Metabolismos microbiano

Pruebas Bioquímicas
MSc Claudia Yaneth Diaz Carvajal
PRUEBAS BIOQUIMICAS
 La identificación de una especie
microbiana requiere de pruebas
bioquímicas .
 La pruebas bioquímicas
permiten conocer las actividades
metabólicas y enzimáticas de
los microorganismos
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
 Determinan la actividad de una vía metabólica, a partir de un sustrato que se
incorpora en el medio de cultivo y que la bacteria al desarrollarse, la
modifica o no.
 Se han desarrollado medios pueden ser adquiridos o elaborados
individualmente, así como, comercialmente se encuentran disponibles
paquetes más complejos para demostrar en forma clara una determinada
característica bioquímica (enzimática), o vía metabólica para la
caracterización bioquímica de microorganismos.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Identificar los productos finales de los procesos metabólicos
Se debe conocer:
 Cambios que se producen
 Reacciones químicas que ocurren
 Enzimas que intervienen
 Productos intermedios
 Secuencias de las reacciones bioquímicas
PRUEBA BIOQUÍMICA ÓPTIMA

 Uso de cultivos frescos de la bacteria (18-24h de incubación),

 Medio en el que el microorganismo se desarrolle de forma óptima y
teniendo en cuenta que, siempre que se prepare un nuevo lote de medio
de cultivo para una prueba, se debe llevar a cabo el control de calidad,
sembrando en dicho medio una aislamiento positivo y uno negativo, como
testigos de la reacción.
PRUEBAS BIOQUIMICAS
Las pruebas bioquímicas realizadas comúnmente, pueden ser agrupadas según la
naturaleza del ensayo, así:
 Enzimas vinculadas con la respiración: Oxidasa y catalasa.
 Descomposición de azúcares simples, ácidos orgánicos y otros.
 Requerimientos de oxígeno: OF (Oxidación-Fermentación), crecimiento en
caldo Tioglicolato.
 Producción de ácido, o ácido y gas: Fermentación de carbohidratos.
 Detección de enzimas y vías metabólicas:
 RM-VP (Rojo de Metilo - Voges Proskauer).
 Gluconato.
 O.N.P.G. (orto nitro ß-D-galactopiranósido).
 Esculina.
 Hipurato.
PRUEBAS BIOQUIMICAS
Fuente única de carbono
 Citrato.
 Malonato.
 Hipurato para coliformes
Utilización de compuestos nitrogenados
 Reducción de nitrato.
 Asimilación.
 Desnitrificación.
Descomposición de carbohidratos aminoácidos y otros.
 Indol (a partir de triptófano).
 H2S.
 Fenilalanina
 Descarboxilación de Lisina, Arginina, Ornitina, etc.
 Urea.
PRUEBAS BIOQUIMICAS
Ensayos combinados
 TSI (Triple Hierro tres Azúcares).
 LIA (Agar Lisina-Hierro).
 Bilis Esculina.
Detección de exoenzimas.
 Lecitinasa.
 Proteasas, coagulasa.
 Amilasas.
 Celulasas.
 Desoxirribonucleasa.
 Hemólisis.
PRUEBAS BIOQUIMICAS
Misceláneos
 KCN.
 Bilis.
 Producción de pigmentos.
Test de crecimiento o inhibición.
 Temperatura.
 NaCl.
 Antibióticos.
PRUEBA CATALASA
PRUEBA OXIDASA
PRUEBA COAGULASA
 Rojo Metilo
Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los
diferentes géneros de entero bacterias lo constituyen el tipo y la proporción de
productos de fermentación que se originan por la fermentación de la glucosa.
Se conocen 2 tipos generales:
 1- La fermentación ácido-mixta
 2-la fermentación del 2,3 butanodiol
 En la fermentación ácido mixta
se forman fundamentalmente láctico, acético y succínico, además de
etanol, H2 y CO2.
 En la vía del butanodiol
se forman cantidades menores de ácido (acetato y succinato) y los
principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2.
ROJO DE METILO
 El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo)
y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía
de fermentación ácido mixta
 Procedimiento: Inocular el caldo Rojo Metilo con un cultivo puro de no más
de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35°C durante 48
horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación agregar unas gotas
del reactivo de rojo de metilo. La prueba es positiva si se desarrolla de un
color rojo estable. Esto indica que la producción de ácido es suficiente
para producir el viraje del indicador y el microorganismo fermentó la
glucosa por la vía de ácido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el
rojo y el amarillo no es considerado como positivo. Resultados: (+)
Escherichia coli (-) Enterobacter aerogenes
Vogues Proskauer
 En la prueba de Voges-Proskauer se determina la vía de fermentación del
butanodiol descrita en la prueba de rojo de metilo.
 El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la
producción de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la
acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol
dando un color rojo-fucsia.
 Procedimiento: Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no más de 24
horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35°C durante 24 horas.
Luego de finalizado el tiempo de incubación transferir 1 ml del caldo RM/VP
a un tubo limpio y agregar 0,6 ml de alfa-naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40%
Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al oxígeno.
atmosférico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. El desarrollo de un
color rojo-fucsia luego de 15 minutos indica la presencia de diacetilo,
producto de oxidación de la acetoína y por lo tanto una prueba VP
positiva. Resultados: (+) Enterobacter aerogenes (-) Escherichia coli
INTERPRETACION
 Positivo: Rojo rosado en la superficie del medio (presencia de acetoína).
 Negativo: Amarillo. Puede formarse un color cobrizo pero aún así la reacción
es negativa.
PRUEBA DNASA
 La actividad desoxirribonucleasa (DNAsa), se ha demostrado
fundamentalmente en los géneros Staphylococcus y Serratia
 Consiste en la propiedad de degradar el ADN a fracciones de menor peso
molecular. Esta característica se ha utilizado para identificar las especies
de Serratia marcescens y Staphylococcus aureus.
 Los microorganismos DNAsa-positivos, degradan el DNA cuando son
incubados en un medio que lo contiene. Esto puede ser visualizado de
diferentes maneras, ya sea inundando las placas crecidas con HCl 0,1N y
observando halos transparentes alrededor del crecimiento del
microorganismo o incorporando al medio indicadores como azul de
toluidina o verde de metilo (que viran a rosado cuando la prueba es
positiva).
INTERPRETACIÓN
 colonias rodeadas por una zona clara: colonias rodeadas por una zona
clara donde el ADN ha sido despolimerizado e hidrolizado =donde el ADN
ha sido despolimerizado e hidrolizado = prueba (+). Sin cambios , prueba (-
).prueba (+). Sin cambios , prueba (-).
Hidrólisis de Almidón.
 Algunos microorganismos tienen la capacidad de utilizar como nutriente
una gran variedad de fuentes, incluido en estas el almidón. Dicha
molécula es de gran tamaño para poder ser ingresada a las células, por lo
cual la producción de enzimas se convierte en el medio de hidrolizarlo
para poder utilizarlo (convirtiéndolo en oligo y monosacáridos como
dextrinas y maltosa).
 Esta prueba in vitro permite detectar la presencia de la exoenzima α-
amilasa, la cual es principalmente es observada en bacterias del género
Bacillus spp.
PROCEDIMIENTO
 La prueba se realiza en medio agar Almidón (Extracto de carne 3g, almidón
soluble 10g, agar-agar 12g, agua destilada 1000mL); el medio se dispensa
en cajas Petri, se siembra por agotamiento con la bacteria y se incuba a la
temperatura óptima del microorganismo por 24 horas. Para el revelado de
la prueba, se adiciona en la superficie del agar una solución de Iodo-Ioduro
de Potasio (Lugol).
INTERPRETACION DE RESULTADOS
 La aparición de una coloración azul- violeta, indica una prueba negativa y
la aparición de halos de color café (color del Lugol), alrededor de las
colonias, es indicativo de una reacción positiva.
ACTIVIDAD COMPLEMENTARIA
 Investigue la reacción bioquímica que ocurre durante la degradación de
la urea, de producción de indol y de formación de butanodiol.
 Identifique las principales vías metabólicas de las Enterobacterias