PRACTICA Nº 4

OXIDACION DE ACIDOS GRASOS Y FORMACION DE CUERPOS CETONICOS

INTRODUCCION:

Como se sabe, la oxidación de los ácidos grasos comprende una serie de reacciones enzimáticas
que al final conducen a la formación de Acetil CoA y un acil CoA de 2 átomos de carbono menos;
este último compuesto reingresa al ciclo, de tal manera que el ácido graso queda convertido
finalmente en varios Acetil CoA dependiendo del número de carbonos del ácido graso. Así por
ejemplo, para el caso del ácido palmítico, oxidación dará lugar a 8 Acetil CoA y tratándose del
ácido butírico originará 2 Acetil CoA. Las moléculas de Acetil CoA serán ampliamente utilizadas
por el organismo y así de primera importancia es el empleo en la producción de energía, al unirse
al oxalacetato y seguir las reacciones del ciclo de Krebs; interviene también en la síntesis de ácidos
grasos, síntesis de colesterol, en procesos de acetilación. Aquí estudiaremos también de forma
particular el rol del acetil CoA en la formación de cuerpos cetónicos, lo que ocurre especialmente
en el hígado. Se conocen bajo la nominación de cuerpos cetónicos a los ácidos: Aceto acético, beta
hidroxibutírico y a la acetona.

En esta práctica se utilizará un homogenizado de hígado como fuente de enzimas para la oxidación
del butirato y la formación de cuerpos cetónicos. Se empleará para este efecto, el aparato
manométrico de Warburg para medir el consumo de oxígeno.

OBJETIVOS:

1. Estudiar la oxidación del ácido butírico a través del consumo de oxígeno utilizando un
homogenizado de hígado como fuente enzimática.
2. Demostrar la necesidad del NAD, iones magnesio y ATP en la oxidación de los ácidos grasos.
3. Determinar cualitativamente la formación de cuerpos cetónicos en los diferentes sistemas de
estudio.
4. Interpretar los resultados sobre el consumo de oxígeno y formación de cuerpos cetónicos.
 Ácido Graso de “n” átomos de carbono
H3C – (CH2) n – COOH
ATP
ACTIVACION DE HSCoA
ACIDOS GRASOS AMP + PPi

Acil CoA H3C – (CH2) n – CO CoA

FAD
β − OXIDACION FADH2
DE ÁCIDOS GRASOS
Trans – Enoil CoA

Acil CoA
L - β OH Acil CoA
Acetil CoA NAD
NADH2
HSCoA β Ceto Acil CoA

HSCoA etc.
Citrato Sinteasa

Acido. Oxalacético Acido. Cítrico

H2O
NADH2
Deshidrogenasa Aconitasa H2O
+ Málica
NAD
Acido Isocítrico
Acido Málico CICLO Isocitrato NAD+
Deshidrogenasa
Fumarasa DE
H 2O KREBS CO2 NADH2
Acido Fumárico Acido α - cetoglutarato
ADP + Pi ATP
FADH2 Succinato
HSCoA NAD+ Complejo
Deshidrogenasa α - ceto Glutarato
CO2 Deshidrogenasa
FAD NADH2
Acido Succínico GTP GDP + Pi Succinil - SCoA

Succinil CoA
Sinteasa
HSCoA

ATP ATP ATP

NAD FMN Coenzima Q Cit. b Cit. c1 Cit. c Cit (a + a3) 1/2 O2--

2H+ H2O
TRANSPORTE DE ELECTRONES EN LA CADENA RESPIRATORIA MITOCONDRIAL

FIGURA Nº 4 .- Oxidación Completa de un ácido graso

Procedimiento:
Preparar 4 frascos de Warburg en la siguiente forma
1. Colocar 0.4 ml de KOH 20% en la copa central de cada frasco y un pedazo apropiado de papel
filtro plegado en “acordeón”, y luego en el compartimiento principal de cada frasco medir lo
siguiente:
1 2 3 4
ATP 0.01M 0.4 ml. 0.4 ml. ------- 0.4 ml.
Mg SO4 0.02 M 0.3 ml. 0.3 ml. 0.3 ml. 0.3 ml.
NAD · 0.1 ml. 0.1 ml. 0.1 ml. -------
Sustrato ·· ------- 0.6 ml. 0.6 ml. 0.6 ml.
Buffer Fosfato 0.1 M; pH 7.4 0.5 ml. 0.5 ml 0.5 ml. 0.5 ml.
Agua destilada 0.7 ml. 0.1 ml. 0.5 ml. 0.2 ml.
Enzimas ··· 2.0 ml. 2.0 ml. 2.0 ml. 2.0 ml.
· NAD 3.0 mg y 43 mg de nicotinamida.
.. Sustrato (5 volúmenes de butirato de sodio 0.1 M y 1 volumen de Fumarato de sodio 0.01 M.
... Enzimas: Homogenizado de hígado de rata en ayunas con 9 volúmenes de sacarosa 0.25 M en buffer
Tris 0.02 M (pH 7.4).

2. Preparar, además un frasco termobarómetro conteniendo 4 ml. de agua destilada para

compensar los cambios de presión y temperatura durante el experimento.
3. Colocar cada frasco en su correspondiente manómetro; sin cerrar la llave de los manómetros,
equilibrar durante 10 minutos a 37 ºC en el aparato de Warburg con agitación constante.
Después de esta fase inicial, cerrar la llave de los manómetros y proceder a la lectura basal.
(Cuadro de Resultados).
4. Continuar las lecturas cada 10 minutos, haciendo las correcciones necesarias de acuerdo a los
cambios observados en el termobarómetro. (Cuadro de Resultados)
5. Al final del experimento, calcular el consumo de oxígeno total de cada frasco y trasvasar el
contenido de cada compartimiento principal de los frascos a tubos de ensayo enumerados en
forma similar.

Identificación de cuerpos cetónicos:

1. Saturar el contenido de cada frasco con sulfato de amonio sólido y dejar en reposo durante 5
minutos. Filtrar después de decantar los cristales de la sal.
2. A un volumen igual de cada filtrado (por ejemplo 1.0 mL), agregar 3 gotas de NH4OH
concentrado y 2 gotas de nitroprusiato de sodio al 5 %. Agitar lateralmente y dejar ambos tubos
en reposo durante 5 minutos. La concentración relativa de cuerpos cetónicos (aceto acetato) en
cada tubo será apreciada por la presencia de un color violeta, cuya intensidad de color será
considerada de 0 a ++++.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
1.- Interprete y comente los resultados obtenidos en:
Sistema Nº 1:
Sistema Nº 2:
Sistema Nº 3:
Sistema Nº 4:

INTERROGANTES:
1. A través de un diagrama describa la beta oxidación del ácido butírico
2. ¿Cuál es la razón de que se use fumarato junto al sustrato butirato?
3. ¿De qué otros modos se podría evaluar la oxidación de los ácidos grasos?
4. Calcule cuantos ATPs netos se obtienen cuando el butirato se degrada completamente hasta
CO2 y H2O y calcule su eficiencia energética (%).
5. ¿Dónde ocurrirá la activación de este ácido graso? ¿Por qué?
6. ¿Hay necesidad de carnitina para la oxidación de butirato? ¿Por qué?
7. Explicar la relación existente entre consumo de oxígeno y oxidación de ácidos grasos.
8. ¿Un desacoplador de la fosforilación oxidativa tendría algún efecto sobre la oxidación de los
ácidos grasos en la presente práctica?
9. ¿Cuál es el fundamento de la determinación cualitativa de los cuerpos cetónicos?
10. Escriba la reacción de síntesis de cada uno de los cuerpos cetónicos
11. ¿Qué entiende por cetosis? ¿Cuáles son los llamados cuerpos cetónicos? ¿En qué condiciones
se acumulan en el organismo?
12. ¿Qué hormonas estimulan la capacidad de transformar la glucosa en ácidos grasos?
13. ¿Qué hormonas intervienen en la movilización de ácidos grasos desde los depósitos?
Cuadro de Resultados. Complete los datos del siguiente cuadro

TIEMPO
1 2 3 4
( Minutos) TB
KO2 = 0.98 KO2 = 1.12 KO2 = 0.95 KO2 = 0.94
0’ 180 298 300 295 280

10’ 182
260 231 270 258

20’ 181
229 175 250 230

30’ 179
220 114 233 221

40’ 181
197 42 215 208

50’ 180
168
298
----- 198 191
214

60’ 180
149 140 162 153

Consumo de
Oxígeno
en µl.

Cuerpos Cetónicos
+ +++ + ++++
 TALLER (4)

DEFICIENCIA DE CARNITINA

Caso Clínico.

T.S.L. es un niño de 3 años y medio de edad, nacido de un embarazo y parto normal y de padres
no consanguíneos. Un hermano mayor había muerto a los tres meses de edad por un “problema
hepático”, después de un cuadro comatoso que no pudo ser explicado.

Cuando nuestro paciente tenía 3 años estuvo en coma y fue hospitalizado haciendo un paro
cardiaco. Al examen clínico se encontró hepatomegalia y cardiomegalia y la concentración de
glucosa en sangre fue 15 mg% . Con el tratamiento que en aquel entonces se instauró el paciente
mejoró notablemente y hasta la hepatomegalia desapareció. Seis meses después el paciente fue
hospitalizado nuevamente por un cuadro similar y los exámenes de laboratorio mostraron una
glicemia de 17 mg% sin acidosis ni cetosis, con aumento en las actividades de las transaminasas
séricas (TGO y TGP) y una concentración de amonio sérico de 300 µg%. Su coeficiente intelectual
era de 66 (siendo 100 lo normal). El Paciente mostró además retardo en el crecimiento y debilidad
muscular.

La biopsia muscular practicada en la última hospitalización permitió demostrar una gran cantidad
de lípidos neutros e igualmente la biopsia hepática también mostró acumulación de grasa. No se
pudo encontrar cuerpos cetónicos pese a ser sometido a periodos de ayuno prolongado (32 horas).

Durante la última hospitalización se determinó la concentración de carnitina en diferentes tejidos

y líquidos biológicos, obteniéndose los siguientes resultados:
• Carnitina en músculo 0.19 nmoles/mg de proteína (V.N. 13.4 de promedio)
• Carnitina de hígado 0.37 nmolres/mg de proteína (V.N. 6.8 de promedio)
• Carnitina sérica 4.82 mmoles/L (V.N. 35.5 de promedio)
• Carnitina en orina: 47 mmoles en 24 hrs. (V.N. 231 de promedio)

Bases Moleculares y Correlato Clínico-Bioquímico

El alto rendimiento energético de los lípidos se explica por la oxidación de sus ácidos grasos
constituyentes, la misma que ocurre mayoritariamente en la vía de la beta oxidación que opera en
la matriz mitocondrial. Durante esta vía los ácidos grasos van liberando unidades de dos átomos
de carbono gajo la forma de acetil CoA . Este compuesto ingresa al Ciclo de Krebs en donde es
oxidado completamente hasta CO2 y H2O, posibilitando el funcionamiento de la cadena
respiratoria y liberando importantes cantidades de energía que en un porcentaje considerable se
logra almacenar bajo la forma de ATP.

Para que los ácidos grasos puedan ser oxidados por la vía señalada, deben ser previamente
activados, este proceso consiste en la unión del ácido graso a la coenzima A formando los
derivados Acil graso CoA. Esto se lleva acabo a nivel citosólico para ácidos grasos de cadena larga
(los de cadena corta y mediana se activan en la matriz mitocondrial) con la participación de
enzimas denominadas como Tioquinasas. Como la beta oxidación se procesa en la matriz
mitocondrial el ácido graso activado (acil CoA) debe atravesar las membranas mitocondriales,
particularmente la Membrana Mitocondrial Interna (MMI), que como se sabe es impermeable a
las moléculas polares, como lo son los Acil CoA por su componente Coenzima A. Esta dificultad
se supera con la participación de una proteína Translocasa que transporta los ácidos grasos de
cadena larga a través de la MMI, sólo que, para poder transportarlos, los ácidos grasos deben estar
unidos a la Carnitina.

La carnitina es un compuesto trimetilado (β hidroxi trimetilamino butirato) que es sintetizado a

partir del aminoácido esencial Lisina.

La falla del corazón y músculo esquelético en obtener carnitina en cantidades suficientes

determina cardiomiopatía y debilidad muscular respectivamente.

Para que el ácido graso pueda unirse a la carnitina re requiere la participación de una enzima
denominada Carnitina Acil Transferasa (CAT), que se presenta en dos formas isoenzimáticas, la I
y la II. La CAT I está localizada en el lado externo de la MMI y cataliza la unión del ácido graso
a la carnitina formando acil carnitina y liberando a la Coenzima A. La acil carnitina formada pasa
la MMI usando la acil carnitina translocasa. Luego que la acil carnitina atravesó la membrana
mitocondrial interna, interacciona con la CAT II que está en el lado interno de la MMI,
determinando que se reconstituya el acil CoA con la coenzima A de la matriz mitocondrial y se
libere la carnitina. De esta manera el ácido graso activado ya se encuentra en la matriz mitocondrial
y está listo para comenzar la vía de la β oxidación.
 H3C – (CH2) n – CO SCoA

CITOSOL
Membrana Mitocondrial Externa

H3C – (CH2)n – CO SCoA

Espacio
Intermembrana
CARNITINA

H3C – (CH2)n – CO CARNITINA

HSCoA
CarnitinaAcil
Cotransportador Transferasa I
Membrana
de Mitocondrial
Acil Carnitina Interna
CarnitinaAcil
Transferasa II
HSCoA
H3C – (CH2)n – CO CARNITINA
CARNITINA

H3C – (CH2) n – CO SCoA

Matriz
Mitocondrial Beta
Oxidación

FIGURA Nº 2.- Transporte de los AcilCoA de cadena larga a la mitocondria

Se ha descrito en humanos ciertas enfermedades que resultan de anormalidades en el ingreso de

los ácidos grasos de cadena larga a la matriz mitocondria a través de la membrana mitocondrial
interna. Estas alteraciones se presentan por deficiencia de carnitina o por una menor actividad de
acil carnitina transferasa.
Las manifestaciones clínicas de la deficiencia de carnitina son muy variadas y el síndrome de la
deficiencia de carnitina puede ser miopática, cuando la deficiencia está limitada al músculo, pero
si la deficiencia se establece en varios tejidos y en el plasma, se habla de una deficiencia sistémica.
En la Tabla siguiente se precisan algunas características importantes de los dos tipos de deficiencia
de carnitina.
 TABLA Nª2 Tipos de deficiencia de Carnitina

DEFICIENCIA MIOPATICA DEFICIENCIA SISTEMICA

1. Sólo están comprometidos los 1. Varios tejidos se ven comprometidos
músculos
2. Los niveles de carnitina sólo están 2. Los niveles de carnitina están
reducidos en el músculo disminuidos en varios tejidos
3. Los niveles plasmáticos de carnitina 3. Los niveles plasmáticos de carnitina
son frecuentemente normales están frecuentemente disminuidos
4. Hay aumento en la actividad de las 4. Hay aumento en la actividad de
enzimas séricas de origen muscular enzimas séricas de origen hepático y
muscular
5. Hay infiltración grasa en el músculo 5. Hay infiltración grasa en el hígado,
músculo y otro tejido
6. Hay capacidad de formar cuerpos 6. Hay incapacidad de formar cuerpos
cetónicos cetónicos.
7. Usualmente no se asocia a disfunción 7. Usualmente se acompaña de disfunción
hepática y del SNC hepática y del SNC.
8. Escasa respuesta a la administración 8. Frecuentemente hay buena respuesta a
de carnitina la administración de carnitina

BIBLIOGRAFIA
MOTGOMERY R., CONWAY T., SPECTOR A. and CHAPELL D. (1996). Biochemistry: A
case-oriented approach. VI Ed. Mosby
STANLEY C.A. (1992). A deficiency of carnitine-acylcarnitine translocase inthe inner
mitocondrial membrane. N. Eng. J. Med 327:19
M. PIERCE, G. PRIDJIAN, S. MORRISON, A. PICKOFF (1999). “Fatal
CarnitinePalmitoyltransferase II Deficiency in a Newborn: New Phenotypic Features”, Clinical
Pediatrics. Vol. 38 pp. 13-20.

INTERROGANTES.
1. Haga un listado de las determinaciones bioquímicas que se practicaron al paciente del caso
clínico y señale cuales está alterados.
2. ¿Cuál es su diagnóstico? ¿Qué tipo de deficiencia de carnitina tiene el paciente? Fundamente
su respuesta.
3. ¿Cómo se explica que el paciente no tenga la capacidad de formar cuerpos cetónicos, aun en
condición de ayuno prolongado?
4. Una niña de 13 años fue referida a un hospital universitario por presentar dolor muscular y
escasa tolerancia al ejercicio. Al examen clínico se demostró debilidad muscular en sus
extremidades y en el laboratorio se encontró aumento en la actividad CK y LDH séricas, con
niveles normales de cuerpos cetónicos en el suero. Se le practicó una prueba de ejercicio y tuvo
que ser suspendida a causa del severo dolor que mostró en brazos y piernas.
5. ¿Tiene esta paciente la misma enfermedad que el paciente del caso clínico? ¿Qué diferencias
se pueden anotar?
6. ¿Se comenta que los niños alimentados a base de proteínas de soya son más susceptibles de
hacer cuadros de deficiencia de carnitina? ¿Cómo se explica?
7. ¿Por qué se recomienda en el tratamiento de estos pacientes la administración de ácidos grasos
de cadena mediana? ¿Se puede administrar a estos pacientes carnitina por vía oral?