l’inoculum de départ. A partir de chaque puits ne
montrant pas de croissance visible, 10 µl du mélange germe-extrait sont prélevés et
ensemencés à l’aide d’une anse sur des boîtes contenant le milieu LB (Ndi et al., 2007).

II-5 Activité antidiabétique

a) Principe

L’activité antidiabétique est déterminée en évaluant le pouvoir inhibiteur de l’échantillon

étudié vis-à-vis de l’alpha amylase. L'analyse des inhibiteurs de l'alpha amylase est effectuée
par la quantification du sucre réducteur libre dans le milieu (maltose). L'activité inhibitrice de
l'enzyme est exprimée par la diminution des unités du maltose libre dans le milieu réactionnel.
La méthode suivie est basée sur le dinitrosalicylique DNS qui forme un complexe avec le
maltose donnant une coloration rouge dont l'absorbance est mesurée à 530 nm.

b) Mode opératoire

A partir d'une solution mère aqueuse de maltose de concentration molaire 0.03 mo1/1, des
solutions sont ainsi préparées de concentration allant de 0.0005 mo1/1 jusqu'a 0.002 mo1/1.
Dans un tube, on introduit 2 ml de la solution de maltose puis on ajoute 1 ml du réactif DNS
(1 g de DNS, 200 mg de phénol cristallin, 20 g de double tartrate de sodium, et 50 mg sulfite
de sodium dissous dans la soude de 1% [eau/volume]) qui est chauffé a 100 °C pendant 5 min.
Après refroidissement, le mélange est complété à 10 ml avec de l’eau distillée. La lecture de
l'absorbance de chaque solution est effectuée a l'aide d'un spectrophotomètre à une longueur
d'onde de 530 nm contre un blanc (même solution sans la solution de maltose) ce qui nous
permet de tracer la courbe d'étalonnage.

Fatma kaaniche Page 32

 Chapitre 2 : Matériels et méthodes

L’activité de l’alpha amylase est évaluée en utilisant l’amidon comme substrat qui en
s’hydrolysant libère le maltose. Pour ce faire, on répète le même protocole détaillé ci-dessus
mais en remplaçant le maltose par l’amidon. L’activité antidiabétique a été comparée à celle
d’un médicament : « l’Acarbose » de CE50 égale à 0.15 mg/ml.

II-6 Activité anti-acétylcholinestérase

a) Evaluation de l’inhibition de l’acétylcholinestérase

Les essaie de l’évaluation de l’inhibition de l’acétylcholinestérase ont éte mis au point selon
la méthode de Falé et all 2009. Les réaction ont été faites dans des microplaques à 96 puits
(Evergree scientific), remplis avec 142 µl de réactif d’Ellman (DTNB à 3mM dans le tompon
tris-Hcl à 50 mM à pH 8), 23 µl de solution d’ATCI (0.23mg/ml) , 30 µl de solution
contenant le composé à étudier dans le DMSO et 100 µl tompon (Tris-Hcl à 50 mM à pH 8).
La réaction enzymatique a été initiée par ajout de 5 µl d’une solution d’AChE (Concentration
finale 0.05U /ml) dans du tampon phosphate 50 mM à pH 8. Les microplaques ont été agitées
durant 3 minutes en utilisant un lecteur de microplaques PowerWaveX (Bio Tek instrument ).

PI%= [1-(DOtest/ DO contrôle )]x 100

DO teste : Densité optique avec produit à tester
DO contrôle : Densité optique sans produit à tester

Le témoin positif (tacrine) est utilisé pour évaluer le degré d’inhibition de

l’acétylcholinestérase. Les différentes concentrations réalisées permettent de déterminer les
IC50 des extraits de chaque huile essentielle.

Fatma kaaniche Page 33